V. Diagnostické metody v onkologii a biobanking

V/75. Explainability of diagnostic AI models – showcase of prostate cancer diagnosis

Holub P.1,2

1 RationAI Laboratory, Institute of Computer Science, Masaryk University, Brno, Czech Republic, 2 BBMRI-ERIC, Graz, Austria

Artificial intelligence (AI) is changing dramatically how histopathological diagnosis can be done. Common AI models are, however, opaque and their validation is done statistically on the large number of samples, without in-depth understanding of how the models work. In work done by the RationAI laboratory at Masaryk University in collaboration with Masaryk Memorial Cancer Institute, we develop methods for the explanation of the behavior of AI models. The presentation will demonstrate application of such methods to analyze an AI model to assist pathologists in the diagnosis of prostate cancer and it will show how different biological patterns are recognized by the model and also demonstrate boundary conditions of applicability, such as identifying mimickers in the non-cancer tissues. The use of explainability approaches allowed improvements of the model, which is now undergoing clinical validation at Masaryk Memorial Cancer Institute. The presentation also showcases how services of BBMRI-ERIC, a European research infrastructure on biobanking and biomolecular resources, have been used to develop and validate the model.

V/76. Zapojení BBM 1. LF UK v rámci komplexní charakteristiky vybraných nádorových onemocnění na Ústavu patologie 1. LF UK a VFN v Praze

Kendall Bártů M.

Ústav patologie 1. LF UK a VFN v Praze

Východiska: Banka biologického materiálu 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy (BBM) vznikla v září 2011 a je součástí mezinárodní infrastruktury biobank BBMRI (Biobanking and Biomolecular Resources Research Infrastructure) a ERIC (European Research Infrastructure Consortium). Kromě vzorků tekutin a DNA obsahuje také vzorky tkání, které jsou odebírány a skladovány v kryoskladu na Ústavu patologie 1. LF UK. Od roku 2013 prochází BBM úspěšně certifikací kvality dle EN ISO 9001. V současnosti spravuje BBM materiál z více než 11 000 odběrů, z nichž 4 700 tvoří tkáňové vzorky. Cílem projektu BBMRI je shromažďování vysoce kvalitních biologických vzorků pro využití zejména v oblasti výzkumu nádorových onemocnění, se zaměřením nejen na diagnostické účely, ale zejména na prognostické a prediktivní biomarkery. Cíl: Toto sdělení má za cíl stručně představit uzavřené, probíhající i aktuálně plánované výzkumné projekty Ústavu patologie 1. LF UK a VFN v Praze, ve kterých byly použity tkáňové vzorky z BBM. Jedná se zejména o vzorky uchovávané v RNA lateru, které se vyznačují vysokou kvalitou a prezervací vysokomolekulárních DNA a RNA a které tak umožňují provedení širokého spektra molekulárně-patologických vyšetření, jež by z materiálu fixovaného formalinem a zalitého do parafínu nebyly možné. Nukleové kyseliny izolované z fixovaných tkání jsou fragmentované a nejsou ideálním materiálem např. pro expresní analýzy. Čerstvě zmrazená tkáň z BBM je tak nenahraditelným zdrojem pro izolaci DNA a RNA. Výzkumné projekty, ve kterých byly vzorky z BBM využity, zahrnují zejména: 1) projekt Komplexní analýza HNF1B a dalších genů a proteinů v různých typech karcinomů a nenádorových lézí, 2) studie zaměřená na germinální mutace genu TP53 u uveálního melanomu; 3) projekt Komplexní analýza sex cord stromálních nádorů ovaria, 4) plánovaný projekt cílený na molekulární testování karcinomu prsu, zaměřený na porovnání metod využívajících tkáňové vzorky a tekuté biopsie s ohledem na prediktivní testování. Závěr: S rozvojem možností molekulární genetiky prudce narůstá význam molekulární patologie, zejména u studií zaměřených na nádorovou problematiku. Molekulární alterace na úrovni DNA a RNA, expresní profilování a metylační analýzy v současnosti představují základní a neoddělitelnou součást výzkumu v oblasti patologie. Bez možnosti využít čerstvě zmrazené tkáňové vzorky z BBM by celá řada těchto analýz nebyla možná, a BBM tak hraje naprosto zásadní roli pro molekulárně genetická vyšetření využívaná v našich výzkumných projektech.

Podpořeno MZ ČR (RVO VFN 64165) a BBMRI_CZ LM2023033.

V/77. Oncogenetic and forensic projects using samples from BBMRI Olomouc center

Drábek J., Kotková L., Levková M., Bouchal J.

IMTM, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacký University, Olomouc, Czech Republic

In Olomouc BBMRI, samples from oncology patients from University Hospital Olomouc are primarily archived. Scientific projects run in Institute of Molecular and Translational Medicine Secondary are secondary sources of samples. The spectrum of projects on these samples is wide: in last 2 years, it covered flow-cytometric analysis of prostate cancer subpopulations, epithelial to mesenchymal transition and microRNA expression association with spindle and apocrine cell morphology in triple-negative breast cancer, copy number variation in foetuses with a congenital heart defects, analysis of sphingolipid metabolism in EpCAM+ cells isolated from human colon tumours as well as from whole frozen tissues, and age estimation by cytosine methylation from samples of blood and sperm. Here, we will focus more on the last two projects. The development of colon cancer is accompanied with numerous lipid alterations. However, analyses of whole tumor samples may not always provide an accurate description of specific changes occurring directly in tumor epithelial cells. We will present results of analysis of the phospholipid (PL), lysophospholipid (lysoPL), and fatty acid (FA) profiles of purified EpCAM+ cells, isolated from tumor and adjacent non-tumor tissues of colon cancer patients. Prediction of age of an unknown trace donor can be important to narrow down the police investigation in cases where crime scene DNA cannot be matched with a profile in a police database or with the one of a suspect. Such age prediction is tissue specific and is based on the epigenetic changes in the activity of specific genes during the lifetime. We focused on blood and semen. For blood, we established prediction model using 7 CpGs in 5 genes (ELOVL2, MIR29B2CHG, CCDC102B, PDE4C and FHL2) on the set of 200 samples from healthy consented blood donors. For semen, a prediction model was developed using a set of 46 samples and 5 most informative CpGs. For both prediction models, 82.5% of samples were correctly predicted within the limit of ± 4 years.

This project was supported in part by grants LM2023033, CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000868, CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008448, EF16_013/0001674, LX22NPO5102, LM2018133, and IGA LF UP 2022_012.

V/78. Syndrom VEXAS – revmatologické a hematologické onemocnění

Stibůrková B.

Oddělení molekulární biologie a imunogenetiky, Revmatologický ústav Praha

Syndrom VEXAS (Vacuoles, E1 enzyme, X-linked, Autoinflammatory, Somatic) je recentně identifikované monogenní autoinflamatorní závažné onemocnění způsobené somatickými mutacemi genu UBA1 (ubiquitin-like modifier activating enzyme 1) v hematopoetických progenitorových buňkách. Missense mutace UBA1 u pacientů se syndromem VEXAS způsobují aktivaci zánětlivých drah, které se klinicky projevují u starších pacientů systémovým zánětem a možností progrese do myelodysplastického, myeloproliferativního nebo lymfoproliferativního onemocnění. Pacienti s klinicky heterogenním nálezem mohou splňovat diagnostická kritéria pro různá revmatologická a/nebo hematologická onemocnění. Na syndrom VEXAS je třeba pomýšlet u každého dospělého pacienta s nevysvětlitelným systémovým zánětlivým onemocněním, zejména při opakovaných horečkách, neutrofilní dermatóze, recidivující polychondritidě, očním zánětu a dalších systémových zánětlivých příznacích doprovázejících myelodysplastický syndrom (MDS). V případě VEXAS syndromu jsou UBA1mut buňky primární příčinou systémového zánětu a selhání kostní dřeně a představují novou molekulárně definovanou somatickou jednotku spojenou s MDS. Konferenční příspěvek představuje patofyziologii, diagnostický algoritmus, léčbu a zapojení Banky biologického materiálu Revmatologického ústavu ve studii tohoto recentně identifikovaného, klinicky závažného onemocnění.

Podpořeno projekty NU23-10-00160 a BBMRI.cz LM2023033.

V/79. Využití izotermálních amplifikačních technik v diagnostice nádorových onemocnění

Bartošík M., Moráňová L., Izadi N., Sebuyoya R., Strmisková J., Hrstka R.

RECAMO, MOÚ Brno

Východiska: PCR je mimořádně všestranná technika amplifikace nukleových kyselin s mnoha různými aplikacemi nejen v biomedicínském výzkumu. Nabízí řadu výhod, jako je vysoká citlivost a specificita nebo možnost multiplexování. Zároveň však vyžaduje speciální přístroj – termocykler – pro střídání teplot, je poměrně časově náročná a vysoce citlivá na inhibitory PCR, jako jsou různé soli nebo detergenty. Zajímavou alternativou k PCR jsou nové techniky amplifikace nukleových kyselin (NK) souhrnně nazývané izotermální amplifikační techniky (IAT), které probíhají při konstantní teplotě bez nutnosti cyklování. Dosahují srovnatelné citlivosti jako techniky založené na PCR, ale často v kratších časech (do 20–30 min) a jsou obvykle odolné vůči inhibitorům PCR. Existuje již řada těchto technik, např. LAMP (z angl. loop-mediated amplification), RPA (recombinase polymerase amplification) nebo RCA (rolling circle amplification). Cíl: V naší laboratoři vyvíjíme nové diagnostické technologie na bázi IAT v kombinaci s elektrodovými biočipy/biosenzory, které skýtají další výhody, např. jednoduchost, levné přístrojové vybavení nebo možnost paralelní detekce. Tyto technologie jsme již úspěšně aplikovali v analýze NK jakožto důležitých nádorových biomarkerů, např. při analýze bodové mutace V600E v genu BRAF u nádorů tlustého střeva a melanomu [1], při detekci lidských papilomavirů (HPV) ve stěrech z děložního hrdla [2] nebo při stanovení dlouhé nekódující RNA PCA3 v moči pacientů s nádorem prostaty [3]. Všechny studie byly provedeny na klinickém materiálu a validovány pomocí standardních metod. Závěr: Kombinace těchto metod představuje zajímavý nástroj v současné molekulární onkologii, jelikož nabízí jednoduchou a rychlou možnost detekce vybraných biomarkerů.

Práce byla podpořena grantovými projekty AZV NU21-08-00057, AZV NU21-08-00078, BBMRI-CZ no. LM2018125 a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

Literatura: [1] Sebuyoya R, Valverde A, Moranova L et al. Dual detection system for cancer-associated point mutations assisted by a multiplexed LNA-based amperometric bioplatform coupled with rolling circle amplification, Sens Actuat B 2023; 394: 134375. [2] Izadi N, Sebuyoya R, Moranova L et al. Electrochemical bioassay coupled to LAMP reaction for determination of high-risk HPV infection in crude lysates. Anal Chim Acta 2021; 1187: 339145. doi: 10.1016/j.aca.2021.339145. [3] Moranova L, Stanik M, Hrstka R et al. Electrochemical LAMP-based assay for detection of RNA biomarkers in prostate cancer. Talanta 2022; 238: 123064. doi: 10.1016/j.talanta.2021.123064.

V/126. Diagnostika lokálně pokročilého karcinomu pankreatu z pohledu gastroenterologa, zavádění klipů do pankreatu pro STX RT

Dastych M., Kroupa R.

Interní gastroenterologické klinika LF MU a FN Brno

Karcinom pankreatu zaujímá ve vyspělých zemích třetí místo v příčině úmrtí na onkologické onemocnění. Jeho diagnostika se opírá především o klinickou symptomatologii a včasnou indikaci k provedení CT vyšetření břicha, neboť sono břicha je pro diagnostiku často nedostatečné. Symptomatika závisí do značné míry na anatomické lokalizaci nádoru v pankreatu. Drobné tumory lokalizované v hlavě pankreatu se mohou již časně projevit nebolestivým ikterem, bez předchozí jiné symptomatologie, a vést tak k relativně časné diagnostice. Naopak nádory umístěné v těle nebo kaudě pankreatu mají nespecifickou symptomatiku charakterizovanou neurčitou dyspepsií doprovázenou střídavými bolestivými stavy často nízké intenzity. Někdy bývá prvním projevem lehká pankreatitida. Indikace k provedení CT břicha u tumorů v těchto lokalizacích bývá často opožděná a vyšetření pak ukáže lokálně pokročilý, často diseminovaný tumor. Nezřídka se tumory v těchto lokalizacích projeví krvácením do trávicího traktu při prorůstání do stěny žaludku nebo stěny tlustého střeva, krvácením ze subkardiálních varixů při trombóze lienální žíly nebo vznikem ascitu při peritoneální diseminaci. V posledních několika letech se využívají nové kombinované metody léčby pokročilého karcinomu pankreatu. Mezi ně patří i stereotaktická radioterapie (SBRT) určená pro lokálně pokročilé inoperabilní nediseminované tumory. Pro přesné plánování radioterapie a provedení SBRT je potřebná vizualizace nádoru pomocí kontrastních kovových značek. Tyto značky (LumiCoil Platinum Marker, Boston Scientific) jsou cíleně umístěny do tumoru pod endosonografickou kontrolou pomocí jehly o průměru 22G. Značky jsou tvaru písmene S a délky 5 mm. Optimální je umístění tří až čtyř značek do okrajových částí nádoru. Komplikací výkonu může být krvácení, infekce a migrace značek.

V/145. Je kolorektální screening skutečně nákladově efektivní? Je tomu tak i v ČR?

Ngo O.1,2, Hejcmanová K.1,2, Chloupková R.1,2, Dušek L.1,2, Hejduk K.1,2, Májek O.1,2

1 ÚZIS ČR, Praha, 2 Institut biostatistiky a analýz, LF MU Brno

Východiska: Na základě vědeckých důkazů z klinických studií bylo doporučeno implementovat screeningový program kolorektálního karcinomu, který prokazatelně snižuje epidemiologickou zátěž populace. V ČR byl kolorektální screening zaveden již od roku 2000 a je kontinuálně hodnocena jeho výkonnost prostřednictvím robustní datové základny screeningových programů. Klíčovou součástí hodnocení je také nákladová efektivita, neboť je při plánování zdravotnických rozpočtů na místě otázka, zda peníze investované do kolorektálního screeningu jsou investovány účelně a efektivně. V řadě studií byla prokázána nákladová efektivita kolorektálního screeningu [1] a cílem této práce bylo ověřit, zda je tomu tak i v ČR. Materiál a metody: Pro hodnocení nákladové efektivity byla využita data Národního zdravotnického informačního systému vedeného Ústavem zdravotnických informací a statistiky ČR, a to konkrétně data z Národního registru hrazených zdravotních služeb a Národního onkologického registru, a syntéza informací z odborné literatury. Součástí hodnocení byl také odhad nákladů na léčbu kolorektálního karcinomu, který byl proveden metodou srovnání případů a kontrol (osoby s/bez kolorektálního karcinomu a srovnání veškeré vykázané péče). Následně byly odhadnuty celoživotní náklady na léčbu u osob s kolorektálním karcinomem a zahrnuty do analýzy nákladové efektivity (spolu se specifikací přirozeného průběhu onemocnění, screeningového procesu a nákladů na screeningová vyšetření) tří strategií (bez screeningu, dvě screeningové strategie – nabízení pouze testu na okultní krvácení do stolice (TOKS) nebo TOKS/kolonoskopického vyšetření) pomocí markovského modelu. Výsledky: Prostřednictvím screeningového programu s výchozí účastí 45 % populace je možné snížit incidenci o více než 40 % (TOKS/kolonoskopie), respektive o víc než 30 % (TOKS) a podobné příznivé výsledky lze pozorovat také u mortality tohoto onemocnění. Nárůst nákladů spojených se screeningem a následnou diagnostikou v obou screeningových strategiích je kompenzován snížením nákladů na léčbu pacientů s kolorektálním karcinomem. U screeningové strategie, kde byl nabízen TOKS, se průměrné náklady na jednotlivce snížily o víc než 3 tis. Kč a pokud byla nabídnuta i kolonoskopie, tak dokonce o více než 3,5 tis. Kč oproti strategii bez screeningu. Závěr: V ČR byla prokázána nákladová efektivita kolorektálního screeningu v porovnání s modelovou situací bez screeningu. Screeningové strategie byly navíc vyhodnoceny jako náklady šetřící.

Literatura: [1] Ran T, Cheng CY, Misselwitz B et al. Cost-effectiveness of colorectal cancer screening strategies – a systematic review. Clin Gastroenterol Hepatol 2019; 17 (10): 1969–1981 doi: 10.1016/j.cgh.2019.01.014.

V/197. Nové trendy v sekvenování nové generace a jejich aplikace v onkologické diagnostice

Pardy F.1, Tichý B.2, Pospíšilová Š.3, Kurucová T.2

1 CEITEC MU Brno, 2 CF Genomika, CEITEC MU Brno, 3 Ústav lékařské genetiky a genomiky, LF MU Brno

Metodika masivně paralelního sekvenování, taktéž označovaná jako sekvenování nové generace (NGS), je v oblasti diagnostiky nádorových onemocnění stále více užívána vzhledem ke snižujícím se nákladům a širokému spektru aplikací. Jejím důležitým znakem je flexibilita a adaptabilita pro různé typy diagnóz. V naší přednášce představíme některé typy obvyklých i méně obvyklých analýz využívajících NGS. Dnes již poměrně běžným přístupem je příprava tzv. diagnostických panelů, pomocí kterých lze sekvenování zacílit na geny zájmu a vyšetřovat konkrétní varianty v genech zájmu. NGS přístup umožňuje taktéž stanovit nebalancované změny genomu prostřednictvím sekvenování genomu s nízkým pokrytím či s použitím specializovaných DNA backbone sond. Trendem posledních let je pak analýza DNA volně cirkulující v krvi (cell-free DNA), která nabízí možnost neinvazivního vyšetření nádorových onemocnění. Další oblastí vývoje sekvenačních technologií je přístup sekvenování jednotlivých molekul, pro které využíváme sekvenátor Oxford Nanopore. Díky způsobu odečítání signálu pomocí změn elektrického napětí je možné detekovat modifikace nukleobází (zejména mC a mA) a využívat tuto informaci pro rychlou klasifikaci neurologických nádorů. Sekvenování pomocí nanopore technologie dosahuje délek sekvenačních readů v řádu desítek kilobází, je tedy taktéž vhodné pro analýzu onemocnění spojených s expanzí repetic (některé typy dystrofií) nebo pro hledání translokací a dalších chromozomových aberací.

V/200. Emergency medicine pharmacotherapy compromises accuracy of renal function determinations – real-world clinical evidence and implications for clinical practice

Valík D.

University Hospital Brno, Czech Republic

Background: Assessment of kidney function in emergency settings is essential across all medical subspecialties. Daily assessment of patient creatinine results from emergency medical services showed that some results deviated from expected values, implying drug-related interference. Methods: Real-time head-to-head clinical evaluation of an enzyme method (Roche CREP2) in comparison to Jaffé gen. 2 method (Roche CREJ2) was performed. During the period of December 2022 and January 2023 we analyzed 8,498 patient samples, where 5,524 were heavily medicated STAT patient specimens, 500 were pediatric specimens and 2,474 were from a distant general population in a different region using the same methods. Results: About 5% of hospital specimens having patient history showed apparent drops of creatinine concentrations by the enzyme method against the compensated Jaffé method. Suspect medication was found in 43 out of 46 reviewed patients where medication data were allowed for review. A general patient cohort showed no drops of concentrations measured by the enzyme method. A pediatric hospital cohort showed 6 drops from 500 total measurements. Conclusions: Pharmacotherapy-induced inaccuracies with enzyme creatinine methods imply the need for proper method validation in the relevant patient population such as emergency hospital setting, and may facilitate introduction of cystatin C to emergency medicine practice as a suitable alternate biomarker to creatinine.

V/201. Fekální pankreatická elastáza jako ukazatel exokrinní pankreatické insuficience

Černá Pilátová K., Zdražilová Dubská L.

Oddělení klinické mikrobiologie a imunologie, Ústav laboratorní medicíny, LF MU a FN Brno

Pankreatická elastáza 1 je proteolytický enzym produkovaný a secernovaný pankreatem. Na rozdíl od jiných pankreatických enzymů není tento enzym významně degradován při průchodu trávicím traktem, a jeho stanovení ve stolici lze tedy využít pro zhodnocení exokrinní funkce pankreatu [1,2]. Indikace ke stanovení pankreatické elastázy ve stolici jsou: dlouhodobé sledování pacientů s chronickou pankreatitidou nebo cystickou fibrózou, screeningové vyšetření při onemocnění pankreatu či diferenciální diagnostika malabsorpčního syndromu [1,2]. Normální hodnoty koncentrace pankreatické elastázy ve stolici jsou > 200 μg/g, hodnoty < 100 μg/g jsou pak považovány za těžkou pankreatickou insuficienci [2]. Ke kvantitativnímu stanovení elastázy ve stolici se na Oddělení klinické mikrobiologie a imunologie FN Brno používá automatizovaná imunoturbidimetrická metoda. Pro odběr stolice je určena speciální jednorázová odběrová souprava, jež umožňuje jednoduchý odběr standardizovaného množství vzorku stolice pacientem a jeho skladování. Zkumavka současně slouží k extrakci vzorku, čímž se významně zjednodušuje preanalytické zpracování vzorku v laboratoři. Díky automatizaci vyšetření a způsobu odběru vzorku je možné vyšetření provádět každý pracovní den.

Literatura: [1] Leeds JS, Oppong K, Sanders DS. The role of fecal elastase-1 in detecting exocrine pancreatic disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2011; 8 (7): 405–415. doi: 10.1038/nrgastro.2011.91. [2] Capurso G, Traini M, Piciucchi M et al. Exocrine pancreatic insufficiency: prevalence, diagnosis, and management. Clin Exp Gastroenterol 2019; 12: 129–139. doi: 10.2147/CEG.S168266.

V/202. Alergie na penicilin – realita a možnosti vyšetření

Nevrlka J.1, Zdražilová Dubská L.1, Sova M.2

1 Oddělení klinické mikrobiologie a imunologie, FN Brno, 2 Klinika nemocí plicních a tuberkulózy LF MU a FN Brno

Alergie na penicilinová antibiotika (dále PNC alergie) je nejčastěji udávanou lékovou alergií, se kterou se setkáme v anamnéze a/nebo dokumentaci pacienta nejenom v onkologii. Spolehlivost tohoto údaje je nízká, protože je obvykle založen jen na nekritickém posouzení potíží, které vznikly v době podávání antibiotika, a nesouvisí často jen zdánlivě přímo s infekční chorobou. Zda jde skutečně o PNC alergii, není až na výjimky objektivizováno a v obavě z možnosti vyvolání závažné nežádoucí reakce nejsou PNC (a často i ostatní beta-laktamová antibiotika) dále recipována. S časovým odstupem často ani nelze zjistit nějaké podrobnosti k předmětné „alergické“ atace. Z četných studií je zřejmé, že údaj o PNC alergii je validní u méně než 10 % pacientů. A contrario, více než 90 % pacientů je zbytečně léčeno antibiotiky druhé volby, která mají někdy nižší účinnost, vyšší riziko vedlejších účinků a obvykle vyšší cenu. Proto je současným trendem snaha zlepšit účelnou farmakoterapii ověřením údaje o PNC alergii a jeho případnou revizí (tzv. de-labelling). Principy vyšetřování lékových hypersenzitivních reakcí určují společná doporučení WAO / EAACI / ACAAI / AAAAI (tj. Světové zdravotnické organizace + evropské a obou amerických odborných alergologických společností). Tyto principy reflektují i doporučené postupy ČSAKI (České společnosti pro alergologii a klinickou imunologii), resp. její Pracovní skupiny pro lékové alergie. Základem vyšetřování je důkladná a podrobná anamnéza, následují laboratorní a kožní testy a nakonec lékové provokační testy. Takto designované vyšetřování prováděné specialisty v oboru alergologie však naráží celosvětově na jejich počty a v rámci ČR také na jejich obvykle nízké zkušenosti a nedostatečné zázemí pro tuto specifickou činnost. Řešením neuspokojivé situace jsou pokusy stanovit algoritmy umožňující již na základě posouzení anamnézy stratifikovat pacienty na riziko opakování a sílu nežádoucí reakce. Zatímco vysoce rizikoví pacienti by byly odesláni jako dosud na alergologii, pacienti s nízkým rizikem mohou být podrobeni přímo provokačnímu testu i mimo alergologická pracoviště. V roce 2022 byly zveřejněny v tomto smyslu i první oficiální národní guidelines (britské BSACI guideline for the set-up of penicilin allergy de-labelling services by non-allergists working in hospital setting). Z výše uvedených zdrojů vychází náš návrh na posuzování údajů o PNC alergii a pro jejich další ověřování pro naše lokální podmínky.

Podpořeno MZ ČR – RVO (FNBr, 65269705).

V/203. Implementace průtokové cytometrie v diagnostickém algoritmu maligních výpotků

Řiháček M.1, Wagnerová A.1, Bouček L.1, Šimůnková E.2

1 Ústav laboratorní medicíny LF MU a FN Brno, 2 Oddělení laboratorní medicíny, MOÚ Brno

Východiska: Rutinní laboratorní analýza výpotku zahrnuje základní stanovení krevních parametrů a buněk pro iniciální určení povahy a origa výpotku. To je nutné zejména pro časné a odpovídající zaléčení choroby, která k nahromadění tekutiny ve třetím prostoru vedla (infekce, poruchy cirkulace, nádorové onemocnění atd.). V rámci diferenciální diagnostiky poskytují hematologické analyzátory IVD metodu ke stanovení počtu mononukleárních (MN) a polymorfonukleárních elementů (PMN). Naším cílem bylo: 1) zjistit možnou souvislost mezi hodnotou poměru PMN a MN u výpotků s cytologicky prokázanou přítomností karcinomových buněk a bez nich, resp. zda lze na základě stanovení poměru PMN/MN předpovídat maligní origo punktátu, 2) provést obdobné srovnání mezi identifikací CD326 pozitivních elementů v tělní tekutině a její cytologické označení jako maligní (identifikace karcinomových buněk), 3) výsledky metod 1), 2) a cytologie mezi sebou srovnat a vyhodnotit jejich diagnostický přínos. Materiál a metody: Vzorky punktátu celkem 37 pacientů byly analyzovány na přístroji Sysmex XN-2000 v módu body fluid (stanovení počtu PMN a MN). Identifikace CD326 pozitivních elementů s využitím protilátky anti-CD326-APC byla provedena na průtokovém cytometru Beckman Coulter Navios. Referenční metodou, která definovala přítomnost nádorových elementů, byla cytologie. Výsledky: Z celkového počtu 37 punktátů bylo 18 (48,6 %) cytologicky označeno za pozitivní na přítomnost maligních buněk. Maligní výpotky vykazovaly vyšší poměr PMN/MN (p = 0,02), při analýze ROC křivky však dosahovala frakce CD326 pozitivních elementů jako ukazatel malignity lepších výsledků (AUC = 0,9006; 95% CI 0,7969–1) než poměr PMN/MN (AUC = 0,7251; 95% CI 0,5491–0,9012). Optimální cut-off hodnotou pro vyrovnanou senzitivitu a specificitu označení výpotku za maligní na základě průtokové cytometrie bylo 0,008 % CD326+ buněk z celkového počtu analyzovaných elementů ve vzorku (senzitivita 83,3 %, specificita 94,7 %). Závěr: Maligní výpotky vykazovaly překvapivě vyšší poměr PMN/MN než vzorky bez přítomnosti maligních buněk. Poměr PMN/MN bývá zvýšený i u infekčních/zánětlivých výpotků, tedy jej nelze diagnosticky využít k predikaci maligního origa. Průtoková cytometrie s identifikací povrchového antigenu CD326 na karcinomových buňkách přináší možnost identifikace výpotku maligního origa (karcinomy) s velmi dobrou diagnostickou senzitivitou a specificitou. Hlavní výhodou je velmi významně kratší doba laboratorní odezvy oproti cytologii (hodiny vs. dny) a nižší personální náročnost na provedení analýzy.

V/233. Bioimpedanční analýza – přínos pro diagnózu proteino-energetické malnutrice

Tomíška M.1, Holá H.2, Tuček Š.1

1 Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno, 2 Oddělení léčebné výživy, FN Brno

Východiska: Vyšetření netukové tělesné hmoty a svalové hmoty pomocí bioelektrické impedanční analýzy (BIA) by mohlo zvýšit spolehlivost při stanovení diagnózy proteino-energetické malnutrice (PEM) i při posouzení její tíže a závažnosti. Navzdory skutečnosti, že BIA je dnes dostupná, jednoduchá a nezatěžující metoda, není pro diagnózu malnutrice rutinně využívána. Předkládaná pilotní práce si stanovila za cíl zjistit, který z řady parametrů BIA by mohl přispět ke zlepšení diagnózy PEM nad rámec běžného klinického vyšetření. Materiál a metody: V pilotní průřezové studii jsme jednorázově vyšetřili skupinu onkologických pacientů v době aktivní protinádorové léčby. U všech pacientů bylo provedeno vyšetření tělesného složení metodou BIA na přístroji InBody S10, včetně přímo měřené hodnoty fázového úhlu (PA, phase angle). Absolutní hmotnosti jednotlivých kompartmentů dle BIA byly přepočítány na indexy vytvořené analogicky s konstrukcí indexu tělesné hmotnosti (BMI). Současně byla odebrána podrobná nutriční anamnéza a provedeno klinické vyšetření nutričního stavu spolu s antropometrií na nedominantní paži a měřením maximální síly stisku ruky. Klinické údaje byly použity pro komplexní hodnocení nutričního stavu podle validovaného nástroje SGA (Subjective Global Assessment) ve vlastní modifikaci (numerická sedmibodová verze). Naměřené hodnoty podle BIA byly srovnávány s nezávisle stanovenými hodnotami SGA považovanými za zlatý standard hodnocení nutričního stavu. Výsledky: Celkem bylo vyšetřeno 72 onkologických pacientů, muži/ženy 36/36, průměrný věk 63 let, z toho 45 pacientů (62,6 %) s nádory zažívacího traktu, 21 (29,2 %) s hematologickou maligní chorobou. Podle referenční metody SGA byla zjištěna malnutrice těžkého stupně SGA C u 17 pacientů (23,6 %), středně těžká SGA B u 39 (54,2 %) a lehká/dobrý nutriční stav SGA A u 16 (22,2 %). Absolutní přímo měřená hodnota PA dle BIA (medián 3,7° ve skupině SGA C; 4,5° SGA B; 5,6° SGA A) statisticky významně rozlišovala všechny tři skupiny navzájem. Naproti tomu index svalové hmoty, stanovený dle BIA, odlišil pouze pacienty s těžkou malnutricí od ostatních, ale nedokázal rozlišit mezi malnutricí lehkou a středně těžkou. Závěr: Přímo měřená hodnota PA dle BIA má ze všech parametrů BIA nejvyšší prediktivní hodnotu ve vztahu ke komplexnímu klinickému hodnocení nutričního stavu (SGA). Kalkulované parametry netukové a svalové hmoty pravděpodobně nadhodnocují svalovou hmotu, zejména při normální tělesné hmotnosti či nadváze. Výhodou PA je její jednoduchost a rychlost stanovení proti pracné metodě SGA, která navíc vyžaduje zácvik a zkušenost vyšetřujícího.

V/267. Movember 2022 ve Fakultní nemocnici Olomouc

Kučerová V.1, Štefaničková L.1, Petrová P.1, Hynková P.1, Jindrová H.1, Hartmann I.2

1 Oddělení klinické biochemie, FN Olomouc, 2 Urologická klinika LF UP a FN Olomouc

Rakovina prostaty patří dlouhodobě k nejčastějším zhoubným nádorům u mužů, podle Ústavu zdravotnických informací a statistiky v současnosti žije v ČR více než 60 000 mužů s historií tohoto onemocnění. Dle dokumentu Onkologický profil České republiky 2023, vydaný Evropskou komisí a OECD, je výskyt tohoto onemocnění v ČR o 18,6 % vyšší, než je průměr EU. Postihuje zejména muže staršího věku, ale není výjimkou výskyt již u čtyřicátníků. Probíhá zpočátku bezpříznakově, v pokročilých stadiích metastazuje a stává se fatálním onemocněním. Pokud se nádor podaří odhalit včas, je nadějí na plné uzdravení prostatektomie. Časný záchyt onemocnění je možný díky preventivnímu fyzikálnímu vyšetření prostaty a odběrem krve na stanovení prostatického specifického antigenu (PSA). PSA je bílkovina způsobující zkapalnění ejakulátu. Pouze malá část je uvolňována do krve. V případě porušení prostatické žlázy (maligní i benigní hyperplazie, zánět) je jeho množství v krvi zvýšené. Každoročně v listopadu probíhá nejen v ČR charitativní akce Movember, jejímž cílem je mimo jiné zvýšení povědomí o rakovině prostaty. V rámci této kampaně v roce 2022 ve Fakultní nemocnici Olomouc na Oddělení klinické biochemie ve spolupráci s Urologickou klinikou a firmou Beckman Coulter proběhlo bezplatné vyšetření hladin PSA u zájemců z široké veřejnosti. V současné době se připravuje celorepublikový pilotní projekt populačního screeningu rakoviny prostaty, který by měl zahrnovat vyšetření PSA u mužů mezi 50 a 70 lety. V rámci přednášky budou publikovány výsledky této preventivní akce včetně konkrétních kazuistik. Dále postup analytického stanovení PSA a přidružených markerů.

V/278. PET/CT vyšetření s PSMA

Ďulíková Z., Kučera R.

Oddělení nukleární medicíny, MOÚ Brno

Karcinom prostaty je druhou nejčastější malignitou u mužů a představuje s počtem cca 7 000 nových případů ročně v ČR závažný zdravotnický problém. Úspěch léčby karcinomu prostaty závisí na přesné informaci o aktuálním rozsahu postižení. Karcinom prostaty nejčastěji metastazuje do uzlin nebo kostí. Diagnostická přesnost konvenčního zobrazování (scintigrafie skeletu, CT nebo MRI) je obecně limitovaná především rozměrem metastatických lézí, selhává při velikostech lézí < 1 cm. Přesné stanovení rozsahu onemocnění může mít zásadní vliv na volbu léčebného postupu. Z dostupných radiofarmak pro pozitronovou emisní tomografii (PET) je možné v rámci stagingu karcinomu prostaty v ČR použít ¹⁸F-cholin či ¹⁸F-fluciklovin. Jejich senzitivita je vyšší než u konvenčního zobrazování, avšak stále nedostatečná ke spolehlivé volbě terapeutického postupu. Radiofarmakum ⁶⁸Ga-PSMA je přípravek určený pro diagnostiku karcinomu prostaty pomocí pozitronové emisní tomografie (PET). Účelem zobrazení je lokalizace nádorových ložisek. Mechanizmem účinku je vazba na prostatický specifický membránový antigen (PSMA), což je transmembránový glykoprotein s vysokou mírou exprese v ložiscích karcinomu prostaty. Převod pozitronového záření z navázaného ⁶⁸Ga na obrazovou informaci pomocí PET/CT či PET/MR kamery umožňuje citlivou a přesnou lokalizaci a charakterizaci nádorového postižení. Senzitivita i specificita pro detekci lézí karcinomu prostaty se v mnoha studiích pohybuje kolem 90 %. Indikací k vyšetření s ⁶⁸Ga-PSMA je karcinom prostaty s předpokládanými metastázemi, u nějž se rozhoduje, zda má být použita radikální chirurgická léčba, nebo u mužů s karcinomem prostaty s podezřením na rekurenci onemocnění na základě zvýšených hodnot PSMA. Přípravek se podává intravenózně. Obvyklá diagnostická aktivita doporučená výrobcem kitu je 1,5 MBq/kg hmotnosti. Radiofarmakum se podává jednorázově před vyšetřením, obrazová akvizice začíná 60 min po aplikaci. Příprava je obdobná jako u FDG, rozsah vyšetření však zahrnuje i celou kalvu. Závěr: Přípravek ⁶⁸Ga-PSMA nebyl dosud v ČR registrován, což ale neznamená zvýšené riziko. V zahraničí se již používá, byl nashromážděn dostatek zkušeností a poznatků o jeho pozitivním přínosu v léčbě. Česká legislativa umožňuje použití neregistrovaného léčiva v rámci tzv. specifického léčebného programu. Alternativou vyšetření pomocí radiofarmaka ⁶⁸Ga-PSMA mohou být prosté zobrazovací metody nebo PET s podáním registrovaných radiofarmak (cholin, fluciklovin). Přesnost vyšetření je však u nich nižší než u ⁶⁸Ga-PSMA.

V/281. Principy použití referenčních rozmezí a rozhodovacích limitů

Selingerová I.

Oddělení laboratorní medicíny, MOÚ Brno

Laboratorní testy a interpretace jejich výsledků jsou nedílnou součástí rozhodovacího procesu. Podle údajů Střediska pro kontrolu a prevenci nemocí (CDC) je přibližně 70 % medicínských rozhodnutí založeno právě na výsledcích laboratorních testů. Základními nástroji používanými pro tyto účely jsou referenční intervaly a rozhodovací limity. Oba tyto nástroje mají nepochybně důležitou roli v laboratorní medicíně, nicméně je nutné používat je korektně a rozlišit jejich rozdíly. Referenční intervaly popisují fyziologické hodnoty dané pečlivě definované a dostatečně velké populace, obvykle zdravých jedinců. Výsledky nacházející se mimo tyto intervaly bývají označovány jako „abnormální“. Naproti tomu rozhodovací limity jsou spojeny s patofyziologickými procesy a jsou klinickými lékaři používány pro stanovení léčebného postupu. Referenční intervaly mají vysokou specificitu (obvykle 95 %) pro fyziologický stav. Je však dobré mít na paměti, že podle definice 5 % „zdravých“ jedinců bude mít výsledky mimo referenční rozmezí. Správně nastavené rozhodovací limity by měly mít vysokou senzitivitu pro onemocnění a mohou být od referenčních mezí značně vzdáleny (dokonce mohou být uvnitř referenčního intervalu). Je třeba si také uvědomit, že pro jeden laboratorní test může existovat několik různých referenčních intervalů v závislosti na tom, pro jakou populaci bude použit (např. v závislosti na pohlaví či věku). Rozdíly můžeme pozorovat také s ohledem na použitou metodu stanovení, a proto by každá laboratoř měla uvádět vlastní referenční rozmezí. Stejně tak může existovat celá sada rozhodovacích limitů pro různé klinické situace, ať už vlivem způsobu jejich určení, či vazbou na určité onemocnění. Z uvedených skutečností vyplývá, že interpretace laboratorních výsledků s využitím referenčních intervalů a rozhodovacích limitů je komplexní proces a je důležité ponechat si nadhled. Oba tyto nástroje jsou často výsledkem sofistikovaných statistických postupů a kromě jejich variability je třeba vzít v úvahu také nejistoty samotných laboratorních testů.

V/282. Biologická variabilita a její uplatnění v laboratorní medicíně

Jabor A., Franeková J., Kubíček Z.

Pracoviště laboratorních metod, IKEM Praha

Východiska: Koncentrace měřených analytů v biologických tekutinách podléhají jak cyklickým (cirkadiánní, ultradiánní, infradiánní, cirkanuální), tak necyklickým vlivům. Celkově se změny koncentrací v čase u jednoho individua dané různými biologickými vlivy shrnují pod pojem intraindividuální biologická variabilita (within-subject biological variation) charakterizovaný variačním koeficientem CVI (v %). Analogicky je skupinová variabilita definované části populace charakterizována jako interindividuální biologická variabilita (between-subject biological variation) označovaná CVG (v %). Význam variabilit: CVG má úzký vztah k referenčním intervalům a v medicíně orientované na pacienta má menší význam. Větší význam má CVI, která má vztah k jednotlivým fázím celkového procesu vyšetřování. Pro některé výpočty se vztahem k analytice i interpretaci se CVI a CVG mohou kombinovat. V preanalytické fázi lze z CVI určit vhodný počet odběrů pro určení homeostatického bodu pacienta nebo pro upřesnění podmínek odběru tak, aby se biologická nejistota určení koncentrace analytu minimalizovala. V analytické fázi je CVI podkladem pro určení analytických specifikací v rámci milánského modelu. V postanalytické fázi lze CVI použít v laboratoři (nastavení delta check pro kontrolu po sobě jdoucích výsledků) i pro interpretaci (index individuality, reference change value neboli kritická diference, RCV). RCV kombinuje analytickou variabilitu a CVI a je rozhodujícím konceptem pro významnost změn hodnot pacienta v čase. Projekt FLM: Výstupy evropského projektu budování databáze biologických variabilit (pod záštitou European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, EFLM) jsou veřejně dostupné včetně metaanalytického zpracování hodnot CVI a CVG z literatury i možnosti výpočtu analytických specifikací podle různých modelů. Postupně se biologická variabilita prosazuje také v klinických guidelines. Obvykle se používají pevné rozhodovací limity bez uvážení biologických faktorů, ale někdy je naznačena potřeba opakovat vyšetření z důvodu vyšší biologické variability (konfirmace hraničně zvýšené koncentrace glukózy v diagnostice diabetu, až tři vzorky pro klasifikaci albuminurie). Závěr: Biologická variabilita je jedním ze základních konceptů pro interpretaci laboratorních vyšetření, ale má vztah k preanalytické, analytické i postanalytické fázi celkového procesu vyšetřování.

V/283. Odhady glomerulární filtrace u onkologických pacientů

Rajdl D.

Ústav klinické biochemie a hematologie LF v Plzni UK a FN Plzeň

Cíl: Spolehlivý odhad glomerulární filtrace (eGFR) je důležitý pro dávkování některých onkologických léků, zobrazovací vyšetření a stratifikaci rizika komplikací. Naším cílem je shrnout přístupy k odhadům glomerulární filtrace založené na sérovém kreatininu a cystatinu C u onkologických pacientů. Metody: Literární přehled s příklady z klinické praxe. Výsledky: Většina rovnic pro eGFR byla odvozena z populací pacientů bez onkologického onemocnění. Nejvíce v literatuře publikovaných důkazů ukazuje rovnice CKD-EPI pro sérový kreatinin a sérový cystatin C jako nejvhodnější. Výhody a nevýhody těchto odhadů porovnáme s novějšími rovnicemi FAS a CamGFR v2 a s dalšími alternativními přístupy.

V/286. Vyšetřovaní volné cirkulující DNA a cirkulující nádorové DNA v klinické praxi

Berkovcová J.

Oddělení onkologické patologie, MOÚ Brno

Při vyšetřování nádorových onemocnění jsou stále častěji využívány tekuté biopsie jako neinvazivní metoda s velkým klinickým potenciálem. Volnou cirkulující DNA (cfDNA) označujeme fragmenty extracelulární, většinou dvouřetězcové DNA o velikosti 70–200 bp, ale i delších (do velikosti 21 kb). Přítomnost cfDNA je možné detekovat ve všech tělních tekutinách. cfDNA je uvolňována z buněk převážně při procesech buněčné smrti, ať už se jedná o apoptózu, či nekrózu. Apoptotické buňky produkují kratší fragmenty DNA, s průměrnou velikostí 180 bp. Během nekrózy dochází k uvolnění buněčného obsahu do okolí a fragmenty DNA jsou delší, s průměrnou velikostí 10 kb. Malá část cfDNA může být produkována aktivní sekrecí buněk, kdy se do mezibuněčného prostoru dostává nukleoproteinový komplex nově syntetizované DNA. Hladinu cfDNA v periferní krvi výrazně ovlivňuje také probíhající zánět, eventuálně různá poškození buněk (např. při úrazech). Za fyziologických podmínek má asi 85 % cfDNA původ v krevních buňkách, přičemž hlavní podíl tvoří cfDNA z leukocytů. Přibližně jen 15 % cfDNA má původ v solidních tkáních, především v endoteliálních buňkách. Předpokládá se, že tento poměr u onkologických pacientů je ovlivněn postupujícím nádorovým onemocněním. U jednotlivých onkologických pacientů bude rozdílný podíl cfDNA zaujímat DNA z nádorových buněk, tzv. ctDNA (cirkulující nádorová DNA). V ní můžeme hledat specifické molekulární znaky nádorových buněk. cfDNA je obvykle izolována z krevní plazmy z nesrážlivého odběru periferní krve. Ideálně se periferní krev při odběru nechá volné stékat do zkumavky, nejlepších výtěžků je dosaženo z v pořadí druhé odebírané zkumavky. Odběr se provádí buď tradičně do zkumavek s EDTA – pak je nutné vzorek zpracovat do 1 h po odběru, nebo je z časových důvodů vhodnější realizovat odběr do speciálních zkumavek, které kromě EDTA obsahují i stabilizační roztok pro konzervaci buněk v tekutých médiích. Po odebrání krve je nutné zkumavku okamžitě 8–10× invertovat. Potom je možné krev skladovat do zpracování až 14 dní při pokojové teplotě. Při separaci plazmy v laboratoři je nutné použít protokol s dvojím točením, následně izolaci cfDNA z různých objemů plazmy. cfDNA je obvykle kvalitní, dobře se amplifikuje, její koncentrace je však dána biologickou povahou vzorku. Zvláště při negativních výsledcích není zcela jasné, zda hledaná varianta není ve vzorku přítomna nebo je pod limitem detekce. Cílem je tedy zvyšovat senzitivitu vyšetřujících metod.

Podpořeno MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

V/287. Onkomarker je pozitivní, a co dál? Situace z klinické praxe

Gescheidtová L.

Oddělení laboratorní medicíny, MOÚ Brno

Východiska: Onkomarkery představují v klinické biochemii širokou skupinu analytů a v klinické praxi velmi různorodě využívaná vyšetření. Na první pohled se jeví jako skvělý jednoduchý, dostupný a neinvazivní vyšetřovací prostředek. Mnoho lékařů, kteří je ordinují, jsou jen málo obeznámeni s problematikou využití onkomarkerů. Jejich uvážlivé objednávání totiž vyžaduje dostatek zkušeností a přesah do dalších odborností. Výsledek pod cut off hodnotou vzbuzuje falešný pocit klidu, výsledek nad cut off hodnotou spouští alarm, na který však mnohdy není snadné adekvátně reagovat. Každý onkomarker je pouze střípek diagnózy. Zde uvádím tři příklady klinického managementu, který následoval po zjištění tzv. pozitivity onkomarkeru (tedy hodnoty nad cut off). Případy: 1) 56letá pacientka odeslaná na onkologické pracoviště registrujícím gynekologem pro pozitivitu CEA. Dle žádanky odebráno v rámci prevence. Tento laboratorní nález vedl k provedení kolonoskopie, gastroskopie, a nakonec k celotělovému PET/CT. Bez nálezu malignity; 2) 64letá klientka centra prevence, během preventivní prohlídky se zaměřením na vyhledávání nádorových onemocnění zjištěna lehká elevace CA 19-9, 50,6 kU/l (cut off 40,0). Doporučena kontrola praktickým lékařem, který s odstupem znovu odebral CA 19-9 a nechal vyšetřit jinou laboratoří, která změřila odlišným analytickým systémem hodnotu 86,4 kU/l. Výsledek nesprávně interpretován jako nárůst. Při opakovaném vyšetření původní laboratoří změřena hodnota 59,5 kU/l, tedy bez významné dynamiky; 3) 28letý pacient revmatologické ambulance došetřovaný pro bolesti kloubů, subfebrilie a dlouhodobou elevaci CRP nereagující na antibiotika. V rámci diferenciální diagnostiky odebrány onkomarkery a zjištěna lehce zvýšená CA 19-9 a CA 72-4. Z toho důvodu provedena gastroskopie s nálezem zánětu bulbu duodena, bez známek malignity. V kontrolních odběrech oba onkomarkery pod cut off hodnotou a od dalšího endoskopického došetřování upuštěno. Závěr: Ve všech třech případech byla správnost indikace vyšetření onkomarkerů otazná a jejich pozitivita vedla k různě rozsáhlému vyšetřovacímu procesu. Naprostá většina onkomarkerů má svůj klinický přínos pro monitorování pacienta s již zjištěnou nádorovou diagnózou. Prevencí před excesivním došetřováním či stresováním pacienta při „pozitivním“ výsledku je důsledně uvážlivé indikování onkomarkerů u pacientů, kteří doposud nemají nádorovou diagnózu a jsou vyšetřováni preventivně nebo pro nespecifické obtíže. V praxi jsou rovněž velmi opomíjené biochemicko-analytické aspekty vyšetření.

V/288. Využití parametru ICIS (Intensive Care Infection Score) pro diagnostiku sepse

Vytisková S.1, Lacková M.2, Klinerová J.1, Pospíšilová Š.1, Bourková L.1, Beňovská M.3, Buliková A.1

1 Oddělení klinické hematologie, FN Brno, 2 Přírodovědecká fakulta, MU Brno, 3 Ústav laboratorní medicíny, FN Brno

Sepse je závažný a život ohrožující stav, jehož včasná a přesná diagnostika je klíčová pro zahájení účinné terapie a snížení rizika mortality. V současnosti je k dispozici velké množství biomarkerů, které se pro včasnou diagnostiku sepse jeví jako užitečné, ale žádný z nich není pro průkaz sepse specifický. V tomto případě je vhodné kombinovat dostatečně senzitivní a dobře dostupné laboratorní testy a korelovat je s klinickým stavem pacienta. ICIS (Intensive Care Infection Score) je nový parametr hematologického analyzátoru Sysmex XN a je považován za časný marker sepse, který dokáže rychle a spolehlivě odlišit sepsi a neinfekční systémovou zánětlivou reakci organizmu (SIRS) v prvních kritických 48 hodinách. ICIS skóre je vypočteno kombinací pěti parametrů, které se běžně získávají v rámci standardního vyšetření krevního obrazu, vč. diferenciálního rozpočtu leukocytů a retikulocytů. Mezi tyto parametry patří počet neutrofilních segmentů (sN#), intenzita fluorescence neutrofilů (sNFI), počet nezralých granulocytů (IG), počet plazmatických buněk (ASL), rozdíl hemoglobinu v retikulocytech a erytrocytech (DHgb). ICIS může nabývat hodnot 0–20, přičemž hodnoty > 4 jsou spojeny s vyšším rizikem rozvoje sepse. Klinické využití tohoto parametru se jeví velmi užitečné zejména při vyhodnocení rizika počínající sepse, jelikož ICIS dokáže reflektovat zvýšené nároky imunitního systému na kostní dřeň při zánětlivém procesu. Parametr ICIS byl opakovaně vyšetřen u 284 pacientů v průběhu roku 2022 na analyzátoru Sysmex XN na OKH FN Brno. Retrospektivně byla analyzována korelace mezi zvýšeným ICIS u 86 pacientů a vývojem klinického stavu do sepse. Cílem práce bylo vyhodnotit korelaci mezi vysokým ICIS a rizikem sepse a mortality pacientů. Z 284 pacientů byl ICIS nad 4 potvrzen u 86 pacientů. U 84 % z nich byla potvrzena infekce, u 40 % pacientů byla prokázána sepse a mortalita v tomto souboru dosáhla 34 %. ICIS je možné použít v rámci diagnostiky sepse jako další vyšetření k již používaným markerům (presepsin, Il-6, prokalcitonin) již na počátku klinické rozvahy. Dokáže odhalit infekční sepsi, a napomáhá tak k včasnému zahájení antibiotické terapie. Navíc díky tomu, že se tento parametr získává při vyšetření krevního obrazu s diferenciálem leukocytů a retikulocytů, je toto vyšetření velmi rychlé a finančně nenákladné.

V/329. Nové možnosti detekce lidského papilomaviru pomocí techniky LAMP a elektrodových biočipů

Strmisková J.1, Izadi N.1, Moráňová L.1, Sebuyoya R.1, Hrstka R.1, Anton M.2, Bartošík M.1

1 RECAMO, MOÚ Brno, 2 Gynekologicko-porodnická klinika LF MU a FN Brno

Východiska: Onkogenní (tzv. high-risk, HR) kmeny lidského papilomaviru (HPV) jsou významnými původci nádorových onemocnění, zejména karcinomu hrdla děložního, bývají ale také detekovány u anogenitálních či orofaryngeálních nádorů. Nejčastěji se vyskytujícími HR-HPV jsou kmeny HPV16 a HPV18. Ve většině případů bývá HPV po infekci epiteliálních buněk brzy odstraněn imunitním systémem, méně často ale může v buňkách perzistovat a po delším časovém období se začlenit do hostitelského genomu. Cílem práce je vyvinout rychlou, levnou a jednoduchou metodu detekce HPV a stávající metody obohatit o možnosti odhadu progrese onemocnění u prekanceróz. Materiál a metody: Vyvíjené detekční metody jsou založeny především na izotermálních amplifikačních technikách, jako je např. LAMP (loop-mediated isothermal amplification), a na elektrochemickém stanovení (EC). Testování je prováděno na vzorcích DNA a RNA z buněčných linií a cervikálních stěrů. Výsledky: Na základě našich předchozích článků na detekci DNA HPV16 a HPV18 [1,2], se nyní zabýváme možnostmi rozšíření těchto EC testů o určení stavu integrace virové DNA a s ní související predikci progrese onemocnění. Na základě zjištěných expresních profilů mRNA genů E7 a E2 lze odhalit míru integrace virové DNA do hostitelského genomu [3]. Paralelně k tomu provádíme štěpení celkové DNA vzorků exonukleázou V, která rozštěpí lineární DNA, ale nepoškodí kruhovou DNA, tj. v našem případě epizomální virovou (neintegrovanou) DNA, příp. zpětně vyštěpenou integrovanou DNA (tzv. extrachromosomální DNA) [4]. Závěr: Kombinace LAMP a elektrochemie by mohla být zajímavá pro méně vybavená pracoviště díky nižší náročnosti na instrumentaci. Rozšíření informační hodnoty testu by mohlo pomoci k přesnější diagnostice a odhadu rizika progrese onemocnění.

Práce byla podpořena projekty AZV NU21-08-00057, BBMRI-CZ no. LM2018125 a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

Literatura: [1] Anton M, Moráňová L, Hrstka R et al. Application of an electrochemical LAMP-based assay for screening of HPV16/HPV18 infection in cervical samples. Anal Methods 2020; 12 (6): 822–829. doi: 10.1039/c9ay02383f. [2] Izadi N, Sebuyoya R, Moráňová L et al. Electrochemical bioassay coupled to LAMP reaction for determination of high-risk HPV infection in crude lysates. Anal Chim Acta 2021; 1187: 339145. doi: 10.1016/j.aca.2021.339145. [3] Kahla S, Kochbati L, Chanoufi MB et al. HPV-16 E2 physical status and molecular evolution in vivo in cervical carcinomas. Int J Biol Markers 2014; 29 (1): e78–e85. doi: 10.5301/jbm.5000051. [4] Zhou L, Qiu Q, Zhou Q et al. Long-read sequencing unveils high-resolution HPV integration and its oncogenic progression in cervical cancer. Nat Com 2022; 13: 2563. doi: 10.1038/s41467-022-30190-1.

V/344. Srovnání měření chromograninu A imunochemickou metodou ELISA při přechodu na novou generaci reagencie

Hynková P., Kučerová V., Petrová P.

Oddělení klinické biochemie, FN Olomouc

Východiska: Chromogranin A (CgA) je kyselý glykoprotein vyskytující se v normálních a neoplastických neuroendokrinních tkáních. Účastní se mnoha intra- a extracelulárních procesů, především na úrovni regulace, ukládání a sekrece vybraných hormonů a peptidů v buňce. Mimo buňku pravděpodobně působí jako prohormon a účastní se rovněž procesů spojených s adhezí a regulací vývoje neuroendokrinní tkáně. CgA se vyskytuje v séru, plasmě a moči pacientů s neuroendokrinními malignitami, je zde přímá korelace mezi sérovou hladinou CgA a nádorovou masou. Cíl: Cílem studie bylo porovnat naměřené hodnoty chromograninu A na dvou soupravách téhož výrobce a zajistit návaznost při přechodu ze stávající soupravy CGA-ELISA (Cisbio Bioassays) na novou generaci CGA-ELISA-NG (Cisbio Bioassays), kde došlo ke zkrácení inkubačních časů. Materiál a metody: Měření bylo stanoveno imunoanalyticky metodou ELISA pomocí reagenčních souprav firmy Cisbio Bioassays na analyzátoru Evolis (BioRad). Imobilizovaná monoklonální protilátka na mikrotitrační destičce zachycuje proteiny CGA obsažené ve vzorcích. Zachycené proteiny jsou po promytí rozpoznány druhou monoklonální protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (HRP). Po druhé inkubaci se nenavázaná činidla odstraní promytím, přidá se HRP substrát a TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidin) za vzniku barevné reakce, která se odečítá při 450 nm. Naměřené hodnoty absorbance jsou přímo úměrné koncentraci CGA ve vzorku. Výsledky: Hladiny chromograninu A byly srovnávány ve vzorcích séra na různých koncentračních hladinách oběma soupravami. Celkem bylo vyšetřeno 54 vzorků pacientů. Bylo provedeno párové porovnání regresní analýzou (lineární regrese) a Bland-Altmanovými grafy. Korelační analýza prokázala těsnost shody měření sledovaných reagenčních souprav, kdy korelační koeficient je R2 = 0,9584. Závěr: Porovnání výsledků použitých souprav ukazuje dobrou vzájemnou porovnatelnost v nízkých koncentracích. Při hodnotě CGA nad 500 µg/l vykazuje souprava nové generace nižší hodnoty.