Genová terapie v radiační onkologii

Súhrn

Východiska: Genová terapie je cílená změna genomu v cílových buňkách s léčebným záměrem. Genetický materiál se do buňky přenáší pomocí virových nebo nevirových vektorů. V současnosti již existují metody pro vysoce přesnou, specifickou editaci genomu. Klinická aplikace genové terapie u pacientů léčených radioterapií se zaměřuje na zvýšení účinku radioterapie (tedy usmrcování nádorových buněk) a na minimalizaci poškození normálních tkání. Radiace a genová terapie mohou mít synergický účinek – radioterapie určuje čas a místo aktivace genového konstruktu a může zvýšit efektivitu genového přenosu. Existují rovněž strategie s přenosem genů zvyšující radiosenzibilitu cílové tkáně. Základní strategie genové terapie v onkologii zahrnují přenos genů pro zvýšení citlivosti nádoru na farmakoterapii nebo radioterapii, kompenzaci ztraceného nebo deregulovaného onkogenu/antionkogenu, blokování exprese onkogenu za použití antisense oligonukleotidů a zvýšení imunogenicity nádoru za účelem navození nebo stimulace protinádorové imunity (genová imunoterapie).

Cíle: Cílem krátkého přehledového článku je poskytnout informace o strategiích a možnostech kombinací genové terapie a radioterapie.

Závěr: Různé typy genové terapie a radioterapii lze kombinovat za účelem zvýšení lokoregionálního protinádorového účinku a snížení toxicity. Všechny aplikace genové terapie v kombinaci s radioterapií však zatím zůstávají experimentální.

Klíčová slova:

radioterapie – genová terapie – editace genu – cílená genová oprava

Úvod

Genová terapie znamená zavedení genetického materiálu do buněk za léčebným účelem. Cílem je, aby se kompenzovaly nebo opravily abnormální geny nebo aby se v buňce vytvořil nový protein, který má v léčebné strategii prospěšný účinek (tab. 1) [1]. V současnosti již existují registrované léčebné metody používané v onkologii založené na genové imunoterapii – onkolytická viroterapie [2].

Genová terapie a radioterapie mají potenciálně synergický účinek, protože mají různé mechanismy účinku a zaměřují se na různé části buněčného cyklu. Genovou terapií je možné zvýšit radiosenzibilitu tkáně a naopak radioterapií zvýšit expresi přeneseného genu. Radioterapie je využívána pro nastartování a prostorovou determinaci exprese přenesených genů v přístupu, který využívá radiací indukovatelné promotory [3,4].

Genová terapie je zaměřena na somatické buňky, změny genomu jsou tedy nehereditární. Genová terapie zaměřená na lidské zárodečné buňky je v současnosti ve většině zemí zakázána.

Přenos genů a vektory

K přenosu genů do buňky slouží vektory na bázi virů nebo nevirové. K přenosu genů může docházet buď mimo tělo (ex vivo) s následným podáním modifikovaných buněk pacientovi, nebo přímo v těle nemocného po aplikaci vektoru s daným genovým konstruktem (in vivo). Protože se dosud nepodařilo vyřešit problém selektivního nebo alespoň preferenčního přenosu genů do nádorových buněk, byly v preklinických i velmi ojedinělých klinických studiích kombinujících genovou terapii s radioterapií vektory podávány intratumorálně (nebo u preklinických experimentů se transfer provedl ex vivo, zpravidla do xenograftu nádoru) [3,6].

Viry, které se pro přenos genů používají, jsou modifikovány tak, aby nezpůsobily infekci a zároveň preferenčně napadaly cílové buňky a ne ostatní buňky těla. Vazba a vstup viru do buňky je zprostředkován proteinovou obálkou na povrchu viru. Pro účely genové terapie je možné buď omezit, nebo naopak rozšířit rozsah buněk, které jsou vhodné pro transdukci vektorem genové terapie. Viry, ve kterých byly endogenní virové obalové proteiny nahrazeny buď obalovými proteiny z jiných virů, nebo chimérickými proteiny, se označují jako pseudotypované viry.

K přenosu genů lze použít i atenuované bakterie, které po endocytóze do buňky uvolní genový konstrukt. Kromě toho lze pro transfer, ač s nižší účinností, použít fyzikální nebo chemické metody bez živých organismů (tab. 2) [1,5].

Editace genomu

Nové technologie umožňují modifikaci (editaci) specifického místa genomu v cílové buňce. Tyto metody umožňují vyřazení (knock-out) určitého genu nebo zavedení nové genetické informace (např. opravu poškozeného genu). Teoreticky tedy tyto metody umožňují opravu onkogenních mutací v nádorových nebo i nenádorových buňkách. Byly již klinicky využity jednak k výrobě modifikovaných protinádorových lymfocytů, jednak k opravě hereditárních onemocnění kůže nebo kostní dřeně [7–9].

Systém CRISPR/Cas9

Genový konstrukt CRISPR (clustery pravidelně rozmístěných krátkých palindromických repetic – clustered regularly interspaced short palindromic repeats) /Cas9 (CRISPR asociované geny – CRISPR-associated genes) je systém pro cílené vnášení genetických změn do eukaryotických buněk založený na prokaryotickém imunitním systému. Do eukaryotických buněk je tento genový konstrukt vnesen např. pomocí lentiviru. Sekvence RNA, která je součástí konstruktu, specificky rozpozná komplementární sekvenci DNA a enzym Cas9 tuto DNA v cílovém místě rozštěpí. Podle typu experimentu lze docílit vyštěpení části DNA, a tím i likvidace daného genu nebo vnesení nové genetické informace do místa zlomu [10–12].

Metoda TALEN

Metoda TALEN (efektorové nukleázy podobné transkripčním aktivátorům – transcription activator-like effector nucleases) nerozeznává cílovou sekvenci pomocí RNA, ale pomocí speciální sekvence aminokyselin. Tato sekvence tedy funguje podobně jako transkripční aktivátory. Samotná modifikace DNA probíhá podobně, jak je popsáno výše [13].

Potenciální aplikace genové terapie v radiační onkologii

Klinické aplikace genové terapie u pacientů léčených radioterapií se zaměřují na zvýšení účinku radioterapie (tedy usmrcování nádorových buněk) a na minimalizaci poškození normálních tkání. Všechny aplikace genové terapie v kombinaci s radioterapií zatím zůstávají experimentální.

Využití promotorů indukovatelných zářením v kombinaci s terapeutickými geny

Přístup využívá promotorů genů, které jsou exprimovány v reakci na ionizující záření. Expozice buněk ionizujícímu záření indukuje poškození DNA přímou interakcí s DNA a vytvářením reaktivních kyslíkových radikálů (reactive oxygen species – ROS), což vede k transkripční aktivaci různých genů a k následné změně v jejich expresi. Dosud bylo identifikováno několik genů aktivovaných zářením nebo radiací generovanými ROS (např. geny rodiny jun-fos). Vesměs se jedná o geny odpovědi na oxidační stres. Promotory těchto záření indukovatelných genů lze využít k řízení exprese terapeutických genů [4,14–17].

Příkladem využití této strategie je transkripční faktor rychle odpovídající na buněčný stres EGR1. Promotor EGR1 je možné kombinovat s terapeutickými geny v jednom konstruktu použitelném pro genovou terapii. Po aplikaci záření dochází díky tomuto promotoru reagujícímu na záření k zvýšené expresi žádaného „downstream“ proteinu [18,19].

Příkladem je kombinace promotoru EGR1 s genem pro tymidinkinázu pocházejícím z viru herpes simplex. Ta mění gancyklovir na cytotoxické produkty, především gancyklovir-5‘-trifosfát. Pokud tedy pacientovi podáme gancyklovir, bude jej tymidinkináza v cílových buňkách měnit na cytotoxický metabolit. Protože tymidinkináza bude exprimována jen v ozářené tkáni, dochází k synergickému účinku radiace a genové terapie. Radioterapie v tomto případě určuje čas a místo cytotoxického působení metabolitů gancykloviru. Protože se tyto produkty mohou přes mezerové spoje (gap junctions) šířit do buněk v okolí, dochází k tzv. bystander efektu a není nutná 100% účinnost transfekce nádorových buněk [18,19].

Manipulace genů radiační rezistence

Nejvíce zkoumaným přístupem je obnovení aktivity genu p53. Mutace nebo delece p53 je v nádorech častá, zhoršuje buněčnou odpověď na poškození DNA, zabraňuje apoptóze a je silným prediktorem radiorezistence. Obnovení aktivity p53 pomocí virových vektorů kódujících p53 významně zvyšuje citlivost nádorových buněk na ozáření. V modelech nádorů s deficiencí p53 bylo v experimentu použito metody genové smyčky s pozitivní zpětnou vazbou (positive feedback genetic circuit). Příkladem je konstrukt složený z promotoru E6 citlivého na záření, promotoru R4 spouštěného proteinem p53 a samotného proteinu p53. Radiace aktivuje expresi p53 aktivací promotoru E6. Nově syntetizovaný p53 pak vazbou na promotor R4 zvyšuje svoji vlastní expresi pozitivní zpětnou vazbou. Tím dochází k vysoké produkci p53 a obnovení radiosenzitivity buněk [19,20].

Přenos genu vysokoafinitního membránového receptoru

Tento přístup se využívá v kombinaci s léčbou ligandy vázanými na radioizotopy. Genová terapie může zvýšit koncentraci produktu cílového genu na povrchu buněk, např. somatostatinového receptoru. Ten je pak cílem radiofarmaka, jehož účinnost se takto zvyšuje [21].

Modifikace mikroprostředí nádoru

Kombinace genové terapie s přenosem genu TNF-á s radioterapií vede k aditivnímu až synergickému zvýšení protinádorové účinnosti léčby. TNF-á hraje důležitou roli v protinádorové imunitní odpovědi a je inhibitorem nádorové angiogeneze [22].

Radioterapie v kombinaci s onkolytickou viroterapií

Intratumorální onkolytická viroterapie je novou modalitou imunoonkologické léčby. Onkolytické viry se selektivně replikují v nádorových buňkách. Mají přímou onkolytickou aktivitu a také indukují imunitní odpovědi proti sobě i proti nádorovým buňkám. Lze využít DNA a RNA viry (herpetické, paramyxoviry, adenoviry a další), které jsou obvykle geneticky modifikovány (např. přenosem genů pro cytokiny nebo odstraněním genů chránících virus před imunitním systémem). Podávají se injekcí přímo do nádorového ložiska, ale imunitní odpověď působí i na vzdálené metastázy. Ukazuje se, že konkomitantní aplikace záření může zvýšit míru infekce nádorových buněk virem, jeho replikaci a genovou expresi [23]. Tato modalita genové terapie je dosud jediná, která byla zkoušena i klinicky. V malých studiích fáze I–II byli takto léčeni pacienti s karcinomem prostaty, hlavy a krku, gliovými nádory mozku, sarkomy a nemalobuněčným plicním karcinomem. Několik studií zařazovalo pacienty s dostupným nádorem bez omezení jeho typu [24].

Přehled aktivních studií kombinujících virolytickou terapii a radioterapii je uveden v tab. 3.

Nežádoucí účinky genové terapie v kombinaci s radioterapií

Mezi nejčastější vedlejší účinky po genové terapii patří přechodná horečka, symptomy podobné chřipce a přechodná elevace jaterních testů. Tyto příznaky jsou způsobeny imunitní reakcí proti vektoru. V dosud provedených klinických studiích s malým počtem pacientů nebyly zaznamenány specifické nežádoucí účinky pro genovou terapii podávanou konkomitantně s radioterapií a lokální nežádoucí účinky radioterapie odpovídaly očekáváním [6,24].

Při genové terapii, kdy dochází k integraci viru a/nebo genového konstruktu do hostitelské DNA (např. při použití retrovirů jako vektoru), může dojít k náhodné nežádoucí mutaci se změnou exprese onkogenů nebo antionkogenů a vzniku malignit. V klinické studii s genovou terapií kombinované imunodeficience, kde se použil retrovirový vektor, došlo k případům leukemie následkem inzerční mutageneze [25].

Závěr

Preklinické studie ukazují, že radiace zvyšuje absorpci a replikaci viru v nádorové tkáni a expresi transgenů. Mezi zářením a genovou terapií může docházet k synergickým interakcím bez závažné celkové či lokální toxicity. Rozvoj genové terapie nádorů je v současnosti limitován omezeným vychytáváním vektorů v nádorové tkáni po systémovém podání, relativně nízkou expresí transgenů v cílových buňkách a v neposlední řadě vysokou cenou této léčby.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

The authors declare they have no potential confl icts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

doc. MUDr. Tomáš Büchler, Ph.D.

Onkologická klinika 1. LF UK a Thomayerovy nemocnice

Vídeňská 800

140 59 Praha

e-mail: tomas.buchler@ftn.cz

Obdrženo/Submitted: 23. 2. 2020

Přijato/Accepted: 15. 6. 2020