Radioterapie a radiosenzitivní syndromy u mutací genů reparace DNA

Súhrn

Východiska: Poškození DNA ionizujícím zářením je hlavním mechanizmem účinku radioterapie (RT) a výsledek léčby a poradiační toxicitu zdravých tkání ovlivňuje řada faktorů zevních a vnitřních, mezi které patří i mutace v genech pro reparaci DNA vedoucí k různým poruchám rozpoznávání poškozené DNA a jejich oprav. Poruchy reparace DNA se mohou projevovat zvýšenou citlivostí k onkologické léčbě. Cíl: Mechanizmus opravy DNA a přehled genetických syndromů s mutacemi genů účastnících se reparace DNA objasňuje urychlenou kancerogenezi a zvýšenou radiosenzitivitu při RT nádorových onemocnění. Většina radiosenzitivních syndromů je autozomálně recesivně dědičná, příkladem jsou ataxia teleangiectasia, Nijmegenský syndrom lomivosti, xeroderma pigmentosum, Cockaynův syndrom, Bloomův syndrom a Wernerův syndrom. Závěr: Radioterapie je u většiny homozygotních pacientů s recesivními radiosenzitivními syndromy kontraindikována. Asymptomatičtí heterozygoti mohou mít zvýšené riziko vzniku nádorů a malá část pacientů i mírně zvýšené riziko intolerance RT, nicméně indikaci k RT to nelimituje. Vysoké riziko sekundárních malignit po radioterapii je kontraindikací adjuvantní RT u Li-Fraumeniho syndromu.

Klíčová slova:

radioterapie – reparace DNA – radiosenzitivita

Úvod

V radioterapii se k léčbě používá nejčastěji ionizující fotonové záření lineárního urychlovače, které nepřímo ionizuje pomocí sekundárních elektronů, jimž předává svou energii. Běžná denní dávka např. při RT pro karcinom prsu je 2 Gy.

Ozáření dávkou 1 Gy nepřímo ionizujícího fotonového záření způsobí v jedné buňce cca 10⁵ ionizací, což vyvolá v DNA poškození 1 000 bází, vznik přibližně 1 000 jednovláknových zlomů a zhruba 20–40 dvouvláknových zlomů, což ve výsledku vede ke smrti zhruba jedné třetiny buněk a svědčí o velmi efektivním systému reparace DNA. Za den pak vznikne v důsledku endogenního oxidačního stresu v buňce 10 000 poškození DNA [1]. Dvouvláknové zlomy jsou nejzávažnější poškození DNA a mohou vzniknout primárně po ozáření nebo sekundárně v rámci reparace (např. při replikačním bloku při mezivláknových vazbách v DNA) [1].

Klinický účinek radioterapie na nádor a zdravou tkáň je ovlivněn celou řadou faktorů, které bývají označovány jako vnitřní a zevní [1,2]. Z vnitřních faktorů se jedná o genomické (mutace genů), epigenetické (modifikace histonů, metylace DNA), transkriptomické (mRNA, nekódující RNA) a proteomické (posttranslační modifikace proteinů) vrozené predispozice.

Zároveň však toxicitu léčby a její účinek na nádor ovlivňují i zevní faktory, které jsou závislé: na léčebné modalitě (technika radioterapie, druh záření, energie záření, frakcionace, celková doba RT, objemová závislost, konkomitantní i předchozí léčba), na charakteristikách pacienta (sociální status, abusus – např. nikotinizmus, stav výživy, věk, komorbidity jako diabetes mellitus, anemie, hypertenze, chronická zánětlivá onemocnění, non-revmatoidní artritida, kolagenózy, infekce/imunosuprese, preexistující funkční deficit v ozářených orgánech) nebo na druhu ozařované tkáně a buněk (např. hypoxie v nádoru).

Cílem předkládaného sdělení je poskytnout přehled základních mechanizmů opravy poškození DNA ionizujícím zářením v souvislosti se syndromy způsobenými mutacemi genů pro proteiny asociované s reparací DNA, s možnostmi vyšší radiosenzitivity u těchto onemocnění a predispozicemi ke vzniku sekundárních malignit po radioterapii.

Přehled nejčastějších hereditárních syndromů způsobených mutacemi genů reparace DNA a ovlivnění radiosenzitivity poskytuje tab. 1.

Poškození DNA ionizujícím zářením

Interakce záření s hmotou začíná fyzikální fází trvající piko- až nanosekundy, kdy ionizující záření při průchodu tkáněmi předává svou energii ionizací a excitací a interakcí s elektronovými obaly atomů a molekul vznikají nabité ionty, poté následuje chemická fáze trvající mikrosekundy a zahrnující vznik reaktivních volných radikálů a atomů a konečně bio­logická fáze, která může trvat milisekundy až roky a představuje odpověď buňky na poškození a jeho reparaci či fixaci změn, které mohou vést ke smrti buňky [1].

V buňce jsou vícečetné kopie většiny molekul (mRNA, proteiny), které mají poměrně krátký poločas existence a jejichž poškození není pro buňku limitující. Oproti tomu DNA je v somatické buňce přítomna pouze ve dvou kopiích, má dlouhý poločas existence a patří k největším molekulám v buňce. Od DNA se odvíjejí všechny procesy v buňce a z hlediska rizika jejího poškození se stává zásadním cílem udržení její plné funkčnosti. Experimenty s cíleným ozařováním buněčné membrány či cytoplazmy alfa částicemi nevedly ke smrti buňky a naopak krátce po ozáření jádra došlo k buněčné smrti; hlavním důvodem smrti buňky po ozáření je poškození DNA v jádře [3].

Buňky mají k dispozici různé způsoby oprav DNA, aby se vypořádaly s poškozením DNA noxami ze zevního i vnitřního prostředí a aby byla udržena stabilita genomu. Prostorová struktura dvoušroubovice DNA s histony vytváří nukleozom a spolu s dalšími proteiny kontrolujícími metabolizmus DNA tvoří chromatin, který je dále organizován do jednotlivých chromozomů. Proteiny účastnící se reparace DNA tak musí být přítomny v jádře v dostatečném množství a zároveň být mobilní, aby detekovaly poškození během sekund a minut. Složitá struktura DNA a proteinů musí být schopna rychlé remodelace a zpřístupnění dvoušroubovice DNA modifikací histonů v nukleozomu v okolí poškození DNA. Dočasně je během reparace poškození zpomalen buněčný cyklus a jsou zastaveny běžné procesy jako např. transkripce. Během reparace poškození DNA je celý proces monitorován a po dokončení oprav je znovu ustanovena prostorová struktura chromatinu a zahájena transkripce v rámci běžných procesů buňky [1].

Specializované reparační systémy slouží k opravě poškození bází (base excision repair – BER), jednovláknových zlomů (single strand break repair – SSBR), záměny párů bází (mismatch repair – MMR), excizní reparace nukleotidů (nucleotid excision repair – NER), dvouvláknových zlomů (double strand breaks – DSBR) a mezivláknových vazeb (interstrand cross link repair – ICR). Mutace nebo delece v genech pro BER, SSBR a DSBR mohou zvyšovat radiosenzitivitu buněk. Oproti tomu MMR a NER jsou pro reparaci poškození buněk po ozáření méně významné a mutace v těchto genech nezpůsobují vyšší radiosenzitivitu buňky [1].

Mechanizmy opravy DNA a genetický podklad syndromů se zvýšenou radiosenzitivitou

Odpověď na poškození DNA zahrnuje tři hlavní fáze [1], na nichž se podílí celá řada proteinů, jejichž mutace mohou přispět k poruše reparace DNA: 1) senzorickou část; 2) fázi přenosu signálů a 3) efektorovou část, která se uskutečňuje třemi hlavními mechanizmy: apoptózou (programovaná smrt buňky), regulací kontrolních bodů buněčného cyklu a reparací poškozené DNA.

Senzorická fáze odpovědi buňky na poškození DNA

Na začátku celého procesu stojí rozpoznání poškození DNA. Reparace DNA je vysoce komplexní a koordinovaný systém tvořený více skupinami signálních drah. Prvním stupněm obnovy stability genomu je senzorická fáze – rozpoznání poškození DNA. Hlavní senzorickou úlohu hraje několik skupin proteinových komplexů MRN (zkratka názvů komponent: MRE11, RAD50 a NBN1) / ATM (ataxia teleangiectasia mutated), Ku DNA proteinkinázy a ATR (ATM and RAD3related) / ATRIP (ATR interacting protein) komplex a PARP (polyadenosindifosfát-ribózo-polymeráza) enzymy. Tyto komplexy následně aktivují další proteiny, které vedou ke třem hlavním efektorovým cestám: k regulaci checkpointů buněčného cyklu, DNA reparaci nebo buněčné smrti. Nejzávažnější důsledky po ozáření mají dvouvláknové zlomy, které rozpoznává hlavně MRN komplex, tvořený proteiny MRE11, RAD50 a NBN1 (nibrin). Proteinový komplex MRN je při replikaci spojen s chromatinem a rozpoznává změnu struktury DNA při DSB a vede k aktivaci ATM kinázy, která následně aktivuje řadu proteinů (zejména CHEK2, p53 a H2AX proteiny). ATM je klíčovým regulátorem buněčné odpovědi na poškození DNA, účastnícím se regulace checkpointů buněčného cyklu, DNA reparace a regulace apoptózy. Homozygotní mutace v genu ATM se klinicky projevuje jako onemocnění ataxia teleangiectasia, které se manifestuje jako okulokutánní teleangiektázie a cerebelární progresivní ataxie a je spojeno s vysokou radiosenzitivitou [4,5].

Homozygotní mutace v genu pro nibrin (NBN) se projevuje jako Nijmegenský syndrom lomivosti chromozomů (NBS) s primárním imunodeficitem, vrozenou mikrocefalií, růstovou retardací a častějším výskytem hematologických i solidních malignit (autozomálně recesivní dědičnost). Homozygotní pacienti s NBS mají zvýšenou radiosenzitivitu [4,5].

Mutace komponenty MRE11 se projevuje jako onemocnění zvané ataxia teleangiectasia-like, projevující se pomalou mozečkovou degenerací, rozvojem okulomotorické apraxie i dalšími mozečkovými syndromy; není přítomna teleangiektázie. U tohoto onemocnění je zvýšená radiosenzitivita.

Druhou skupinou mající senzorickou roli v detekci poškození DNA jsou proteiny Ku70 a Ku80, které se vážou ke koncům dvouvláknových zlomů a aktivují Ku DNA proteinkinázy (mají podobnou strukturu a funkci jako ATM). Ku DNA proteinkinázy fosforylují H2AX (varianta histonu H2A, který tvoří jádro nukleozomu, kolem nějž je obalena DNA). Rozsah (vzdálenost) fosforylace H2AX na obě strany kolem DSB je řízen proteinem MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint protein 1), který se váže přímo na ATM a fosforylovaný H2AX a mění strukturu chromatinu, čímž zpřístupňuje mutaci v DNA dalším reparačním enzymům.

Třetí skupinou kináz, které fosforylují H2AX, jsou ATR (ataxia teleangiectasia related) proteiny. Na rozdíl od ATM a Ku DNA PK se nezdá role ATR zásadní v signalizaci DSB po ozáření. Jeho klíčová úloha je však v dalším stupni po aktivaci ATM-MRN komplexu, kdy v důsledku reparace DSB vznikají v okolí četné SSB a ty se reparují pomocí ATR cesty. ATR kináza aktivuje jiné proteiny než ATM účastnící se regulace checkpointů buněčného cyklu (např. CHEK1), DNA reparace a regulace apoptózy.

PARP (poly-adenosindifosfát-ribózo-polymerázy) jsou enzymy katalyzující vznik polymerů ADP-ribózy, které vznikají na chromatinu po poškození DNA. Jsou dvě velké rodiny PAR polymeráz (PARP1 a PARP2), které se účastní rozpoznání poškození DNA a přenosu signálu.

Fáze přenosu signálu – druhá fáze odpovědi buňky na poškození DNA

Druhým stupněm obnovy stability genomu je transduktorová fáze, kdy dochází k přenosu signálu o poškození DNA do efektorové fáze, která vyústí buď k opravě DNA, nebo k apoptóze buňky. Posttranslační úpravy se typicky týkají chromatinu v okolí mutace v DNA.

Aktivace ATM, ATR, DNA-PK (DNA proteinkinázy) a PARP v důsledku poškození DNA vede následně k modifikaci několika tisíc buněčných proteinů. ATM spustí fosforylační kaskádu – fosforyluje se protein pBRCA1, dochází k interakci s proteinem pRAD51 (RAD51 rekombináza), který se účastní oprav dvouřetězcových zlomů DNA procesem homologní rekombinace. Protein pBRCA2 také interaguje s RPA (replikační protein A) komplexem, jehož úlohou je transportovat pRAD51 do místa poškození. Regulace homologní rekombinací (HR) probíhá ovlivněním vazby RAD51 na ssDNA (jednovláknová DNA) v RPA komplexu. Tyto regulační mechanizmy řídící pozitivně nebo negativně HR se podílejí také na posttranslačních modifikacích [6,7].

Vrozené poruchy v genech pro reparaci DNA pomocí HR mají souvislost s predispozicí k nádorům prsu a ovarií i k jiným nádorům (BRCA 1,2, ATM…) [8], přičemž pro nosiče těchto mutací jsou stanovena doporučení pro prevenci, sledování i profylaktické operační výkony [8,9].

Mutace genu RAD51 je spojena se vznikem Fanconiho anemie – komplementační skupiny R. Při dalších mutacích genů skupiny Fanconiho anemie také vzniká zvýšená citlivost k látkám ovlivňujícím mezivláknové vazby v DNA – buňky s mutacemi ve skupině FA jsou středně radiosenzitivní [5].

Efektorová fáze

Apoptóza (programovaná smrt)

ATM fosforyluje dva hlavní proteiny: produkt tumor supresorového genu p53 a MDM2 (homolog mouse double minute 2). Protein p53 se po vazbě na MDM2 inaktivuje, což je normální stav v buňce. Po poškození DNA dochází k fosforylaci p53 a MDM2, čímž se p53 uvolní a může regulovat průchod kontrolními body buněčného cyklu a apoptózu. Protein p53 aktivuje mnoho dalších genů a mezi nimi proapoptotické geny, které u ně­kte­rých buněk mohou vést přímo k apoptóze (pro mnohobuněčný organizmus může být někdy výhodnější zbavit se jedné buňky, než opravovat její poškozenou DNA).

Protein Rb (retinoblastom) vazbou na transkripční faktor E2F inaktivuje jeho funkci a blokuje průchod buněčným cyklem. Volný E2F by zvyšoval hladiny cyklinů E a A, čímž by umožnil vstup buňky do S fáze. Pokud je protein Rb fosforylován, což zajišťuje komplex CDK4/6 a cyklinu D1, je zvýšena hladina nevázaného E2F a pokračuje průchod buněčným cyklem. Protein p16 je inhibitor komplexu CDK4/6 a cyklinu D1, čímž znemožní fosforylaci proteinu Rb a zastavuje tak buněčný cyklus v G1 fázi.

Proces reparace DNA, apoptózy a stárnutí buňky ovlivňuje i infekce vysoce rizikovými papilomaviry (human papillomavirus – HPV), které integrují svůj genom do genomu buňky a vedou k expresi proteinů E6 a E7. Protein E6 se váže na p53 a protein BAX, čímž umožní jejich ubikvitizaci a následnou degradaci, a tak znemožní apoptózu. Protein E6 také aktivuje telomerázu (enzym, který hraje roli v replikačním potenciálu buňky – brání zkracování telomer). Po vazbě proteinu E7 na protein Rb se neutlumí produkce transkripčního faktoru E2F, ten pak neomezeně stimuluje tvorbu cyklinu A a cyklinu E, a podílí se tak na pokračování buněčného cyklu a nikoli jeho zpomalení či zastavení v případě nutnosti reparace DNA [10]. Ve snaze regulovat průchod buněčným cyklem je zvýšeně produkován protein p16, avšak jeho vazba na komplex CDK4/6 a cyklin D1 nevede k vazbě proteinu Rb na E2F, neboť protein Rb je vázán virovým proteinem E7, a transkripční faktor E2F tak umožňuje neomezený průchod buněčným cyklem. Tím vzniká genetická nestabilita vedoucí nejen ke zvýšenému výskytu genetických změn a snížení apoptózy, ale v důsledku aktivace telomerázy i k velmi dlouhé životnosti buňky. Všechny tyto změny umožňují vznik nádorové buňky při infekci HPV.

Aktivace kontrolních bodů buněčného cyklu

Druhou hlavní efektorovou dráhou v buňce s poškozenou DNA je aktivace kontrolních bodů buněčného cyklu za účelem zpomalení průběhu buněčného cyklu, což přispěje k vyšší pravděpodobnosti dokončení správné reparace DNA. Průběh buněčného cyklu je regulován cyklin dependentními kinázami (CDK), které jsou aktivní pouze ve vazbě na specifický cyklin. V G1 fázi je aktivní komplex cyklinD/CDK4, v G2 a M fázi komplex cyklinB/CDK1, v S fázi cyklinA/CDK1 a cyklinA/CDK2. Aktivace kontrolních bodů buněčného cyklu se děje dvěma hlavními cestami: aktivací proteinů, které přímo inhibují komplex cyklin/CDK (např. protein Rb), nebo ovlivněním fosforylace a snížením aktivity CDK (např. p16). Komplex cyklin/CDK vede k fosforylaci jiných proteinů (tím utlumí jejich funkci) a umožní pokračování buněčného cyklu.

Kontrolní body aktivované poškozením DNA jsou čtyři: v G1 fázi, v S fázi a v časné a pozdní G2 fázi.

Kontrolní bod v G1 fázi se účastní regulace rozhodující o tom, zda vůbec buňka zahájí replikaci DNA před buněčným dělením. Kontrolní bod je citlivý na dostatek růstových faktorů a faktorů nutných k replikaci. Přechod z G1 do S fáze je ovlivňován transkripčním faktorem E2F, který umožní transkripci genů zodpovědných za replikaci DNA. E2F je inaktivován vazbou na protein Rb. Tato vazba je zrušena fosforylací proteinu Rb komplexem cyklinD/CDK4 a cyklinE/CDK2.

Poškození DNA s aktivací ATM vede k fosforylaci p53, což uvolní vazbu MDM2 a způsobí aktivaci p53. Protein p53 umožňuje upregulaci mnoha dalších proteinů, mezi nimi inhibitoru CDK proteinu p21 (CDKN1A). P21 inhibuje v G1 fázi komplexy cyklin/CDK, čímž zabrání fosforylaci genu Rb a zpomalí/zastaví vstup do S fáze.

Kontrolní bod v S fázi v závislosti na výši aplikované dávky zpomaluje syntézu DNA. Hlavními zúčastněnými proteiny jsou CHEK1 a CHEK2, které ATR a ATM přímo aktivují fosforylací po poškození DNA. CHEK1 a CHEK2 inaktivují CDC25A a CDC25C (fosfatázy, které udržují CDK2 aktivní); ve výsledku se po ozáření sníží aktivita CDK2 a zpomalí se průchod S fází. Ačkoli je dráha ATM-CHEK2 a ATR-CHEK1 s inhibicí CDC25A/C hlavní způsob zpomalení průchodu S fází, existuje řada jiných proteinů, které vedou ke stejnému výsledku (např. proteiny BRCA1 a BRCA2 účastnící se homologního end-joiningu). To je zároveň příkladem komplexního propojení aktivace kontrolních bodů buněčného cyklu a vlastní reparace DNA.

Časný kontrolní G1 bod je ATM-CHEK2-CDC25A/C dependentní a je aktivován při poškození DNA po ozáření relativně nízkými dávkami (1 Gy) v G2 fázi. Cílem je cyklin B / CDK1 komplex, který se po defosforylaci stává aktivním a zabraňuje vstupu buňky do mitózy.

Pozdní kontrolní G1 bod je aktivován změnami DNA, ke kterým došlo v G1 či S fázi; na rozdíl od časného kontrolního bodu není ATM dependentní, hlavní dráhou je ATR-CHEK1-CDC25A-C.

Většina nádorových buněk má mutace v genech pro aktivaci kontrolních bodů buněčného cyklu G1 a S, což vede k selhání zpomalení či zástavy buněčného cyklu po ozáření a ke genetické instabilitě, která souvisí s progresí kancerogeneze buňky, nemusí však nutně znamenat zvýšenou radiosenzitivitu (např. mutace v genech p53, p21 nebo Rb nezpůsobují zvýšenou radiosenzitivitu buněk). Naopak mutace v genech řídících kontrolní body v G2 fázi jsou spojeny se zvýšenou radiosenzitivitou [1].

Reparace poškozené DNA

Po detekování poškození DNA se zastaví transkripce a buněčný cyklus a je zahájena oprava DNA. Hlavní reparační dráhy v buňce jsou BER, SSBR a DSBR. Ionizující záření způsobuje celou řadu poškození bází, jednovláknových zlomů a nejzávažnějších dvouvláknových zlomů. Po ozáření je nejčastější poškození bází a jednovláknových zlomů – mechanizmy BER a SSBR mají k opravě zhruba 50× více poškození než DSBR. Při běžném metabolizmu buňky také dochází k poškození DNA oxidativními produkty, jejichž opravy se účastní BER a SSBR.

Při BER je odstraněna poškozená báze, toto abazické místo je rozpoznáno apurinovou/apyrimidinovou endonukleázou (APE), která jej v DNA vystřihne, a poškozené místo je následně opraveno za účasti DNA polymeráz, XRCC1 (X-ray repair cross-complementing protein) a dalších enzymů.

Po ozáření vznikají komplexnější jednovláknové zlomy DNA než při běžném buněčném metabolizmu; konce vláken bývají změněné a je potřeba jejich úprava. Při SSBR jsou po detekci jednovláknového zlomu konce DNA upraveny a následně opraveny mechanizmy podobnými jako u BER. Neopravené jednovláknové zlomy mohou při mitóze vyústit ve dvouvláknový zlom. Mutace v genech pro BER a SSBR mohou působit jen mírnou radiosenzitivitu.

Dvouvláknové zlomy po ozáření jsou reparovány pomocí dvou hlavních mechanizmů: homologní rekombinace (HR) a nehomologní spojování konců (non-homologous end-join­ing – NHEJ). Který z těchto dvou mechanizmů bude použit, záleží na struktuře chromatinu a na fázi buněčného cyklu. Oprava HR je mnohem pomalejší než NHEJ. Ve zdravých buňkách obvykle převažuje NHEJ nad dalšími cestami reparace, ale HR se uplatňuje též ve významné míře. Oproti tomu v nádorových buňkách se ve větší míře uplatňují více mutagenní alternativní mechanizmy DSBR, což akceleruje genetickou variabilitu nádorových buněk [11]. Význam spolehlivé homologní rekombinace v praxi dokladuje těžká radiosenzitivita u nosičů homozygotních mutací ATM.

NHEJ spojuje dva konce DNA dvou­- vláknového zlomu. Po navázání Ku70/80 heterodimerů na konce dvouvláknového zlomu se aktivují DNA-proteinkinázy (DNA-PKc). DNA-PKc tvoří rozsáhlý proteinový komplex schopný vytvořit můstek mezi oběma konci v místě dvouvláknového zlomu. Udržuje tak oba konce poblíž sebe, což je nutné pro úspěšnou reparaci DNA. Polynukleotidová kináza, endonukleáza Artemis a polymerázy upravují konce zlomené DNA, aby mohly být spojeny pomocí DNA ligázy 4 a za pomoci proteinů XRCC4 a NHEJ1. Tyto úpravy konců DNA mohou vést ke zkrácení či naopak prodloužení části DNA. NHEJ je jediný reparační mechanizmus v G1 fázi a zodpovídá za reparaci 90 % DSB v G2 fázi. Ztráta proteinů účastnících se NHEJ, jako DNA-PKc a ligázy 4 (LIG4), vyúsťuje v těžkou radiosenzitivitu. Další důsledek snížené reparační kapacity buněk je neodpovídavost k frakcionaci – buňky nemohou provést reparaci DNA při frakcionované radioterapii, proto mají pacienti s radiosenzitivními syndromy vyšší akutní a následně i pozdní reakce. Na křivce přežití buněk chybí raménko, hodnota a/b je vysoká. Protože NHEJ se účastní VDJ rekombinace a vzniku protilátek a receptorů T-buněk, je součástí deficitu NHEJ proteinů kromě radiosenzitivity i těžká imunodeficience.

Mutace genu pro endonukleázu Artemis DCLRE1C (DNA cross-link repair 1C) způsobuje syndrom radiosenzitivního těžkého kombinovaného deficitu, který se manifestuje od útlého věku těžkými infekcemi z důvodu absence lymfocytů a je asociován se zvýšenou citlivostí buněk k účinku ionizujícího záření [4,12].

Syndrom deficitu LIG4 způsobený mutací genu LIG4 se projevuje rozvojem těžkého imunodeficitu s poruchami růstu a mikrocefalií, dále psoriázou, teleangiektáziemi a zvýšenou radio- senzitivitou [4,12].

Deficit v syntéze DNA-PKcs při mutacích genů PRKDC a XRCC7 se projevuje těžkými imunodeficity asociovanými s radiosenzitivitou [13].

Homologní rekombinace používá jako vzor neporušenou homologní kopii DNA, vzhledem k tomu je reparace bez chyb, uplatňuje se v S fázi a G fázi buněčného cyklu. Na koncích zlomů DNA je za pomoci komplexu MRN a proteinů Exol vytvořena jednovláknová část v oblasti zlomu, na ni se naváže protein RPA a dojde k vyhledání komplementární části sesterské chromatidy. Tohoto procesu vyhledávání se účastní proteiny RAD51, XRCC a BRCA2. Mutace v genech pro tyto proteiny vedou k poruše reparace HR. Dalšího kroku při vyhledávání a „rozmotání“ komplementární části sesterské chromatidy se účastní helikázy. Helikázy hrají velmi důležitou roli v DNA reparaci, kdy se vážou na DNA, rozplétají a oddělují od sebe obě vlákna DNA rozrušením vodíkové vazby za pomoci ATP. Helikázy se mohou vázat a remodelovat i RNA. V lidských buňkách byly popsány desítky helikáz a nejvýznamnějším typem helikáz je RECQ DNA. V lidském genomu je pět genů pro RECQ helikázy: RECQ1 [14], BLM (RECQ2) [15], WRN (RECQ3) [16], RECQ4 (RTS) a RECQ5 [17]. Významná bio­logická role RECQ helikáz v DNA reparaci je spojena se závažnými dědičnými onemocněními: Bloomovým syndromem (gen BLM), Wernerovým syndromem (gen WRN) a Rothmund-Thomsonovým syndromem (gen RECQ4). Tato genetická onemocnění jsou spojena s vyšším výskytem nádorových onemocnění, předčasným stárnutím, imunodeficitem, mentální retardací a chromozomální nestabilitou [18–19].

Další nemoci spojené s deficientní funkcí helikáz jsou xeroderma pigmentosum (helikáza ERCC3 – excision repair cross complementing gen kódující protein XPB), Cockaynův syndrom (mutace v genu ERCC8 = CSA nebo genu ERCC6 = CSB) [20] a trichothiodystrofie (gen ERCC2 nebo ERCC3). Mutace v helikáze Pif1 je spojena s predispozicí ke karcinomu prsu [21]. Mutace v genu pro senataxin (SetX) s RNA helikázovou aktivitou způsobuje juvenilní amyotrofickou laterální sklerózu typu 4 [22] a ataxii s okulometrickou apraxií 2 [23]. Helikázy mají kromě role v replikaci (PcrA1), reparaci (XPD, XPB, WRN) a rekombinaci DNA (BLM, Rho) i další aktivity v transkripci (Rho, TFIIH, RECQL5), translaci (Vasa), remodelaci chromatinu (RAD54, ATRX, BLM), udržování telomer (Pif1, WRN, BLM, FANC) a v maturaci Okazakiho fragmentů (Pif1, WRN) [24].

Fáze S a G2 patří díky homologní rekombinaci k radiorezistentním fázím buněčného cyklu.

Homologní rekombinace se podílí i na reparaci mezivláknových cross-linků (interstand crosslinks – ICL). Skupina proteinů Fanconiho anemie (FANC-A, -B, -C, -E, -F, -G, -L, -M) se podílí na ICL, ubikvitinizuje FANC-D2 a FANC-I, které dále působí na proteiny FANC-D1, -J, -N, jež odstraní mezivláknovou vazbu a dosyntetizují DNA kolem zlomu. Komplexy proteinů účastnící se HR reparace jsou BRCA2/FANC-D1 a RAD51/FANC-O. Pacienti s Fanconiho anemií mají aplazii kostní dřeně a sklon ke vzniku akutní myeloidní leukemie. Při mutacích genů skupiny Fanconiho anemie vzniká zvýšená citlivost k látkám způsobujícím mezivláknové vazby v DNA a zároveň jsou buňky s mutacemi ve skupině FA středně radiosenzitivní.

Nosiči zárodečné mutace BRCA1,2 mají zvýšené riziko vzniku nádorů, zvláště nádorů prsu a ovarií, klinicky nebyla zvýšená radiosenzibilizace prokázána (zdravé buňky na rozdíl od nádorových mají jednu alelu genu BRCA funkční). Radiosenzitivita není zvýšena ani u mutací genu PALB2 (partner and localizer of BRCA2, FANCN). Ten kóduje DNA reparační protein, který je součástí endogenního multiproteinového komplexu BRCA2. Společně s proteiny BRCA1 a BRCA2 se PALB2 podílí na opravách DSB [25]. PARP inhibitory blokují SSBR, který se podílí na závěru HR při reparaci DSB.

Další syndromy způsobené mutacemi v genech asociovaných s reparací DNA, u nichž je zároveň zvýšená radiosenzitivita, jsou tzv. Warsaw breakage syndrome (mutace genu DDX11 pro DNA helikázu) nebo syndrom Cernunnos [5].

Mismatch repair opravuje špatně spárované nukleotidy a skládá se ze čtyř základních kroků: rozpoznání chyby, excize, resyntézy a ligace. Klinicky se mutace v genech pro MMR neprojevuje zvýšenou radiosenzitivitou při samotné radioterapii, ale kombinace derivátu uracilu a radioterapie je spojena se zvýšenou radiosenzitivitou buňky. Dále jsou buňky citlivé na chemoterapii s cisplatinou a temozolomidem. MMR deficientní buňky nesou zvýšené množství dalších mutací (vysoká mutační nálož), což je spojeno se zvýšenou produkcí antigenů a odpovědí na imunoterapii.

NER se podílí na opravách poškození DNA např. UV zářením (tymidinové dimery a DNA můstky po cisplatině) a účastní se ho např. protein ERCC1 a proteiny skupiny XP, které mutaci odstraní a DNA polymeráza doplní a restauruje DNA helix. Mutace genů NER mají značnou fenotypovou variabilitu a různé mutace stejných genů mohou působit odlišné nozologické jednotky (xeroderma pigmentosum, Cockaynův syndrom, Fanconiho anemie) a naopak fenotypově stejné nemoci mohou být způsobeny různými mutacemi (XPB, XPD, XPG, ERCC1 a XPF). Porušení funkce genů NER není většinou spojeno se zvýšenou radiosenzitivitou, závisí na typu jednotlivých mutací [26].

Důležitou roli hrají též proteiny asociované s kohezí chromatid – koheziny, které drží sesterské chromatidy pohromadě od replikace DNA až do anafáze buněčného cyklu; mutace v těchto genech mohou způsobovat ně­kte­ré vzácně se vyskytující syndromy s vyšší radiosenzitivitou – syndrom Cornelie de Lange (CdLS) nebo Robertův syndrom [5].

Zvýšená radiosenzitivita bývá dále pozorována u RIDDLE syndromu – název je složen ze základních symptomů: radiosenzitivita, imunodeficit, dysmorfie, poruchy učení (learning difficulties) [5]. Tento syndrom je způsoben mutací genu RNF168, který je součástí reparace DNA poškození asociovaného s ubikvitinovou signální dráhou. Dědičnost je autozomálně recesivní.

Predispozice pro sekundární malignity po radioterapii

Genetické podklady vyššího rizika vzniku nádorů po aplikaci ionizujícího záření byly sledovány u skupin dětských i dospělých pacientů. I v rámci syndromů se zvýšenou radiosenzitivitou jsou účinky ionizujícího záření pouze jedním z více rizikových faktorů podílejících se na vzniku nádorové transformace buněk.

U dětských pacientů bylo identifikováno několik podskupin pacientů, u nichž jsou pozorovány zvýšené predispozice ke vzniku sekundárních malignit v ozařovaném poli [5,27]. Jedná se o pacienty s retinoblastomy, u kterých vznikají sarkomy měkkých tkání, dále pacienti s neurofibromatózou typu I, u nichž dochází ke vzniku sekundárních tumorů v souvislosti s radiační léčbou gliomů. Dalšími skupinami jsou pacienti s Li-Fraumeniho syndromem, u nichž vznikají sekundární nádory po radioterapii ve zvýšené míře, nebo pacienti s Gorlinovým syndromem, u kterých byla pozorována vyšší četnost vzniku bazaliomů v ozařovaném poli [5,27].

U dospělých pacientů je sledován vznik sekundárních malignit po radioterapii u celé řady onemocnění, genetické predispozice byly zkoumány ve větší míře u karcinomu prsu. Zastoupení homozygotů radiosenzitivních syndromů je velmi vzácné a radioterapie je kontraindikována [1]. Heterozygotní nosiči těchto autozomálně recesivních genů mohou tvořit již významnější počet, zhruba kolem 5 % populace. Heterozygotní nosiči ATM mutací mají přibližně dvojnásobně zvýšené riziko sekundárního karcinomu prsu po expozici ionizujícímu záření, zvýšená incidence nádorů v kontralaterálním prsu po RT se vyskytla ve vnitřních kvadrantech na rozdíl od neozářených nosiček, kde byl výskyt duplicit nižší a dominoval výskyt v zevních kvadrantech [28], vliv dalších predisponujících genů (BRCA1,2, CHEK2) na indukci nádorů ionizujícím zářením je zřejmě výrazně menší [5,29]. Navzdory mírně zvýšené radiosenzitivitě buněčných linií u heterozygotů [30–33] není v klinické praxi jasná korelace zvýšené toxicity radioterapie u heterozygotů radiosenzitivních nádorů [34,35].

Byly publikovány zvýšené poradiační reakce u ně­kte­rých heterozygotních pacientů s radiosenzitivními syndromy [36–38] a teoreticky je předpokládána i vyšší odpověď nádoru [39]. U Li-Fraumeniho syndromu je doporučeno upřednostnit v preventivní péči magnetickou rezonanci [40,41]. U zdravých heterozygotů ATM je doporučeno se při screeningových a jiných vyšetřeních vyvarovat zobrazovacích metod využívajících ionizující záření [42]. Dle doporučení Americké společnosti pro klinickou onkologii a Americké společnosti pro radiační onkologii je jediná skupina pacientů s omezením indikace radioterapie u prokázané germinální mutace p53. U pacientů s Li-Fraumeniho syndromem s karcinomem prsu je doporučena mastektomie místo konzervativního operačního výkonu bez adjuvantní RT, výjimkou v indikaci RT jsou pacienti s významným rizikem lokoregionální rekurence [43–45].

Genetické předpoklady vyšší radiosenzitivity zůstávají nadále předmětem výzkumu, a je-li k radioterapii indikován pacient s mutací v genech asociovaných s radiosenzitivními syndromy, je vhodné před zahájením léčby ověřit vliv změny funkce mutovaného genu např. v databázi OMIM [46] a vyloučit asociaci se zvýšenou radiosenzitivitou.

Podpořeno MZ ČR – RVO (Fakultní Thomayerova nemocnice – FTN, 00064190).
Supported by Ministry of Health, Czech Republic – conceptual development of research organization (Thomayer University Hospital, TUH 00064190).
Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.
The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.
Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.
The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

MUDr. Radka Lohynská, Ph.D.
Onkologická klinika 1. LF UK a FTN
Vídeňská 800
140 59 Praha 4
e-mail: radka.lohynska@ftn.cz
Obdrženo/Submitted: 1. 7. 2021
Přijato/Accepted: 11. 8. 2021