Poměr volných lehkých řetězců u pacientů s chronickým selháním ledvin

Súhrn

Úvod a cíl studie: Pacienti s chronickým onemocněním ledvin (CKD) často vykazují zvýšenou koncentraci volných lehkých řetězců (FLC) v séru, provázenou změnami v zastoupení obou jejich forem, tj. kappa i lambda řetězců, a v jejich důsledku pak změnou jejich vzájemného poměru (FLC ratio). Cílem této studie bylo ověření referenčních mezí tohoto poměru u pacientů s chronickým selháním ledvin, přičemž ke stanovení koncentrací FLC kappa a FLC lambda byly použity diagnostické prostředky firmy Binding Site.

Typ studie: Metodická studie.

Název a sídlo pracoviště: Ústav laboratorní diagnostiky, Oddělení klinické biochemie, Fakultní nemocnice Ostrava.

Materiál a metody: Do studie bylo zařazeno 150 pacientů s CKD a 17 kontrol. U všech byla stanovena koncentrace kreatininu, FLC kappa, FLC lambda v séru a z výsledků měření pak byly vypočteny odhad glomerulární filtrace dle CKD EPI (GF) a FLC ratio. Podle vypočtené hodnoty GF byli pacienti s CKD, v souladu s klasifikací KDIGO, rozdělení do skupin G2 až G5. K vyloučení monoklonální povahy FLC byla použita standardní elektroforéza sérových proteinů, imunofixační elektroforéza a izoelektrická fokusace v agarózovém gelu s následným afinitním imunoblottingem s protilátkami proti volným lehkým řetězcům kappa a lambda (IEF/AIB). Ke statistickému zpracování dat byly použity software Excel, MedCalc a Project R.

Výsledky: S rostoucím stupněm CKD byly pozorovány statisticky významné rozdíly mezi koncentracemi FLC kappa, FLC lambda i FLC ratio v jednotlivých skupinách (P ≤ 0,0001). Tyto parametry také statisticky významně korelovaly s koncentrací kreatininu i s odhadem glomerulární filtrace dle CKD EPI (P < 0,0001). V souladu s pokynem CLSI EP28-A3C byly pro poměr FLC u pacientů s CKD určeny tyto referenční meze: dolní mez 1,01 a horní mez 3,65.

Závěr: Praktická aplikace referenčních mezí pro FLC ratio může zvýšit specificitu FLC testu pro detekci monoklonální produkce FLC u pacientů s CKD. Odhad mezí v této studii byl proveden s využitím diagnostických prostředků firmy Binding Site a nemusí být shodný v případě použití jiných diagnostik.

Klíčová slova:

volné lehké řetězce imunoglobulinů – imunoturbidimetrie – kreatinin – enzymatické stanovení – odhad glomerulární filtrace – referenční meze – CKD

Úvod

Lehké řetězce imunoglobulinů jsou za fyziologických okolností produkovány B buňkami v nadbytku oproti těžkým řetězcům. To má za následek uvolnění přibližně 500 mg nenavázaných lehkých řetězců (volné lehké řetězce - FLC) do oběhu [1]. Monomerní FLC kappa s přibližnou molekulovou hmotností (M. h.) 25000 a převážně dimerní FLC lambda s M. h. 50000 jsou filtrovány v glomerulu a následně reabsorbovány a metabolizovány v proximálním tubulu s biologickým poločasem 2 až 4, resp. 3 až 6 hodin [2-4]. Díky dvojnásobně vyšší molekulové hmotnosti FLC lambda oproti FLC kappa dochází ke zpomalení jejich renální clearance. Za fyziologických okolností je tedy sérová koncentrace FLC kappa nižší než FLC lambda, což má za následek, že medián jejich poměru (FLC ratio) se pohybuje okolo 0,58, jeho fyziologické rozmezí mezi 0,26 až 1,65 [2]. Zvýšená koncentrace jednoho typu FLC v séru je typickým nálezem u mnohočetného myelomu a dalších plasmocelulárních dyskrázií. Zvýšená koncentrace FLC v séru může souviset i s autoimunitními onemocněními, nebo s glomerulární hyperfiltrací či tubulární dysfunkcí ledvin [5].

U pacientů s CKD se při snižování glomerulární filtrace (GF) snižuje renální clearance, což má za následek zvýšenou koncentraci FLC v séru. Za těchto okolností je větší podíl FLC odstraňován pinocytózou buněk retikuloendoteliálního systému. Protože retikuloendoteliální clearance není ovlivněna molekulovou hmotností FLC, dochází se zhoršující se funkcí ledvin ke sblížení biologických poločasů obou FLC, tj. kappa i lambda [6]. V souladu se stadiem CKD se musí zvyšovat i FLC ratio [7-8].

Cílem této studie bylo stanovení polyklonálních FLC u pacientů s CKD a ověření referenčních mezí FLC ratio za použití diagnostických souprav firmy Binding Site.

Metodika

Do studie bylo zařazeno 150 pacientů s chronickým onemocněním ledvin. Všechny vzorky séra byly na počátku studie testovány na přítomnost monoklonálních imunoglobulinů. V případě průkazu paraproteinů byl pacient z dalšího hodnocení vyloučen (n = 9). Výsledky pacientů s chronickým onemocněním ledvin byly porovnávány s kontrolní skupinou pacientů (n = 17) bez známek renálního či hematologického onemocnění. Soubor s CKD tvořilo 44 žen s průměrným věkem 67,8 ± 17,1 let a 97 mužů s průměrným věkem 65,9 ± 18,1 let. Soubor kontrolních vzorků tvořilo 10 žen s průměrným věkem 65,0 ± 16,1 let a 7 mužů s průměrným věkem 60,5 ± 18,3 let. Ve všech vzorcích byla stanovena koncentrace kreatininu na analyzátoru AU 5800 (Creatinine enzymatic, REF OSR61204, Beckman Coulter, Inc.), byl vypočten odhad glomerulární filtrace dle CKD-EPI [9] a stanoveny koncentrace FLC kappa a FLC lambda na analyzátoru SPA PLUS (Freelite Kappa SPA PLUS kit, REF LK016.L.S; Freelite Lambda SPA PLUS kit, REF LK018.L.S, The Binding Site Ltd.), následně vypočten FLC ratio (FLC kappa / FLC lambda). K vyloučení monoklonální povahy FLC byla použita standardní elektroforéza sérových proteinů (Hydragel 30 Protein β1-β2, kat. č: S-4141, Hydrasys 2^SCAN Focusing, SEBIA) a imunofixační elektroforéza (Hydragel 4 IF , kat. č.: S-4804, Hydrasys 2^SCAN Focusing, SEBIA), doplněná o izoelektrickou fokusaci v agarózovém gelu s následným afinitním imunoblotingem s protilátkami proti volným lehkým řetězcům kappa a lambda (IEF/AIB, modifikovaná in-house metoda C. J. Sindica) [10].

V závislosti na vypočítané hodnotě odhadu GF (mL·s^-1·1,73 m^-2) byli pacienti s CKD rozděleni do pěti skupin odpovídajících klasifikaci KDIGO [11, 12]: G2: lehce snížená GF (1,0-1,49) - 4 pacienti; G3a: lehce až středně snížená GF (0,75 – 0,99) - 22 pacientů; G3b: středně až výrazně sníženou GF (0,5 – 0,74) - 35 pa-cientů; G4: výrazně snížená GF (0,25 – 0,49) - 56 pa-cientů; G5: selhání ledvin (GF < 0,25) - 24 pacientů.

Referenční intervaly byly odhadnuty v souladu s pokynem CLSI EP28-A3C [13 14]. Závislost na věku a pohlaví byla posuzována pomocí Wilcoxonova a Kruskal-Wallisova neparametrického testu. Ke statistickému zpracování dat byl použit software Microsoft Excel (MS Office, verze 2016), MedCalc (MedCalc Software Ltd, Belgium verze 18.10) a program R (verze 4.0.1).

Studii schválila Etická komise Fakultní nemocnice v Ostravě (referenční číslo 13/2018).

Výsledky

Základní charakteristika studovaného souboru je uvedena v Tabulce 1. Medián koncentrace kreatininu v séru byl v souboru pacientských vzorků s CKD 191 µmol.L^-1, medián GF 0,44 mL·s^-1·1,73 m^-2, medián FLC kappa 56,32 mg.L^-1, medián FLC lambda 32,97 mg.L^-1 a medián FLC ratio 1,80, v případě kontrolních vzorků byl medián FLC kappa 12.63 mg.L^-1, FLC lambda 12,47 mg.L^-1 a FLC ratio 0,97.

Koncentrace FLC kappa byly významně vyšší u pacientů s CKD v kategorii G4 a G5 oproti kontrolní skupině; FLC kappa 71,43 (15,83 až 245,74) mg.L^-1, resp. 119,355 (33,44 až 241,80) mg.L^-1 versus 12,63 (9,06 až 21,47) mg.L^-1 a FLC lambda 38,43 (12,81 až 135,96) mg.L^-1, resp. 60,36 (16,34 až 338,69) mg.L^-1 versus 12,47 (7,42 až 37,67), P < 0,0001). Kromě toho koncentrace FLC kappa i FLC lambda postupně rostly se stupněm CKD (P < 0,0001; obr. 1A - 1B). Současně s rostoucím stupněm CKD, resp. klesající hodnotou GF byl pozorován statisticky významný rozdíl i mezi FLC ratio v jednotlivých skupinách, (P ≤ 0,0001); obr. 1C.

Koncentrace FLC kappa, FLC lambda i FLC ratio statisticky významně korelovala s koncentrací kreatininu i odhadem glomerulární filtrace z kreatininu dle CKD EPI (P < 0,0001); Tabulka 2.

Koncentrace FLC kappa a FLC lambda a FLC ratio vykazovaly statisticky významnou šikmost a špičatost, Tabulka 3.

Současně koncentrace FLC kappa, FLC lambda ani hodnoty FLC ratio nevykazovaly statisticky významnou závislost na věku (P > 0,05; Tabulka 4) a pohlaví (P > 0,052). Distribuci hodnot FLC kappa, FLC lambda a FLC ratio zachycuje obr. 2. Odhadnuté hodnoty referenčních mezí FLC ratio u pacientů s CKD byly pro dolní mez 1,01 a pro horní mez 3,65 podrobně viz Tabulka 5.

Diskuse

Stanovení FLC a jejich poměrů je velmi důležitým krokem v rámci diferenciální diagnostiky monoklonálních gamapatií [15] a nález jejich patologických hodnot vede k vyslovení podezření na přítomnost těchto nemocí a často k indikaci biopsie kostní dřeně k definitivnímu vyloučení nebo potvrzení suspektní nemoci [16]. Naším cílem proto bylo ověření referenčních mezí FLC ratio u pacientů s různým stupněm chronického selhání ledvin. Bohužel ale, vzhledem k problémům vyplývajícím z absence primárního standardu pro stanovení FLC v séru [17], užívání různých diagnostických souprav s rozdílnou standardizací a rozdílnými protilátkami, [18] je úroveň harmonizace těchto vyšetření problematická [19]. Aplikace odhadnutých referenčních mezí je tak vhodná pouze při použití diagnostických souprav firmy Binding Site.

Při studiu závislosti referenčních mezí na věku a pohlaví nebyla prokázána statistická významnost, proto jsou prezentovány parametry bez tohoto zohlednění. Současně počty pacientů v jednotlivých skupinách byly relativně malé, a proto jsou prezentovány referenční meze jen pro celou skupinu pacientů s CKD, což je pro potřebný účel dostačující. 

Poprvé se vylučováním polyklonálních FLC v závislosti na funkci ledvin zabývali ve své práci Nowrousian MR et al. [20], a to u skupiny pacientů s Bence-Jonesovou (BJ) proteinurií. Prokázali, že množství vylučovaných polyklonálních FLC se statisticky významně mění v závislosti na koncentraci kreatininu v séru, současně, že množství vylučovaných polyklonálních FLC je vyšší u pacientů s detekovatelnou BJ proteinurií v důsledku současně zvyšujícího se vylučování tubulárních proteinů v moči.  Tento trend pozorovali nejen u koncentrací kreatininu zvýšených nad referenční rozmezí, ale také v něm, což naznačovalo, že zvýšené koncentrace kreatininu v séru jsou pozdními ukazateli zhoršené funkce ledvin.

Také Hutchison CA et al. [7] popisují změny v množství vylučovaných polyklonálních FLC v závislosti na koncentraci kreatininu v séru. U 334 pacientů s CKD různé etiologie a bez přítomného monoklonálního proteinu stanovili koncentraci kreatininu, cystatinu C a odhad glomerulární filtrace vypočetli podle rovnice Cockrofta - Gaulta. Došli k závěru, že koncentrace FLC kappa i lambda v séru se postupně zvyšují se stupněm CKD a silně korelují s markery renálních funkcí, včetně cystatinu C. Současně prokázali, že koncentrace FLC v séru se liší mezi různými renálními patologiemi, u pacientů dialyzovaných vs. predialyzovaných, nebo u pacientů s diabetem, kde byly koncentrace FLC mnohem vyšší než u pacientů s jinými diagnózami. Nález vysvětlují chronickým zánětem, který je sám o sobě spojen se zvýšenou produkcí polyklonálních FLC. Stejně tak i FLC ratio se zvyšoval se stádiem CKD, jimi stanovené tzv. „renální“ referenční rozmezí se pohybovalo mezi 0,37 až 3,1.

Tyto hodnoty jsou velmi blízké námi odhadnutým referenčním mezím FLC ratio. Ke stanovení FLC jsme podobně jako Rindlisbacher et al. [21] použili diagnostické soupravy Freelite firmy The Binding Site. Tato skupina autorů porovnávala výsledky FLC Freelite s výsledky získanými diagnostickými soupravami N Latex firmy Siemens. Srovnání prováděli jak u kontrolní skupiny, tak i u pacientů v různých stádiích renálního onemocnění. Došli k závěru, že mezi těmito soupravami existují statisticky významné rozdíly, které vyplývají z jejich různé reaktivity vůči monomerním a dimerním FLC. Souprava Freelite  totiž detekuje pouze dimerní FLC lambda, zatímco souprava N Latex pouze monomerní FLC lambda. Vzhledem k jejich rozdílné reaktivitě proti FLC monomerům a dimerům jsou z hlediska poskytovaných výsledků obě soupravy nesrovnatelné [22]. Současně u skupiny pacientů s CKD pozorovali posun mediánu FLC ratio o + 0,4 až + 0,7 k vyšším hodnotám oproti publikovaným datům autorského kolektivu Hutchison CA et al. [7]. Obdobné závěry vyplývají i z naší studie, v níž jsme pozorovali posun o + 0,2 až + 0,9. Současně Tate et al. [23] vyslovili podezření, že pacienti s konečným stádiem onemocnění ledvin mohou mít vyšší podíl monomerních FLC lambda. Toto tvrzení by bylo možné ověřit studiem monomerních, resp. dimerních forem FLC SDS elektroforézou, jak bylo popsáno ve studiích autorů Kaplan et al. [24-26].

Závěr

V této studii byly měřeny vzorky séra pacientů v různých stádiích chronického onemocnění ledvin dle CKD klasifikace. Abnormální poměr FLC vzhledem k běžně používaným referenčním mezím byl pozorován u 64 % testovaných vzorků, u kterých byla vyloučena přítomnost monoklonální gamapatie. Bylo zjištěno, že průměrné koncentrace FLC v séru statisticky významně korelují s hladinou kreatininu a odhadem glomerulární filtrace dle CKD-EPI. Byly odhadnuty referenční meze pro FLC ratio u pacientů s CKD (dolní mez 1,01 a horní mez 3,65). U pacientů se sníženou renální clearancí pod 1,5 mL·s^-1·1,73 m^-2, patologickým FLC ratio do 3,65 a negativní imunofixací lze pouze na základě těchto nálezů vyloučit potřebu provedení biopsie kostní dřeně.

Studii podpořila Ostravská univerzita, Lékařská fakulta, Česká republika (číslo projektu SGS06 / LF / 2018-2019).

Střet zájmů: Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.

Do redakce došlo 6. 5. 2020

Adresa pro korespondenci:

RNDr. Pavlína Kušnierová, Ph.D.

Oddělení klinické biochemie, Ústav laboratorní diagnostiky

Fakultní nemocnice Ostrava

17. listopadu 1790/5, 708 52 Ostrava-Poruba

e-mail: pavlina.kusnierova@fno.cz