Angiogeneze jako součást nádorového „ekosystému“ a možnosti jejího ovlivnění

Súhrn

Angiogeneze je komplexní proces, který má zásadní význam pro růst nádoru, invazivitu a metastazování. V posledních deseti letech byl připraven větší počet látek působících inhibici angiogeneze. V tomto sdělení jsou angiogenní inhibitory roztříděny podle cílového místa zásahu do procesu angiogeneze. Podrobně je popsána úloha VEGF a jeho receptorů, ale jsou uvedeny i další antiangiogenní strategie, jako je inhibice endoteliální proliferace, inhibice matrixmetaloproteáz nebo použití látek působících disrupci nádorových cév.

Klíčová slova:
vaskulogeneze –  angiogeneze –  lymfangiogeneze –  inhibitory angiogeneze –  antiangiogenní strategie

Úvod

Poznatky o významu nádorového mikroprostředí („ekosystému“) pro bio­logické chování nádoru (invazivita, angiogeneze, metastazování) vedly k zásadní proměně nazírání na povahu nádorového onemocnění od redukcionistického pohledu až k pohledu vysoce komplexnímu (obr. 1). Právě angiogeneze může být modelovým příkladem vzájemných interakcí nádorových buněk a nádorového mikroprostředí.

Mechanizmy vaskulogenze a angiogeneze

Nádor z počátku roste v poměrně hostilním prostředí kompaktní tkáňové architektury pod vlivem specifické směsi různých extracelulárních působků v silně hypoxickém a kyselém prostředí a pod imunologickým dozorem. V průběhu růstu nádor často kooptuje rozličné typy nemaligních buněk (fibroblasty, osteoblasty, osteoklasty, stromální buňky, makrofágy, endotelie, lymfocyty aj.), které pak namísto inhibice vytvářejí permisivní mikroprostředí pro přežití nebo pro další růst a šíření nádoru [1]. Je tedy zcela evidentní, že tyto nové poznatky nacházejí odezvu i v pokusech o nové přístupy v léčebných strategiích, které mohou být cíleny, kromě samotných nádorových buněk, také na nejvýznamnější faktory, jež se na invazivitě a šíření nádoru podílejí. Jedním z možných terapeutických cílů je i novotvorba cév – vaskulogeneze a angiogeneze.

Vaskulogeneze je proces vývoje cév z endoteliálních prekurzorů, nezávislý na preexistujících cévách, který se uplatňuje zejména při tvorbě primitivních embryo­nálních cév a nepochybně má svou roli i při novotvorbě cév nádoru. Jsou za ni odpovědné cirkulující endoteliální prekurzory, jejichž mobilizaci působí stejné faktory, jaké hrají klíčovou roli i v angiogenezi [2]. Angiogeneze, tj. neovaskularizace v širším slova smyslu, následuje vaskulogenezi [3]. Za fyziologických okolností se uplatňuje nejen při embryogenezi, ale též např. při hojení ran nebo ovulaci. Je regulována humorálními faktory angiogenními a antiangiogenními, které jsou za normálních okolností v rovnováze. Jejich přehled je uveden v tab. 1 a podrobněji jsou popsány níže.

Význam angiogeneze pro růst a šíření nádoru byl poznán již na sklonku minulého století. Ukázalo se, že nádor (metastáza) potřebuje ke svému růstu přísun živin a kyslíku. Pokud nádor nezíská schopnost novotvořit cévy, nemůže po dosažení určité velikosti cca 100 µm (což je difuzní limit pro kyslík) dále růst [4]. Dochází k deregulaci angiogenního procesu a k převaze angiogenních faktorů, jež vyústí v tzv. angiogenní přepnutí (angiogenní switch), a začnou se vytvářet nové cévy vyživující rostoucí nádor [5]. Impulzy pro výdej angiogenních faktorů jsou jednak epigenetické, jednak genetické, jak ukazuje obr. 2. Z epigenetických faktorů je nejvýznamnější hypoxie. Regulace výdeje VEGF v závislosti na tenzi kyslíku se zúčastní tumor supresorový gen VHL (von Hippel Lindau), který za normoxie potlačuje výdej VEGF degradací transkripčního faktoru HIF1alfa (hypoxia inducible factor alpha). Za hypoxie dochází naopak ke stabilizaci HIF1alfa a k jeho transportu do jádra, kde se váže na specifickou sekvenci HRE (hypoxia response element) a stimuluje transkripci a následnou expresi VEGF. Angiogeneze se pak uskutečňuje různými mechanizmy [6–7]. Nejvýznamnější je tzv. angiogeneze pučením („sprouting angiogenesis“), která probíhá v několika etapách označovaných jako angiogenní kaskáda (tab. 2).

Kromě toho může krev protékat avaskulárními kanály tvořenými nádorovými buňkami (vaskulogenní mimikry) nebo jsou stěny cévy částečně tvořeny nádorovými buňkami (tzv. mozaikové cévy), popřípadě roste nádor podél již vytvořených cév (tzv. koopce cév).

Zmíněné alternativy angiogeneze pučením jsou předmětem intezivního studia, neboť se těmto mechanizmům připisuje významný podíl na invazivitě a metastazování pokročilých nádorů. Vaskulogenní mimikry byly již počátkem minulého desetiletí popsány jako důležitý faktor progrese a metastazování vysoce agresivních forem maligního melanomu [8]. Vytváření mikrovaskulárních kanálů se děje bez účasti endoteliální proliferace a připisuje se plasticitě geneticky dysregulovaných nádorových buněk stimulovaných hypoxií [9]. To znamená, že standardní antiangiogenní léčba nemusí být za těchto okolností účinná. Podíl vaskulogenních mimikrů na agresivitě a šíření nádoru byl následně prokázán též u karcinomu ovaria, prostaty, inflamatorního karcinomu prsu a u sarkomů měkkých tkání. Terapeutické postupy k omezení vaskulogenních mimikrů se dosud hledají.

Novotvořené cévy jsou nevyzrálé, chaotické, strukturálně defektní, bez souvislé bazální membrány a téměř bez podpůrných stabilizačních buněk pericytů a hladkých svalových buněk. To vede k vysokému průniku plazmy do intersticia (leakage) a ke zvyšování intratumorózního tlaku. Důsledkem toho dochází ke špatnému průtoku krve nádorem, k hypoxickým nekrózám, a tím k další stimulaci angiogeneze. Významně klesá také průnik cytostatik do nádoru.

Angiogenní faktory

Nejvýznamnějším a nejprozkoumanějším angiogenním faktorem je VEGF (vascular endothelial growth factor), resp. rodina VEGF a jejich příslušných receptorů (obr. 3). Členové rodiny VEGF významným způsobem stimulují proliferaci, migraci a přežití aktivovaných endotelových buněk. Existuje šest variant VEGF (VEGF A E a PIGF (placenta induced growth factor), který je homologní s VEGF A. Faktory VEGF jsou dimerické glykoproteiny, které se za patologických okolností uvolňují především z nádorových buněk. VEGF A, VEGF B a VEGF E mají podobné bio­logické účinky. Stimulují proliferaci a migraci endotelií a zvyšují cévní permeabilitu. Naproti tomu VEGF C a VEGF D hrají významnou roli při stimulaci lymfangiogeneze. Jejich zvýšená exprese byla nalezena zejména u nádorů metastazujících lymfatickou cestou. Vazbou VEGF na VEGFR se spustí transdukční kaskáda, jejímž výsledkem je zvýšená proliferace endotelových buněk, stimulace jejich migrace a zvýšení permeability cév [10].

Receptory pro VEGF (VEGFR) mají intracytoplazmatickou tyrozinkinázovou aktivitu, která zprostředkovává přenos signálu do buňky. Existují tři receptory pro VEGF: VEGFR1/FLT1 (FMS like tyrosinkinasae 1), VEGFR 2/KDR/FLK1 (kinase domain receptor/fetal liver kinase 1) a VEFR3/FLT4 (FMS like tyrosinkinase 4). VEGFR1 a VEGFR2 indukují proliferaci a migraci endotelií, snižují jejich citlivost k apoptóze a zvyšují cévní permeabilitu. VEGFR2 je nejčastěji zvýšeně exprimovaným receptorem na nádorových endoteliích, a byl proto logicky jedním z prvních cílů antiangiogenní terapie. VEGFR3 je exprimován zejména na lymfatických cévách.

VEGF A je ligandem ještě pro neuropilinové receptory NP 1 (neuropilin 1). Mají roli koreceptorů pro VEGFR2 a jejich stimulace podporuje angiogenezi [11].

Mezi regulátory angiogeneze patří též angiopoetiny (angiopoetin 1-ANG1 a angiopoetin 2-ANG2), které mají pleiotropní a zdánlivě protichůdné účinky. Na rozdíl od VEGF nepůsobí mitogenně na endotelie, ale regulují především integritu endotelových buněk a pericytů (perivaskulárních buněk) a působí maturaci cév. ANG1 je produkován hlavně hladkými svalovými buňkami, destabilizuje endotelie a usnadňuje angiogenezi, kdežto ANG2 produkovaný endoteliemi je důležitý pro maturaci a remodelaci nově vzniklé cévy. Oba angiopoetiny se vážou na společný receptor označovaný jako TIE 2 [12–13]. Zvýšená exprese TIE 2 byla prokázána zejména na lymfatických cévách.

Kromě toho se na rozvoji angiogeneze mohou podílet i buňky mikroprostředí, které sekretují jednak různé angiogenní substance (VEGF, FGF2, IL 8) a jednak proteázy uvolňující z extracelulární matrix růstové faktory [14–15].

Antiangiogenní faktory

Antiangiogenní faktory lze dělit na štěpné produkty extracelulární matrix (ECM) a na „non ECM faktory“ vznikající štěpením proteinů mimo ECM. Trombospondin (TSP1) patří mezi nejdéle známé přirozené inhibitory angiogeneze [16]. Je to glykoprotein ECM s výrazně pleitropními účinky. Reguluje adhezi, proliferaci a přežití endotelových buněk a inhibuje růst a metastazování nádorů. Endostatin je štěpný fragment kolagenu XVIII. Podobné účinky mají štěpné produkty kolagenu IV tumstatin, kanstatin či arresten. Mezi „non ECM faktory“ patří angiostatin, štěpný produkt plazminogenu. Blokuje migraci a proliferaci endotelových buněk a vyvolává u nich apoptózu. Podobné účinky má i vazostatin. K sekretovaným antiangiogenním faktorům patří dále destičkový faktor 4 (PF4), interferony (IFN alfa a beta), ně­kte­ré interleukiny (IL 12, IL 18), TGFbeta a dále inhibitory proteáz TIMP (tissue inhibitor of matrixmetalloproteinase) a PAI (plasminogen activation inhibitor).

Kromě těchto „zevních“ inhibitorů existuje též vnitřní inhibitor vazohibin (VASH1), exprimovaný endoteliemi účinkem VEGF (VEGFR2) [17]. Mechanizmem zpětné vazby potlačuje VEGFR transkripci [18–19].

Léčebné strategie zaměřené na angiogenezi

K inhibici angiogeneze slouží různé způsoby. Je to použití přirozených antagonistů angiogeneze nebo blokáda angiogenních faktorů.

Použití přirozených antagonistů angiogeneze

Aplikace antiangiogenních faktorů se zatím v klinické praxi příliš neuplatňuje, i když pilotní studie s ně­kte­rými antiangiogenními faktory přinášely slibné výsledky. Nejvíce klinických studií bylo věnováno přípravku ABT 510, což je substituovaný nonapeptid s vlastnostmi přirozeného trombospondinu 1. Blokuje odpověď na angiogenní podněty a podporuje apoptózu endotelií [20]. V experimentu byla prokázána jeho schopnost potlačit růst transplantovaných nádorů, ale v klinické praxi se jeho použití nerozšířilo. Rovněž rekombinantně připravený angiostatin a endostatin nenašly praktické uplatnění. Rekombinantně připravený destičkový faktor 4 (rhPF4) se zkoušel u Kaposiho sarkomu a u maligního melanomu, ale výsledky nebyly jednoznačně pozitivní.

Nejvíce prověřená je blokáda angiogenní kaskády, zaměřená především na inhibici signální dráhy VEGF VEGFR, inhibici endoteliální proliferace a stabilizaci bazální membrány.

Inhibice signální dráhy VEGF VEGFR

Angiogenní účinek VEGF lze blokovat na několika úrovních (obr. 4). Blokádou ligandu, blokádou vazebné domény receptoru nebo blokádou tyrozinkinázové domény receptoru. Nejvíce zkušeností je zatím s neutralizací ligandu VEGF humanizovanou monoklonální protilátkou bevacizumabem (Avastin). Bevacizumab váže volný VEGF A, VEGF B i VEGF C, a účinně tak blokuje novotvorbu cév [21]. Používá se výhradně v kombinaci s chemoterapií. Další možností je eliminace VEGF ligandu použitím solubilního „decoy“ VEGF receptoru (decoy = návnada, vějička) s názvem VEGF trap (aflibercept), který působí jako kompetitivní inhibitor VEGF receptorů [22]. Jinou, dosud v praxi nevyužívanou možností by bylo použití blokační monoklonální protilátky proti vazebné doméně příslušných receptorů.

Slibnou strategii představuje blokáda tyrozinkinázové domény intracelulární části receptorů pro angiogenní faktory (VEGF, FGF2 aj.) použitím tyrozinkinázových inhibitorů (TKI). Výhodou většiny používaných TKI je jejich účinek proti většímu počtu receptorových tyrozinkináz (multikinázové inhibitory). Vzhledem k tomu, že novotvorba cév je vysoce komplexní proces, na kterém se účastní mnoho angiogenních faktorů současně, zdá se logické, že multikinázové TKI mají výhodu proti vysoce selektivnímu účinku bevacizumabu [23]. Přehled TKI je v tab. 3. Signální kaskády většiny RTK účastnících se angiogeneze (VEGFR, PDGFR, FGFR, EGFR apod.) vedou k aktivaci PI3K AKT mTOR dráhy. Inhibitorym TOR proto také vykazují výrazný antiangiogenní účinek a představují vhodné látky pro kombinovanou antiangiogenní léčbu.

Kromě inhibice signální dráhy VEGF VEGFR se testuje též inhibice dalších relevantních proangiogenních kaskád (inhibicí receptorů pro EGF, pro integriny). Zkouší se též potlačení angiogenní aktivity neutralizací angiopoetinů. Rekombinantně připravený fúzní protein s vysokou afinitou vůči angiopoetinům AGM 386 se zdá být efektivní v léčbě solidních nádorů (v kombinaci s chemoterapií). Zabrání stimulaci receptorů TIE 2, a tím omezí angiogenní aktivitu angiopoetinů [24].

Inhibice proliferace endotelových buněk

Blokádou proliferace endotelií účinkuje fumagilin, extrakt z houby Aspergillus fumigatus, který se však pro výraznou toxicitu v klinické praxi neuplatnil. Využití méně toxického syntetického analoga AGM 1410 bránila značná neurotoxicita. Naproti tomu pegylovaná forma TNP 470 (Lodamin) je netoxická, jeví efekt u jaterních metastáz, a protože proniká hematoencefalickou bariérou, zkouší se i v léčbě mozkových nádorů [25].

Interferony alfa a beta tlumí proliferaci endotelií a používají se s dílčími úspěchy k omezení angiogeneze u progredujících angiomů [26]. Inhibice endoteliální proliferace se předpokládá jako jeden z mechanizmů antiangiogenního účinku imunomodulačních látek (IMIDs), mezi něž patří talidomid, pomalidomid a lenalidomid [27].

Stabilizace bazální membrány

Stabilizace bazální membrány znesnadňuje pučení endotelií mimo cévu. Inhibice enzymů, které bazální membránu rozrušují, může mít proto významný antiangiogenní účinek. K prostředkům cíleným na stabilizaci bazální membrány patří zejména inhibitory matrixmetaloproteáz (marimastat, batimastat, prinomastat) [28]. Výsledky klinických studií však nebyly přesvědčivé.

Disrupce nádorových buněk (VDA)

VDA (vascular disruption agents) vykazují cytotoxický účinek vůči již vytvořené nádorové vaskulatuře, a představují tak alternativní přístup směřující k blokádě cévního zásobení nádoru [29]. Mezi VDA látky patří kombrestatiny, výtažky z africké rostliny Combretum caffrum, které indukují apoptózu endotelií a destabilizují mikrotubuly (většinou působí jejich depolymeraci). Vyvolají následně kolaps a nekrózu vaskulatury nádoru [30]. Mezi nejúčinnější VDA patří ketopiperazinový analog NPI 2358 (plinabulin) nebo combrestatin A4-fosfát (fosbretabulin – Zybrestat), který vyvolá až stonásobné snížení průtoku krve nádorem s minimálním ovlivněním perfuze zdravých tkání. Zybrestat je „prodrug“, v endotelových buňkách se konvertuje na kombrestatin. K dalším VDA ve stadiu klinického testování patří soblidotin (TZT 1027), derivát dolastatinu 10. Také flavonoidy vykazují účinky podobné VDA. Mezi klinicky prověřované látky patří např. vadimezan – DMXAA (5,6-dimethylxanthenon 4-acetic acid), který v kombinaci s chemoterapií prodloužil dobu přežití u nemocných s NSCLC průměrně o 5 měsíců, ve srovnání se samotnou chemoterapií [31].

Další antiangiogenní strategie

V procesu angiogeneze se uplatňují ještě další procesy, které rovněž představují terapeutické cíle. Uplatňuje se stimulační vliv extracelulární matrix prostřednictvím integrinových receptorů. Proto monoklonální protilátky proti integrinům, jako např. volociximab, mohou tento proangiogenní účinek úspěšně blokovat (obr. 4). Za specifický inhibitor angiogeneze se považuje selektivní antagonista alfa v beta5 integrinu cilengitid [32]. Jde o cyklický peptid, který kromě antiangiogenního účinku blokuje též proliferaci a migraci CD133+ endotelových progenitorových buněk. Inhibitory HSP90 (heat shock proteins) působí antiangiogenně tím, že destabilizují HIF1alfa, významný transkripční faktor angiogeneze. Destabilizaci vazby HIF1alfa na HSP90 působí také hyperacetylace HSP90 způsobená účinkem inhibitorů histiondeacetyláz. Komplexní antiangiogenní účinek se uplatňuje u imunomodulačních látek (IMIDs).

Antiangiogenní účinky byly prokázány též u inhibitorů antiapoptotického proteinu BCL2. VEGF podněcuje expresi BCL2 jak v nádorových, tak i v endotelových buňkách. Upregulace BCL2 stimuluje výdej proapoptotických chemokinů CXCL1 a CXCL8 a aktivuje signální dráhu nukleárního faktoru kappa B (NFkB). Aplikace inhibitorů BCL2 (gossypol, obatoclax, ABT 737) působí zvýšenou apoptózu endotelových buněk a omezí proces angiogeneze [33].

Jako efektivní antiangiogenní léčba se jeví opakovaná aplikace velmi nízkých dávek cytostatik (např. cyklofosfamid 50mg denně nebo etopozid 50mg denně). Tato metoda se nazývá metronomická chemoterapie. Nevykazuje toxické účinky na nádorové buňky, ale je schopna ničit a inhibovat endotelové buňky včetně cirkulujících endotelových prekurzorů, a tím omezovat angiogenezi [34]. Kromě toho nízké dávky cytostatik indukují výdej antiangiogenního trombospondinu [35–36]. Za výhodu metronomické chemoterapie lze považovat i skutečnost, že k této léčbě nevzniká rezistence, neboť je cílena na normální, geneticky stabilní endotelie, které rezistenci nepodléhají. Současně aplikovaná antiangiogenní léčba potencuje účinnost metronomické chemoterapie [37]. Rozdíly mezi konvenční a metronomickou chemoterapií uvádí v přehledu tab. 4.

K antiangiogenní léčbě lze použít též protisměrné (antisense) oligonukleotidy proti mRNA pro VEGF (např. veglin) nebo specifické ribozymy (např. antiangiogenní ribozym angiozym). Dílčí antiangiogenní účinky byly zaznamenány také u většího počtu konvenčních chemoterapeutik (např. doxorubicin, taxany, 2-metoxyestradiol aj.).

Inhibice lymfangiogeneze

Novotvorba lymfatických cév je proces podobný novotvorbě krevních cév, nicméně lze uvést určitá specifika [38–39]. Lymfatické kapiláry vznikají slepě ve tkáních, jsou silně fenestrované a prakticky postrádají podpůrné buňky (pericyty či hladké svalové buňky). V průběhu embryonálního vývoje vznikají lymfatické cévy transdiferenciací z venózního systému vlivem traskripčního faktoru PROX1 (prospero related homeobox 1), který se považuje za marker lymfatických cév. Mezi specifické markery lymfatických cév patří dále VEGFR3, LYVE1 (lymphatic vessel endothelial receptor 1) a podoplanin (PDPN) [40–41]. Membránově exprimovaný podoplanin navíc oslabuje mezibuněčné adheze a stimuluje transendoteliální migraci maligních elementů do systémového řečiště a usnadňuje vznik metastáz [42]. Také hustota lymfatických cév v nádoru a v perinádorové tkáni je spojena s vyšším metastatickým potenciálem.

K potlačení novotvorby či destrukci lymfatických cév se používají obdobné strategie jako k inhibici krevních cév [43]. Z preklinicky a klinicky testovaných látek cíleně zaměřených na lymfangiogenezi lze uvést protilátky proti VEGFR3 či chimérické VGFR3 receptory (VGFR3-trap). Jako nadějná se jeví i cílená inhibice podoplaninu, který je zvýšeně exprimován nejen na lymfatických cévách, ale i na mnoha typech nádorových buněk.

K jeho inhibici lze použít monoklonální protilátku DM 3501. Klinicky se zkouší také rekombinantní neutralizační peptibody AMG 386 blokující interakci angiopoetinů ANG1 a ANG2 s TIE2 recep­tory. Tím se blokuje nejen lymfangiogeneze, ale též vaskulární angiogeneze. Látka je účinná zejména v kombinaci s chemoterapií [44].

Závěr

Angiogeneze je významná součást nádorového mikroprostředí (,,ekosy­stému“), která se podílí na růstu nádoru a jeho metastazování. Inhibice angiogeneze představuje významný přínos k protinádorové léčbě. Nabývá větší účinnosti v kombinaci s chemoterapií nebo s jinými modalitami cílené léčby.

Práce podpořena Výzkumným záměrem MSM 0021620808.

Autor deklaruje, že v souvislosti s předmětem studie nemá žádné komerční zájmy.
The author declares he has no potential conflicts of interest concerning drugs, pruducts, or services used in the study.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.
The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers.

prof. MUDr. Pavel Klener, DrSc.
1. interní klinika 1. LF a VFN
U nemocnice 2
128 08 Praha 2
e-mail: pavel.klener@ruk.cuni.cz