Konfokální laserová mikroskopie v diagnostice onkologických onemocnění gastrointestinálního traktu

Súhrn

Při konfokální laserové mikroskopii (confocal laser endomicroscopy – CLE) se užívá druh optického mikroskopu, který využívá jako zdroj světla laserový paprsek a zpracovává získaný obraz pomocí procesorové jednotky. Princip přístroje je znám již od roku 1957, nicméně až technický rozvoj v poslední době umožnil jeho reálné využití v klinické praxi. V rámci diferenciální diagnostiky je tak CLE relativně novou modalitou umožňující mikroskopické zobrazení vyšetřované tkáně v reálném čase, a tím de facto provádění neinvazivní in vivo biopsie. První zkušenosti s CLE byly získány především na poli endoskopickém, a to především v oblasti patologie jícnu, žaludku, žlučových cest, pankreatu a tlustého střeva. V posledních letech se taktéž rozvíjí neendoskopické peroperační použití, kde nejvíce zkušeností bylo prozatím získáno v oblasti neurochirurgie, chirurgie mammární a chirurgie prostaty. V rámci četných prospektivních randomizovaných studií byl potvrzen přínos CLE při sledování premalignit, v diferenciální diagnostice nádorových či zánětlivých onemocnění, ve zrychlení diagnostiky a ve snížení počtu endoskopických vyšetření. Použití CLE je navíc zatíženo pouze minimálním množstvím potenciálních nežádoucích účinků. Rizikem je možná alergie na fluorescein, který je během vyšetření užíván k barvení tkání. Prodloužení endoskopického vyšetření či operace je v rukou zaškoleného personálu minimální. Limitujícími faktory CLE jsou prozatím nedostatečné klinické zkušenosti, cena přístroje a používaných sond, subjektivní složka při hodnocení mikroskopického obrazu endoskopistou či chirurgem. Cílem této přehledové práce je shrnutí dosud publikovaných studií o užití CLE v diagnostice onkologických onemocnění gastrointestinálního traktu.

Klíčová slova:
konfokální mikroskopie – gastrointestinální trakt – nádory

Úvod

Idea konfokální laserové mikroskopie (confocal laser endomicroscopy – CLE) je známa již téměř 60 let. V roce 1957 byla patentována americkým matematikem Marvinem L. Minskym, který ale plně funkční mikroskop v době podání patentu nebyl schopen sestrojit pro absenci dostatečně silného zdroje světla [1]. Rovněž čeští vědci se podíleli na jejím rozvoji. Petráň a Hadravský z Lékařské fakulty UK v Plzni patentovali konfokální mikroskop (Tandem Scanning Confocal Microscope), se kterým byly historicky poprvé získány kvalitní optické řezy silným preparátem – mozkovou tkání [2,3]. Přes tyto dílčí úspěchy nebyla CLE příliš využívána, především pro složitost zpracování získaného obrazu. K jejímu rozvoji došlo v 80. letech minulého století s pokrokem výpočetní techniky. Využití v klinické praxi je reálně možné od roku 2004, kdy byl firmou Pentax vyvinut endoskop s konfokálním laserovým mikroskopem. Širší zavedení do praxe poté umožnila konstrukce CLE sond firmy Manua Kea technologies.

Princip fungování CLE

Konfokální laserový mikroskop je druh optického mikroskopu, který jako zdroj světla užívá monochromatický nízkoenergetický laserový paprsek. Ten je směřován soustavou clon, zrcadel a objektivem na vyšetřovanou tkáň. Po ní je posouván bod po bodu pomocí rastrovacího zařízení. Odražené paprsky jsou pak dichromatickým zrcadlem směřovány na bodovou clonu, která odfiltruje světlo odražené z jiných vrstev sledovaného preparátu. Snímaný obraz tak pochází pouze z jedné roviny vyšetřované tkáně a všechny body výsledného obrazu jsou tedy konfokální – mají společné ohnisko. Definitivní obraz je složen pomocí procesorové jednotky. K adekvátnímu zobrazení tkání je nutné užití barviva, které zvyšuje fluorescenční schopnost lidské tkáně [4,5].

Přístroje k provádění CLE

V praxi jsou nyní používány dva typy přístrojů umožňující CLE – endoskop firmy Pentax (endoscope based CLE – eCLE) a přístroj Cellvizio firmy Manua Kea technologies s CLE sondami (probe based CLE – pCLE) [6,7].

eCLE užívá mikroskop zabudovaný v běžném endoskopu průměru 12,8 mm, jehož koncová část je vzhledem k vestavěnému CLE rigidní a je prodloužena o 5 cm. Tento typ CLE lze užít k vyšetření horních i dolních partií gastrointestinálního traktu. Vzhledem k velikosti je nevhodný pro vyšetřování pankreatobiliárních struktur. Výhodou je možnost opakovaného užití.

pCLE využívá ke snímání mikroskopického obrazu sondy velikostně kompatibilní s pracovním kanálem běžných endoskopů. K dispozici je několik typů sond, pomocí kterých lze vyšetřovat trávicí trakt, dýchací cesty či urotrakt. Průměr a délka sond se liší v závislosti na způsobu užití. Nevýhodou sond je jejich životnost limitovaná počtem použití –  10× (AQ-Flex, Cholangioflex) a 20× (Colo/ /GastroFlex). Ač se v praxi nadále užívají oba typy CLE, komerčně dostupným nyní zůstal pouze přístroj Cellvizio (obr. 1). Další část článku bude tedy pojednávat o klinických zkušenostech s pCLE.

Praktické užití

Provádění pCLE je uživatelsky nenáročné. Spuštění a kalibrace přístroje trvá přibližně 3 min a je plně intuitivní. Průběh mikroskopického vyšetření poté závisí na zkušenostech endoskopisty či chirurga, který jej provádí. Při dostatečném zaškolení a standardizaci vyšetřovacího procesu prodlužuje výkon přibližně o 5–10 min. Před prováděním mikroskopie je nutné pacientovi aplikovat barvivo zvyšující fluorescenční schopnosti tkání. Nejčastěji užívaným a výrobcem doporučeným barvivem je fluorescein (Flurescite^® inj. sol 100 mg/ml) podávaný intravenózně v dávce 2,5–5 ml. Jeho výhodou je, že není toxický, rychle se distribuuje do tkání a dobře zobrazuje cévní struktury. Jiná speciální příprava pacienta není nutná. Samotné pCLE vyšetření je neinvazivní a nezvyšuje tak riziko již prováděné endoskopie či operace. Potenciálním rizikem je možná alergie na fluorescein. Většina zaznamenaných reakcí po intravenózním podání jsou však reakce méně závažného typu a zahrnují nauzeu, přechodnou hypotenzi, erytém v místě žilního vstupu či vyrážku. Bylo zaznamenáno i několik vzácných případů závažných reakcí ve smyslu anafylaxe, infarktu myokardu či šoku. Studie zaměřená na bezpečnost intravenózního užití fluoresceinu prováděná na 2 272 pacientech potvrdila výskyt středně závažné reakce u 1,4 % pacientů a nezaznamenala žádný případ závažné reakce [8]. Vedlejším efektem podání fluresceinu je žluté zbarvení sliznic a kůže, které odezní do 12 hod po aplikaci, a výrazně žluté zbarvení moči odeznívá do cca 36 hod [9].

Vlastní mikroskopické vyšetření je prováděno přiložením sondy na povrch vyšetřované tkáně. Dle typu sondy je snímán obraz průměru 240–325 μm s rozlišením 1–3,5 μm. Přehrávání obrazu probíhá okamžitě na připojeném monitoru. Zaznamenávat je možno celé vyšetření či pouze jeho požadované části, a to buď ve formě videa, či fotografií. Ty lze přímo vytisknout na připojené tiskárně či ukládat v digitální formě v běžně užívaných PAC systémech (picture archiving and communicating system – PACS), s kterými je přístroj plně kompatibilní.

Hodnocení získaného mikroskopického obrazu vyžaduje od vyšetřujícího lékaře nabytí postupných zkušeností s tímto zobrazením tkání a taktéž se standardními histologickými obrazy [10]. Možné je rovněž porovnání získaného mikroskopického obrazu s již vytvořenou databází jednotlivých patologií dostupnou jak v přístroji, tak on-line na www.cellvizio.net. Vzhledem k možnosti archivace v PACS lze výsledky hodnotit taktéž zpětně či lékařem jiné odbornosti – např. histopatologem.

Endoskopické zkušenosti s pCLE

Barretův jícen

Standardem při gastroskopickém vyšetření je používání endoskopu s kvalitním obrazem (high resolution endoscopy) a zobrazením pomocí bílého světla (white light endoscopy – WLE). Dále je využívána virtuální chromoendoskopie (VCE), např. NBI (narrow band imaging) od firmy Olympus či FICE (Fuji inteligent color enhancement) od firmy Fujifilm [11]. Při chromoendoskopii je obraz modifikován pomocí optického filtru nebo digitálního postprocessingu, s cílem objevení nativně neviditelných lézí či rozlišení benigní léze od neoplastické [12]. Při vyšetření Barretova jícnu je odebírána systematicky biopsie z postižené oblasti jícnu, a to vždy po 2 cm ze čtyř kvadrantů a cíleně z každé suspektní makroskopické abnormality [13,14]. Nevýhodou při odběru četných biopsií bývá krvácení, které ztěžuje přesný odběr dalších vzorků. Limitujícím faktorem pro stanovení diagnózy malignity je také nízký diagnostický výnos z celkového počtu odebraných biopsií, který se pohybuje kolem 6 % [15]. Multicentrická studie DONT BIOPCE z roku 2011 prokázala na souboru 101 pacientů, že rozpoznání intestinální metaplazie při kombinovaném vyšetření WLE a pCLE dosahuje senzitivity až 68 vs. 34 % při samotné WLE. Při použití WLE, pCLE a NBI je pak senzitivita  až 76 % [16].

Pankreatické cysty

Za nejpřínosnější diagnostickou modalitu při diferenciální diagnostice cystických lézí pankreatu je v současné době považována endoskopická ultrasonografie (EUS) v kombinaci s tenkojehlovou biopsií (fine needle aspiration  biopsy – FNAB) [17]. Přesnost samostatné EUS v diferenciální diagnostice mucinózních (maligních či potenciálně maligních) a non-mucinózních cyst pankreatu je přibližně 50 %, v kombinaci s FNAB pak až 80 % [18]. Vzhledem k rozměrům sondy AQ-Flex je možno její užití přes bioptickou jehlu velikosti 19 G (gauge). V literatuře je toto vyšetření označováno jako needle confocal laser endomicroscopy (nCLE). Prospektivními studiemi Contact, Inspect a Detect byla stanovena charakteristická kritéria pCLE obrazu některých cystických lézí pankreatu. Studie INSPECT z roku 2012 (65 pacientů) popsala typický obraz vilózních epiteliálních struktur charakteristický pro intraduktální papilární mucinózní neoplazii (IPMN) (obr. 2), vyšetření prokázalo vysokou specificitu – 100 %, limitem však byla nižší senzitivita – 59 % [19]. Studie CONTACT z roku 2014 na 31 pacientech stanovila charakteristický obraz serózního cystadenomu se zobrazenou povrchovou sítí vlásečnic, nevyskytující se u ostatních cystických lézí (obr. 3). Senzitivita vyšetření dosáhla 69 %, specificita pak byla 100 % [20]. Ve studii DETECT z roku 2015 (30 pacientů) bylo prováděno vyšetření cystických lézí pankreatu pomocí nCLE a EUS navigované cystoskopie – senzitivita při rozlišení maligních cyst byla u EUS – cystoskopie 90 %, u nCLE 80 %, kombinované vyšetření pak poskytovalo 100% senzitivitu [21].

Stenózy žlučových cest

Pacienti s podezřením na maligní stenózu žlučových cest jsou standardně došetřováni pomocí endoskopické retrográdní cholangiopankreatikografie (ERCP) s odběrem cytologie (brushing) a biopsie z oblasti stenózy. Senzitivita cytologického vyšetření je nízká a pohybuje se v rozmezí 18–60 % [22,23]. V případě diagnostické nejistoty jsou třeba opakované ERCP s rebiopsií. Pokud tyto nejsou úspěšné a podezření na maligní stenózu na podkladě klinických a paraklinických vyšetření trvá, pacienti jsou indikováni k resekčnímu výkonu. U pacientů operovaných pro podezření na maligní stenózu je až v 15 % malignita definitivní histologií vyloučena [24]. V prvním případě jsou tedy pacienti zatíženi opakovaným invazivním endoskopickým vyšetřením a rizikem prodlení s možností generalizace nádorového onemocnění, ve druhém naopak riziky spojenými s často rozsáhlým operačním výkonem. Prospektivní multicentrická studie FOCUS z roku 2015 hodnotila, zda se změní senzitivita, specificita či přesnost v případě kombinace ERCP s biopsií a pCLE. Hodnoceno bylo 112 pacientů v šesti centrech. Porovnávány byly výsledky ERCP, ERCP + pCLE, ERCP + biopsie + pCLE. Senzitivita samostatné biopsie byla pouze 56 %, specificita 100 % a přesnost 72 %. V případě stanovení diagnózy na podkladě obrazu ERCP a pCLE byla pak senzitivita 89 %, specificita 71 % a přesnost 82 %. Použití pCLE tedy přispívá ke zpřesnění diferenciální diagnostiky biliárních stenóz, zvyšuje pravděpodobnost rozpoznání  malignity [25].

Kolorektální karcinom,  prekancerózy kolorekta

Standardním ošetřením prekanceróz a časných karcinomů oblasti kolorekta je endoskopická mukózní resekce (EMR), při které se drobnější léze do průměru 20 mm odstraňují en bloc, větší jsou resekovány po částech (piecemeal, tedy metodou označovanou EPMR). Léze podezřelé z povrchové submukózní invaze je možné odstranit endoskopickou submukózní disekcí (ESD) [26]. Předpokladem úspěšné EMR či ESD je predikce hloubky nádorové invaze. K tomuto účelu je využívána NICE (NBI International Colorectal Endoscopic) klasifikace [27]. Ta na základě NBI hodnotí barvu, strukturu cév a povrch neoplazie (obr. 4A, B). Následně je dle typu NICE klasifikace možné předurčit histologii dané léze [28].

Ačkoli cílem EMR je úplné odstranění patologické léze, reziduální nádorová tkáň se nachází až u 23 % pacientů [29]. Prospektivní studie z roku 2012 se zaměřila na využití pCLE při sledování reziduálního tumoru po endoskopické mukózní resekci. Do studie bylo zařazeno 92 pacientů, kteří podstoupili kontrolní kolonoskopické vyšetření po provedené EMR. Bylo vyšetřeno 129 jizev po EMR, přičemž reziduální neoplazie byla potvrzena ve 29 případech (22 %). Senzitivita pCLE v kombinaci s HRE-VCE (high resolution endoscopy with virtual chromoendoscopy) byla 100 vs. 72 % u samostatného HRE-VCE [30].

Chirurgické zkušenosti s pCLE

Neendoskopické peroperační vyšetření tkání pomocí endoskopu Pentax bylo z technického hlediska velmi obtížné až nereálné. Konstrukce sond mikroskopu Cellvizio však nově umožňuje jejich vcelku komfortní užití i bez endoskopu během operace. Je tak možno vyšetřit tkáně nedostupné endoskopem. Při nasycení tkání podaným fluoresceinem či topickém obarvení indocyaninovou zelení je taktéž možno provést  ex vivo vyšetření na resekátu [31]. Chirurgové si teoreticky možný přínos pCLE v posledních letech uvědomili a hledají cestu k jeho využití. Nejvíce zkušeností je prozatím v oblasti mammární chirurgie [32,33], neurochirurgie [34,35] a chirurgie prostaty [36]. První zkušenosti jsou získávány i na českých pracovištích. Na chirurgickém pracovišti FN Brno je pCLE využívána v pankreatobiliární chirurgii. Již byly prezentovány retrospektivně hodnocené výsledky z pCLE vyšetření pacientů, kteří podstoupili resekční výkon na slinivce břišní pro tumor a byl stanoven charakteristický obraz patologicky změněné a zdravé tkáně pankreatu a žlučovodu (obr. 5, 6) [37].

Závěr

Získání mikroskopického obrazu vyšetřované tkáně v reálném čase neinvazivním způsobem je cesta, která nabízí potenciální zrychlení diagnostiky prekanceróz či maligních onemocnění gastrointestinálního traktu, snížení počtu prováděných endoskopií a biop-sií, menší psychickou i fyzickou zátěž pacientů. Četné studie potvrdily přínos pCLE v oblasti endoskopické, a to především v kombinaci s již běžně užívanými vyšetřovacími modalitami. Slibným se zdá též využití peroperační neendoskopické. Taktéž naše zkušenosti s tímto přístrojem v oblasti pankreatobiliární chirurgie potvrzují, že jeho užitím lze získat validní informace o mikroskopické struktuře tkání. V podstatě okamžité rozlišení zdravé či patologické tkáně může doplnit běžně peroperačně odebíranou kryobiopsii a být tak dalším z vodítek pro indikaci či odmítnutí radikální chirurgické léčby.

Limitujícími faktory pCLE jsou nedostatečné rozšíření v klinické praxi, cena přístroje a používaných sond, subjektivní složka při hodnocení mikroskopického obrazu endoskopistou či chirurgem. I přes tyto faktory celkový počet užívaných přístrojů i prováděných pCLE vyšetření postupně narůstá, zdá se tedy, že přínos pCLE převažuje nad těmito dílčími nevýhodami. Příslibem k jeho dalšímu rozšíření jsou navíc nové směry užití pCLE a nové možnosti zpracování získaných mikroskopických obrazů pomocí výpočetní techniky.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

MUDr. Lumír Kunovský

Chirurgická klinika

LF MU a FN Brno

Jihlavská 20625 00 Brno

e-mail: Kunovsky.Lumir@fnbrno.cz

Obdrženo: 9. 2. 2017

Přijato: 26. 2. 2017