Efekt troch rôznych elicitorov na produkciu sanguinarínu suspenznými kultúrami nízko-morfínovej odrody maku siateho (Papaver somniferum L.)

Súhrn

Práca sa orientuje na hodnotenie efektu troch rôznych elicitorov na produkciu sanguinarínu suspenznými kultúrami odvodenými z nízko-morfínovej odrody maku siateho. Ako elicitory sa použili CdCl₂, metyljazmonát a homogenát z fytopatogénnej huby Botrytis cinerea, ktoré sa aplikovali do živného média 11-dňových suspenzných kultúr. Efekt elicitorov na tvorbu sanguinarínu sa monitoroval po 24, 48 a 2 h ich pôsobenia. Najvyššia produkcia sanguinarínu sa pozorovala po 48 h expozícii biotickým elicitorom z Botrytis cinerea, ktorý zvýšil tvorbu sanguinarínu v suspenzných kultúrach 5,3-krát. V prítomnosti 1 mmol.l^-1 CdCl₂ sa obsah sanguinarínu v suspenzných kultúrach zvyšoval lineárne a po 72 h bol 2,3-krát vyšší ako v neelicitovaných kultúrach. Suspenzné kultúry maku po elicitácii metyljazmonátom reagovali miernym nárastom produkcie sanguinarínu po 24 a 8 h. Výrazné zvýšenie tvorby tohto sekundárneho metabolitu sa v bunkách suspenzných kultúr zistilo až po jeho 72 h pôsobení a produkcia sanguinarínu bola 3-krát vyššia ako v neelicitovaných kultúrach.

Kľúčové slová:
sanguinarín – metyljazmonát – Botrytis cinerea – CdCl₂ – elicitácia – mak siaty

Úvod

Alkaloidy sú rôznorodou skupinou sekundárnych metabolitov, obsahujúcich dusík a nachádzajúcich sa v asi 20 % rastlinných druhov. Väčšina biochemického výskumu v oblasti rastlinných sekundárnych metabolitov sa zameriava hlavne na šesť skupín alkaloidov, a to benzylizochinolínové, monoterpénové indolové, tropánové, purínové, pyrolizidínové a chinolizidínové alkaloidy ¹⁾. Vďaka ich výrazným biologickým účinkom sú alkaloidy dlho využívané ako liečivá, stimulanty, narkotiká a jedy. Najmä farmakologické atribúty a sociálno-ekonomický význam alkaloidov maku siateho (Papaver somniferum L.) boli ocenené už dávnymi civilizáciami ²⁾. Rastlina maku siateho zostáva aj v súčasnej dobe jediným komerčným zdrojom pre izoláciu analgetického morfínu, antitusického kodeínu a ebaínu, používaného na prípravu semi-syntetického oxykodónu ³⁾. Globálny dopyt po opiátoch na báze morfínu sa z roka na rok zvyšuje ⁴⁾, čo vedie k hľadaniu nových zdrojov pre ich izoláciu. Sľubnými sa ukazovali in vitro kultúry maku siateho. Veľkým sklamaním však bolo zistenie, že dediferencované bunky maku siateho nie sú schopné tvoriť morfín ⁵⁾, a preto sú ako zdroj pre izoláciu morfínových alkaloidov nevyužiteľné.

In vitro kultúry maku siateho produkujú iný farmakologicky významný alkaloid – sanguinarín, ktorý našiel svoje uplatnenie aj v terapeutickej praxi ^{6, 7)}. Až na výnimky, charakteristickým problémom rastlinných in vitro kultúr je nízka produkcia sekundárnych metabolitov. Podmienky zabezpečujúce zvýšenie produkcie sekundárnych metabolitov (alkaloidov, terpenoidov, fenolických látok) in vitro kultúrami, možno regulovať rôznymi spôsobmi ako napr. zmenou zloženia rastového média, úpravou pH, teploty, svetelného režimu a tiež využitím elicitorov ⁸⁾. Elicitácia je jedným z efektívnych biotechnologických postupov na zvýšenie produkcie sekundárnych metabolitov. Okrem biotechnologického významu, našla elicitácia využitie aj pri štúdiu obranných a signalizačných dráh pri interakciách rastlina – stresor v podmienkach in vitro ⁹⁾.

Cieľom našej práce bola evaluácia efektu vybraných typov elicitorov na produkciu sanguinarínu suspenznými kultúrami nízko-morfínovej odrody maku siateho s použitím spektrofluorometrie.

POKUSNÁ ČASŤ

Príprava a kultivácia suspenzných kultúr maku siateho

Kalusové kultúry sme odvodili zo stonkových častí sterilne vyklíčených klíčnych rastlín maku siateho cv. Gerlach. Semená sme po odmastení 70% etanolom sterilizovali 15% roztokom prípravku Savo (20 min) a o viacnásobnom opláchnutí sterilnou destilovanou vodou sme ich umiestnili na agarové živné médium podľa Murashige a Skoog ¹⁰⁾ (MS) bez rastových regulátorov. Po dosiahnutí primeranej veľkosti sme rezky použili na odvodenie kalusu. Kalusy sme kultivovali na modifikovanom živnom médiu MS obohatenom o inetín (0,3 mg.l^-1) a kyselinu α-naftyloctovú (2,0 mg.l^-1).

Suspenzné kultúry sme pripravili z alusových kultúr, ktoré sme za aseptických podmienok preniesli do tekutého živného média MS rovnakého zloženia na akom sa kultivovali kalusy. Kultiváciu sme realizovali v kultivačnej miestnosti na trepacom zariadení (150 kmitov.min^-1) pri teplote 24–26 °C, relatívnej vlhkosti vzduchu 75–80 % a difúznom osvetlení.

Aplikácia elicitorov do živného média

Na elicitáciu sme použili 11-dňové suspenzné kultúry, ktoré sme elicitovali CdCl₂, metyljazmonátom (MJ) a hydrolyzátom z mycélia fytopatogénnej huby Botrytis cinerea. Výsledná koncentrácia elicitorov v živnom médiu bola 1 mmol.l^-1 CdCl₂, 100 μmol.l^-1 MJ a hydrolyzát z Botrytis cinerea (glukózový ekvivalent 20 μg.ml ¹) sme pridávali v objeme 1 ml na 60 ml živného média. Elicitory sme aplikovali za aseptických podmienok v boxe s laminárnym prúdením vzduchu a banky sme následne umiestnili na trepacie zariadenie (150 kmitov.min^-1). Dĺžka pôsobenia elicitorov bola 24, 48 a 2 h. Po ich uplynutí sme bunky filtráciou oddelili od živného média a skladovali pri -20 °C.

Izolácia, identifikácia a stanovenie obsahu sanguinarínu

Obsah sanguinarínu sme stanovili ako v neelicitovaných, tak aj v licitovaných suspenzných kultúrach. Na izoláciu, identifikáciu a kvantitatívne stanovenie sanguinarínu v bunkách suspenzných kultúr sme použili postup podľa Balažová a kol. ¹¹⁾.

Štatistika

Hodnoty uvádzame ako priemery z piatich paralelných experimentov s príslušnými hodnotami smerodajných odchýlok. Na vyhodnotenie experimentov sme použili Studentov nepárový t-test v programe STABEX/ EXCEL. Za hladinu štatistickej významnosti sme zvolili p < 0,05.

VÝSLEDKY A DISKUSIA

Za účelom izolácie morfínu sú pre farmaceutický priemysel zaujímavé odrody s vysokým obsahom morfínu. Odrody s nízkym obsahom morfínu sú určené pre produkciu semien a využitie v potravinárskom priemysle ¹²⁾. Aj keď tieto odrody majú nízky obsah morfínu, môžu sa použiť pre experimentálne práce súvisiace s produkciou iných typov benzylizochinolínových alkaloidov, ako napr. sanguinarínu, ktoré sú tiež využiteľné vo farmaceutickej praxi. Tvorba sekundárnych metabolitov samotnými bunkami suspenzných kultúr závisí od dĺžky ich kultivácie, tiež od časti rastliny, z ktorej sú odvodené, ako aj od použitej odrody ¹³⁾.

V našej práci sme použili suspenzné kultúry maku siateho cv. Gerlach, ktorý patrí medzi slovenské nízko-morfínové odrody s 0,38% obsahom morfínu v sušine toboliek ¹⁴⁾. Na stimuláciu tvorby sanguinarínu v bunkách suspenzných kultúr maku sme použili tri rôzne elicitory, z ktorých chlorid kademnatý ¹⁵⁾ a metyljazmonát sa radia do skupiny abiotických elicitorov, kým  Botrytis cinerea je elicitorom biotickým ¹⁶⁾. Suspenzné kultúry maku siateho po ovplyvnení rôznymi elicitormi akumulujú v bunkách benzofenantridínový alkaloid sanguinarín ^{7, 16, 17)}.

Aplikáciou 1 ml homogenátu z fytopatogénnej huby Botrytis cinerea do živného média sa zvýšila produkcia sanguinarínu suspenznými kultúrami maku siateho už po 24 h. Počas 72 h elicitácie sme najvyšší obsah sanguinarínu stanovili po 48 h (38,53 ± 4,45 μg.g^-1 č.h.). Produkcia sanguinarínu sa v bunkách zvýšila 5,3-krát oproti neelicitovaným kultúram. Elicitované bunky si zvýšenú produkciu sanguinarínu zachovali aj po 72 h (36,65 ± 4,17 μg.g^-1 č.h.) od aplikácie elicitora (obr. 1). V 0-dňových suspenzných kultúrach odvodených od farmaceuticky významnej odrody maku siateho Lazúr, sa po elicitácii homogenátom z Botrytis cinerea zvýšila produkcia sanguinarínu 9-krát po 48 h jeho pôsobenia ¹¹⁾. Avšak obsah sanguinarínu u drody Lazúr ¹¹⁾ bol aj po elicitácii nižší ako u testovanej odrody Gerlach. Rovnako ako suspenzné kultúry maku siateho, aj suspenzné kultúry iných rastlín z čeľade Papaveraceae (Eschscholtzia californica) zvyšujú produkciu sanguinarínu po elicitácii biotickým elicitorom ¹⁸⁾.

Abiotické elicitory CdCl₂ a J, na rozdiel od elicitora biotického, stimulovali tvorbu sanguinarínu s rôznym časovým odstupom. V suspenzných kultúrach vystavených vplyvu 1 mmol.l^-1 CdCl₂ sme pozorovali lineárny vzostup produkcie sanguinarínu. Obsah tohto alkaloidu sa v licitovaných kultúrach zvýšil 1,3-násobne po 24 h, po 48 h to bol 1,6-násobok a najvyšší obsah sme stanovili po 72 h (17,52 ± 2,75 μg.g^-1 č.h.), čo je 2,3-krát viac ako v neelicitovaných kultúrach (obr. 2). Podobne ako v prípade suspenzných kultúr maku siateho, aj v in vitro kultúrach Catharanthus roseus a Gloriosa superba sa zvýšila tvorba ajmalicínu ¹⁵⁾ a kolchicínu ¹⁹⁾ po elicitácii CdCl₂. Optimálnymi koncentráciami CdCl₂, ktoré stimulujú tvorby sekundárnych metabolitov v rastlinných suspenzných kultúrach sú koncentrácie do 1 mmol.l^{-1 15,19)}.

Metyljazmonát, ktorý sa spolu s kyselinou jazmónovou priamo zúčastňuje transdukčných procesov ²⁰⁾, sme do živného média aplikovali vo výslednej koncentrácii 100 μmol.l^-1. V porovnaní s kultúrami elicitovanými CdCl₂ sme v kultúrach elicitovaných metyljazmonátom pozorovali len mierne zvýšenú tvorbu sanguinarínu po 24 a 48 h jeho pôsobenia. Po 72 h elicitácie sa obsah sanguinarínu signifikantne zvýšil (23,62 ± 2,87 μg.g^-1 č.h.) a celková produkcia tohto alkaloidu stúpla trojnásobne oproti tvorbe v neelicitovaných kultúrach (obr. 3). Podobný priebeh produkcie sanguinarínu sa pozoroval aj u suspenzných kultúr Eschscholtzia californica po elicitácii metyljazmonátom ¹⁸⁾. Tento oneskorený vzostup tvorby sanguinarínu sa vysvetľuje nízkou aktivitou dihydrobenzofenantridínoxidázy (DBOX), ktorá katalyzuje konverziu dihydrosanguinarínu na sanguinarín a jej expresia nebola indukovaná v etyljazmonátom elicitovaných suspenzných kultúrach Eschscholtzia californica ¹⁸⁾.

ZÁVER

Z použitej trojice elicitorov najefektívnejšie stimuloval tvorbu sanguinarínu v suspenzných kultúrach maku siateho homogenát z ycélia fytopatogénnej huby Botrytis cinerea. Výsledný efekt metyljazmonátu a CdCl₂ na tvorbu sanguinarínu bol po 72 h ich pôsobenia porovnateľný. Nakoľko bol elicitačný účinok uvedených abiotických elicitorov slabší v porovnaní s elicitorom biotickým, sú preto tieto elicitory menej vhodné na stimuláciu sekundárneho metabolizmu v suspenzných kultúrach maku siateho. Odroda maku siateho Gerlach sa v podmienkach in vitro ukázala ako lepší producent sanguinarínu v porovnaní s odrodou Lazúr, ktorého tzv. maková slama sa používa ako priemyselná surovina pre izoláciu morfínu.

Adresa pro koresdpondenci:

PharmDr. Andrea Balažová, PhD.

Katedra bunkovej a molekulárnej biológie liečiv FaF UK

Kalinčiakova 8, 832 32 Bratislava, Slovenská republika

e-mail: balazova@fpharm.uniba.sk

Došlo 7. června 2011 / Přijato 7. července 2011