Analytické hodnotenie mono[{3-[4-(2-etoxyetoxy)--benzoyloxy]-2-hydroxypropyl}-terc-butylamónium]fumarátu

Súhrn

Predmetom publikácie je komplexné spektrálne a fyzikálno-chemické hodnotenie mono[{3-[4-(2-etoxyetoxy)-benzoyloxy]-2-hydroxypropyl}-terc-butylamónium]fumarátu, potenciálneho ultrakrátko pôsobiaceho blokátora ß₁-adrenergných receptorov. Totožnosť hodnotenej zlúčeniny (pracovne označenej ako UPB-2) bola potvrdená ¹H-, ¹³C-NMR a IR spektrami. V rámci stanovenia základných fyzikálno-chemických charakteristík bola určená hodnota teploty topenia, rozpustnosť v spektre rozpúšťadiel, čistota (adsorpčná chromatografia na tenkej vrstve), povrchová aktivita (nepriama Traubeho stalagmometrická metóda), acidobázické charakteristiky (hodnota pK_a stanovená alkalimetrickou titráciou), hodnoty log ε (spektrofotometricky v UV//VIS oblasti), ako aj hodnotenie vplyvu kyslého a zásaditého prostredia na stabilitu UPB-2. Ďalšími experimentálne stanovenými parametrami boli lipohydrofilné deskriptory určené pomocou RP-HPLC (log k’), shake flask metódou stanovené hodnoty rozdeľovacích koeficientov P_exp (resp. log P_exp) v rôznych rozdeľovacích systémoch. Na základe log P_exp-údajov bola predpovedaná schopnosť UPB-2 prechádzať cez hematoencefalickú bariéru. Pre stanovenie obsahu UPB-2 bola aplikovaná RP HPLC (reversed-phase HPLC) metóda vnútorného štandardu a UV/VIS spektrofotometria pri vlnovej dĺžke 260 nm (vodné prostredie) a 258 nm (prostredie metanolu).

Kľúčové slová:
ß₁-blokátory • analytické hodnotenie • spektrálna a fyzikálno-chemická charakteristika • stanovenie obsahu

Úvod 

Používanie niektorých antagonistov ß-adrenergných receptorov (ß-blokátorov, ßB) pri liečbe pacientov s akútnou myokardiálnou ischémiou môže viesť k srdcovému zlyhaniu, sínusovej bradykardii, progresívnej atrioventrikulárnej blokáde alebo k bronchospazmom¹⁾. Spomínané komplikácie nie sú často pred samotnou terapiou s ßB predpovedateľné, môžu byť dôsledkom priamej depresie myokardu a jeho funkcií ako aj špecializovaných konduktívnych tkanív. Zároveň relatívne dlhé pôsobenie štandardných ßB znemožňuje pohotovú elimináciu takýchto nežiaducich účinkov^{1, 2)}. Preto snaha výskumných tímov smerovala a smeruje k projekcii, príprave a hodnoteniu takých ßB, ktoré by sa vyznačovali okamžitým nástupom účinku, možnosťou titrovania dávky a relatívne krátkou dobou trvania ich pôsobenia. Esmolol je hydrofilným kardioselektívnym antagonistom ß₁-adrenergných receptorov (ß₁/ß₂ = 33) bez vnútornej sympatomimetickej aktivity s polčasom eliminácie (T_1/2) približne 9 minút. Tento relatívne krátky T_1/2 je spôsobený hydrolýzou prítomnej esterovej väzby sérovými a tkanivovými esterázami^{3, 4)}. Časovo limitované trvanie účinku esmololu umožňuje pri intravenóznej aplikácii rýchle titrovanie dávky pre dosiahnutie optimálnej ß-adrenergnej blokády¹⁾. Vo vysokých dávkach však môže spôsobiť priamu kardiodepresiu, hypotenziu a srdcové zlyhanie^{1, 3, 4)}. Ešte kratší T_1/2 (približne 4 minúty) je prisudzovaný landiololu, vysokoselektívnemu ßB (ß₁/ß₂ = 255), ktorý v porovnaní s esmololom⁵⁾ vykazuje in vivo deväťnásobne účinnejšiu blokádu ß-adrenergných receptorov a in vitro osemnásobne vyššiu kardioselektivitu. Súčasne má landiolol aj rýchlejší nástup účinku ako aj elimináciu pri miernejšom negatívnom inotropnom pôsobení^{6, 7)}.

Cieľom predkladanej práce, analytického hodnotenia mono[{3-[4-(2-etoxyetoxy)-benzoyloxy]-2-hydroxypropyl}-terc-butylamónium]fumarátu (pracovne označeného ako UPB-2) je rozšíriť spektrum poznatkov o (potenciálnych) ultrakrátko pôsobiacich ßB z hľadiska určenia ich spektrálnych a fyzikálno-chemických parametrov využiteľných nielen v rámci QSAR štúdií, ale aj spätne v projekcii nových potenciálnych liečiv ovplyvňujúcich kardiovaskulárne funkcie. 

Experimentálna časť

Spektrálna časť 

¹H- a ¹³C-NMR spektrometria 

Použité chemikálie

Deuterovaná voda (rozpúšťadlo), ako vnútorný štandard bol použitý tetradeutero-3-trimetylsilylpropionát (Fluka AG, Buchs, Švajčiarsko; (CH₃)₃SiCD₂COONa, M_r = 172,27). Pripravili sa roztoky hodnotenej substancie UPB-2 s koncentráciou 2 mg/650 μl D₂O. 

Prístroje a zariadenia

NMR spektrometer Varian Gemini 2000 (Varian, New Jersey, USA), magnet Oxford 300 MHz (Oxford, Veľká Británia). 

Parametre pri meraní ¹H-NMR spektier

Rozsah = 13 – -1 ppm, aktivačný čas = 3 s, počet akvizícií = 32, delay = 1 s, pracovná teplota = 20 °C. 

Parametre pri meraní ¹³C-NMR spektier

Rozsah = 240 – -20 ppm, aktivačný čas = 1,815 s, počet akvizícií = 10 000, delay = 1 s, pracovná teplota = 20 °C.

¹H-NMR (300 MHz) δ (ppm): 1,24 (t, 3H, CH₂CH₃, J = 7,0 Hz); 1,34 (s, 9H, C(CH₃)₃); 2,96–3,02 (m, 2H, CH₂NH₂⁺C(CH₃)₃); 3,55–3,62 (kva, 2H, CH₂CH₃, J = 7,0 Hz); 3,79 (t, 2H, CH₂OCH₂CH₂, J = 4,7 Hz); 4,15 (t, 2H, CH₂CH₂OAr, J = 4,8 Hz); 4,25–4,39 (m, 2H, (OH)CHCH₂NH₂⁺); 4,40–4,50 (m, 1H, CH(OH)); 6,67 (s, 1/2, fumarát, 1H, CH=CH); 6,90; 6,93 (d, 2H, OArH, J = 8,9 Hz); 6,70–7,20 (broad peak, 3H, (OH), NH₂⁺); 7,95; 7,98 (d, 2H, ArHCOO, J = 8,9 Hz).

¹³C-NMR (75 MHz) δ (ppm): 15,14 (CH₃CH₂O); 26,10 (NH₂⁺C(CH₃)₃); 45,60 (CH₂NH₂⁺); 55,51 (C(CH₃)₃); 65,49 (CH₃CH₂O); 66,21 (OCH₂CH(OH)); 66,89 (CH₃CH₂OCH₂CH₂OAr); 67,59 (CH₃CH₂ OCH₂CH₂OAr); 68,70 (CH(OH)); 114,27 (2C, OCArC₂); 122,12 (1C, ArCCOO); 131,74 (2C, ArC₂CCOO); 136,35 (fumarát, CH=CH); 162,76 (1C, OArC); 166,03 (COO); 173,11 (fumarát, COO). 

IR spektrometria 

Prístroje a zariadenia

Spektrometer FT-IR Impact 400D (Nicolet), merané v tabletách bromidu draselného v koncentrácii 2–3 mg látky/800 mg KBr.

IR cm^-1: ν_as(C–H): 2972; ν_s(C–H): 2864; ν(C=O): 1699; ν_as(C=C): 1607; δ(N-H): 1508; δ(CH₂): 1457; ν(C–N)_sek. N: 1353, 1280; ν_as(C–O–C): 1171 (1118); ν(C–O)_es: 1251, 1053; γ(C–H): 767, 660; v IR spektre nebola nepozorovaná vibrácia ν(NH₂⁺) predpokladaná približne okolo 2700; δ(NH₂⁺): 1600–1575 v prekryve; ν(C–OH): skryté v oblasti 1450–1500. 

Spektrofotometria v UV/VIS oblasti 

Použité chemikálie

Destilovaná voda, metanol p.a. (CentralChem, Bratislava, SR). 

Príprava roztokov

Pripravili sa vodné a metanolové roztoky⁸⁾ študovanej látky UPB-2 s c = 1 × 10^-5 mol.l^-1. 

Prístroje a zariadenia

Analytické váhy Chyo JL-180 (Chyo Balance Corporation, Japonsko), UV/VIS spektrofotometer (8452 A, diode array spectrophotometer, typ Vectra 286/12) s kremennými kyvetami hrúbky 1 cm, osobný počítač, vyhodnocovací softvér (HP 845 × UV-Visible System). 

Pracovný postup

Absorpčné spektrum UPB-2 sa meralo v destilovanej vode ako aj v metanole. Na základe Lambert-Beerovho zákona sa vypočítali hodnoty ε, resp. log ε pre všetky absorpčné maximá v obidvoch zvolených médiách.

UPB-2, vodné prostredie – UV λ_max nm (absorbancia; log ε): 198 (1,29180; 5,11), 260 (0,88861; 4,95). UPB-2, metanolové prostredie – UV λ_max nm (absorbancia; log ε): 210 (0,87086; 4,94), 258 (0,89619; 4,95). 

Analytická časť 

Stanovenie teploty topenia 

Prístroje a zariadenia

STUART SMP 11 (Lennox Laboratory Suppliers, Dublin, Írsko).

Pracovný postup

Teplota topenia UPB-2 bola stanovená po 24-h sušení v exsikátore nad P₂O₅ pri tlaku 10 kPa a laboratórnej teplote, jej hodnoty sú uvedené v tabuľke 1.

 

Stanovenie rozpustnosti 

Použité chemikálie

Destilovaná voda, metanol p.a. (CentralChem, Bratislava, SR), lieh 96 % (Lachema, Brno, ČR), kyselina chlorovodíková s c = 0,1 mol.l^-1 (CentralChem, Bratislava, SR), hydroxid sodný s c = 0,1 mol.l^-1 (CentralChem, Bratislava, SR), chloroform p.a. (CentralChem, Bratislava, SR), acetón p.a. (Central Chem, Bratislava, SR), dietyléter p.a. (CentralChem, Bratislava, SR), dimetylsulfoxid p.a. (Lachema, Brno, ČR). 

Prístroje a zariadenia

Analytické váhy Chyo JL-180 (Chyo Balance Corporation, Japonsko). 

Pracovný postup

Rozpustnosť študovanej látky UPB-2 bola stanovená podľa SL 1⁹⁾. Návažok látky predstavoval jednotlivo 0,0100 g pre všetky rozpúšťadlá. Postupne sa hodnotila jej rozpustnosť v destilovanej vode, v metanole, v liehu 96 %, v kyseline chlorovodíkovej s c = 0,1 mol.l^-1, v hydroxide sodnom s c = 0,1 mol.l^-1, v chloroforme, v acetóne, v dietyléteri a v dimetylsulfoxide pri laboratórnej teplote. Objem pridávaných rozpúšťadiel bol adekvátne upravený vzhľadom na zvolený návažok.

Stanovenie hodnoty R_f pomocou adsorpčnej chromatografie na tenkej vrstve 

Použité chemikálie

Lieh 96 % (Lachema, Brno, ČR), benzén p.a. (Lachema, Brno, ČR), dietylamín p.a. (Merck, Schudart, SRN), petroléter p.a. (Lach-Ner, Neratovice, ČR), dietyléter p.a. (CentralChem, Bratislava, SR), acetón p.a. (Spolchim, Bratislava, SR), propán-1-ol p.a. (Plichem, Darmstadt, SRN), cyklohexán p.a. (Lach-Ner, Neratovice, ČR), chloroform p.a. (CentralChem, Bratislava, SR), toluén p.a. (Lachema, Brno, ČR), etylacetát p.a. (CentralChem, Bratislava, SR). 

Materiál, prístroje a zariadenia

Silufol^® UV₂₅₄ s vrstvou silikagélu s rozmermi 200 × 200 mm (nastrihaný na vhodne veľké časti), sklenené komory s rozmermi 190 × 180 × 80 mm, mikrokapilára (Hamilton Bonaduz, Švajčiarsko), UV-lampa (KRUSS UV 240, 230VAC, Hamburg, SRN). 

Pracovný postup

Na komerčne vyrábané fólie Silufol^® UV₂₅₄ s vrstvou silikagélu sa na vyznačený štart mikrokapilárou naniesli 2 μl 1 % metanolových roztokov hodnotenej zlúčeniny UPB-2 a kyseliny p-hydroxybenzoovej (p-OHBA) ako „štandardu“, vstupnej substancie pri syntéze UPB‑2. Po ukončení vyvíjania sa chromatogramy sušili pri laboratórnej teplote a detegovali sa pod UV-lampou pri vlnovej dĺžke 254 nm⁸⁾. Výsledné hodnoty sú priemerom zo šiestich paralelných stanovení (pozri časť Výsledky a diskusia).

Skúšanými vyvíjacími sústavami boli: S₁: petroléter : dietyléter (ϕ = 1 : 2 ako aj 2 : 1); S₂: acetón : petroléter (ϕ = 2 : 3); S₃: acetón : toluén (ϕ = 1 : 2); S₄: acetón : toluén : dietylamín : chloroform (ϕ = 1 : 2 : 0,5 : 1); S₅: petroléter : dietylamín (ϕ = 8 : 2 ako aj 8 : 3); S₆: propán-1-ol : cyklohexán (ϕ = 1 : 1); S₇: etanol : benzén (ϕ = 10 : 3); S₈: chloroform : dietylamín (ϕ = 6 : 0,1); S₉: propán-1-ol : cyklohexán : dietylamín (ϕ = 5 : 5 : 0,1 ako aj 5 : 5 : 1); S₁₀: acetón : petroléter : dietylamín (ϕ = 8 : 8 : 0,1 ako aj 8 : 8 : 1); S₁₁: etanol : benzén : dietylamín (ϕ = 10 : 3 : 0,1); S₁₂: chloroform : cyklohexán : dietylamín (ϕ = 6 : 3 : 1); S₁₃: hexán : etylacetát (ϕ = 7 : 3). Optimálne hodnoty R_f pre UPB-2 a p-OHBA boli získané v sústave S₁₁. 

Stanovenie povrchového napätia 

Použité chemikálie

Destilovaná voda, metanol p.a. (CentralChem, Bratislava, SR). 

Prístroje a zariadenia

Analytické váhy Chyo JL-180 (Chyo Balance Corporation, Japonsko), sklenený Traubeho stalagmometer (Kavalier, ČR). 

Pracovný postup

Povrchové napätie UPB-2 bolo stanovené, podobne ako v práci⁸⁾, nepriamou stalagmometrickou metódou počítania kvapiek. Použitý bol sklenený Traubeho stalagmometer (Kavalier, ČR). Pripravil sa roztok UPB-2 s c = 1 × 10^-3 mol.l^-1. Ako referenčná kvapalina sa použila destilovaná voda, ktorej povrchové napätie je 0,07259 N.m^-1 pri teplote t = 21 °C. 

Stanovenie disociačnej konštanty 

Použité chemikálie

Destilovaná voda, hydroxid sodný s c = 0,1 mol.l^-1 (CentralChem, Bratislava, SR), metanol p.a. (Central Chem, Bratislava, SR). 

Prístroje a zariadenia

Analytické váhy Chyo JL-180 (Chyo Balance Corporation, Japonsko), automatická byreta OP 930, digitálny pH-meter (HANNH Instruments HI 221, SRN), mikropipeta, elektromagnetické miešadlo (Laboratorní přístroje, Praha, ČR). 

Príprava roztokov

Roztok hodnotenej látky UPB-2 bol pripravený rozpustením 0,025 g substancie v destilovanej vode na objem 50,0 ml. 

Pracovný postup

Disociačná konštanta UPB-2 bola stanovená potenciometricky alkalimetrickou titráciou s použitím automatickej byrety OP 930 spojenej s digitálnym pH-metrom. Konštantný prídavok odmerného roztoku hydroxidu sodného s c = 0,1 mol.l^-1 predstavoval 0,005 ml. Titrácia prebiehala pri teplote 21 °C. Zaznamenali sa hodnoty pH titrovaného roztoku, resp. roztokov v závislosti od pridaného množstva hydroxidu sodného. Po ukončení titrácie sa interpolačným stupňom podľa Hahna zistila presná spotreba odmerného roztoku a hodnota pri polovičnej spotrebe⁸⁾. Z priebehu potenciometrickej titrácie sa podľa vhodnej polynomickej funkcie v programe Statistica 8.0 (Stat Soft, Tulsa, USA) pomocou V_1/2 vypočítala disociačná konštanta. Výsledná hodnota pK_a pre UPB-2 je v časti Výsledky a diskusia prezentovaná ako priemer troch paralelných stanovení. 

Stanovenie logaritmu retenčného faktora k’ z RP‑HPLC 

Použité chemikálie

Dusitan sodný s c = 0,1 mol.l^-1, metanol p.a. (Central Chem, Bratislava, SR), nátriumacetát (Lachema, Brno, ČR) na úpravu mobilnej fázy. 

Prístroje a zariadenia

Chromatograf s vysokotlakovou pumpou Delta Chrom SDS 030, (Watrex, SR), slučkový dávkovač s 20-μl slučkou (Watrex, SR), kolóna s nepolárnou chemicky viazanou fázou Separon SGX C₁₈ 7 μm, 250 × 4 mm (Lachema, Brno, ČR), prietokový UV-detektor Delta Chrom UVD 200 (Watrex, SR). 

Pracovný postup

Hodnota retenčného faktora k’ (v literatúre uvádzaný aj ako kapacitný faktor k’) bola stanovená podľa práce¹⁰⁾ na kvapalinovom chromatografe s vysokotlakovou pumpou, so slučkovým dávkovačom, nepolárnou chemicky viazanou fázou a prietokovým UV-detektorom. Pre študovanú látku UPB-2 a „štandard“ p-OHBA boli použité dve mobilné fázy s rozdielnym percentuálnym zastúpením metanolu, t.j. 90 % a 95 % (pripravené z metanolu p. a. a destilovanej vody).

Chromatografické podmienky

• A. Mobilná fáza – 90% metanol upravený vodným roztokom nátriumacetátu; prietoková rýchlosť – 0,6 ml.min^-1; tlak – 7,9 MPa; vlnová dĺžka – 260 nm; pracovná teplota – 21–22 °C.
• B. Mobilná fáza – 95% metanol upravený vodným roztokom nátriumacetátu; prietoková rýchlosť – 0,6 ml.min^-1; tlak – 5,9 MPa; vlnová dĺžka – 260 nm; pracovná teplota – 21–22 °C.

Mŕtvy čas kolóny (t₀) sa stanovil roztokom dusitanu sodného s c = 0,1 mol.l^-1, ktorý mal v použitom systéme nulovú retenciu. Hodnota(-y) log k’ boli vypočítané zo vzťahu: log k’ = log [(t_R – t₀) / t₀], kde t₀ je retenčný čas roztoku dusitanu sodného s c = 0,1 mol.l^-1 a t_R je retenčný čas roztoku vzorky¹⁰⁾.

Roztoky UPB-2 boli pripravené rozpustením 0,005 g látky v metanole a upravené na objem 25,0 ml. Po odvzdušnení mobilnej fázy bol chromatografický systém premývaný približne 20 minút. Prvé dva nástreky bol roztok dusitanu sodného, potom sa aplikovali roztoky hodnotenej látky (20 μl). Každá vzorka bola aplikovaná trikrát¹⁰⁾, pre výpočet sa použila priemerná hodnota t_R. Získané hodnoty sú uvedené v tabuľke 2.

 

Stanovenie rozdeľovacieho koeficientu a výpočet niektorých molekulových deskriptorov 

Použité chemikálie

Oktán-1-ol p.a. (Merck, Schudardt, SRN), heptán p.a. (Mikrochem, Bratislava, SR), cyklohexán p.a. (Lach-Ner, Neratovice, ČR), roztok kyseliny citrónovej s c = 0,1 mol.l^‑1 (Chemapol, Praha, ČR), hydrogenfosforečnan disodný p.a. s c = 0,2 mol.l^-1 (Lachema, Brno, ČR). 

Prístroje a zariadenia

Analytické váhy Chyo JL-180 (Chyo Balance Corporation, Japonsko), mechanická trepačka (Laboratórní přístroje, Praha, ČR), UV/VIS spektrofotometer (pozri UV/VIS spektrofotometriu). 

Príprava roztokov

Tlmivý roztok s hodnotou pH = 7,2 sa pripravil zmiešaním 20,8 ml roztoku kyseliny citrónovej a 195,2 ml roztoku hydrogenfosforečnanu disodného, a potom sa hodnota pH upravila na 7,4. Základný roztok skúšanej látky UPB-2 sa pripravil navážením 0,100 g zlúčeniny, jej prenesením do 50-ml odmernej banky a rozpustením v 30–40 ml tlmivého roztoku^{8, 10)}. Po ochladení sa banka týmto roztokom doplnila na objem 50 ml. 

Pracovný postup

Rozdeľovací koeficient P_exp študovanej zlúčeniny UPB-2 bol stanovený experimentálne klasickou shake flask metódou jej vytrepaním medzi dve nemiešateľné fázy tak, ako sa postupovalo aj v publikáciách^{8, 10)}. Lipofilnú fázu reprezentoval postupne oktán-1-ol, heptán, cyklohexán a ako vodná fáza bol použitý tlmivý fosforečnanový roztok (TFR) s hodnotou pH = 7,4. U analyzovanej substancie UPB-2 sa vykonali v každom deliacom systéme tri paralelné stanovenia. 

Výpočet niektorých molekulových deskriptorov

Hodnota polárneho povrchu molekuly (PSA) a počtu akceptorov vodíkov (n_acc) pre UPB-2 (forma bázy) bola generovaná programom ChemBioDraw Ultra 11 (CambridgeSoft Corporation, Cambridge, USA); PSA = 77,02; n_acc = 6. 

Stabilita študovanej substancie UPB-2 

Pôsobenie kyslého prostredia (kyselina chlorovodíková s c = 0,1 mol.l^-1) 

Použité chemikálie

Metanol p.a. (CentralChem, Bratislava, SR), lieh 96 % p.a. (Lachema, Brno, ČR), benzén p.a. (Lachema, Brno, ČR), dietylamín p.a. (Merck, Schudart, SRN). 

Pracovný postup

Pripravilo sa 5 ml 1 % metanolového(-ých) roztoku(‑ov) UPB-2 a „štandardu“ p-OHBA, z ktorých sa odobral 1 ml, pridal sa 1 ml kyseliny chlorovodíkovej s c = 0,1 mol.l^-1. Po 5 min sa roztoky hodnotili chromatograficky na TLC. Na fóliu Silufol UV₂₅₄ sa 1,5 cm od spodného okraja nanieslo 5 μl roztokov UPB-2 a p‑OHBA. Po vyvinutí vo vyvíjacej sústave S₁₁ sa chromatogram vysušil a detegoval pod UV-lampou pri 254 nm. Získané hodnoty R_f (priemer troch paralelných stanovení) sú uvedené v diskusnej časti. 

Pôsobenie zásaditého prostredia (hydroxid sodný s c = 0,1 mol.l^-1) 

Pracovný postup

Rovnako ako pri hodnotení stability v kyslom prostredí, ale namiesto kyseliny chlorovodíkovej s c = 0,1 mol.l^‑1 sa použil hydroxid sodný s rovnakou koncentráciou. Získané hodnoty R_f (priemer troch paralelných stanovení) sú uvedené v diskusnej časti.

Pôsobenie UV/VIS žiarenia 

Pracovný postup

Pripravil sa vodný a metanolový roztok UPB-2 s c = 1 × 10^-5 mol.l^-1. V priebehu 1 h sa v 5-min intervaloch sledovali (prípadné) posuny vo vlnových dĺžkach absorpčných maxím ako aj (prípadné) zmeny v absorbanciách pri jednotlivých absorpčných maximách v obidvoch zvolených prostrediach. 

Stanovenie obsahu UPB-2

Stanovenie obsahu UPB-2 v UV/VIS oblasti spektra 

Prístroje a zariadenia

Pozri UV/VIS spektrofotometriu. 

Pracovný postup

Pripravil sa 0,002% roztok, resp. roztoky UPB-2 vo vode ako aj v metanole, ktorých spektrum sa zaznamenalo v oblasti 190–400 nm proti čistému rozpúšťadlu. Zo zásobného roztoku (0,002 %) UPB-2 sa jednotlivo odpipetovalo 2, 4, 6, 8 a 10 ml do piatich 10-ml odmerných baniek. Všetky odmerné banky sa doplnili po značku vodou, resp. metanolom a zaznamenala sa hodnota absorbancie (A) takto pripravených roztokov⁸⁾. Z nameraných hodnôt A sa zostrojila kalibračná krivka; vo vodnom prostredí pri vlnovej dĺžke λ_max = 260 nm, v metanolovom prostredí pri λ_max = 258 nm. Hodnoty koncentrácií, A a log A sú uvedené v tabuľke 3.

Vyhodnotenie výsledkov

Obsah UPB-2 sa stanovil z funkcie priamky (y = a x + b). Po zostrojení kalibračnej krivky a štatistickom vyhodnotení jednotlivé symboly znamenali: y = A (absorbancia), b = a₀ (úsek na osi y), a = a₁ (smernica priamky), x = c. Z týchto vzťahov vyplýva, že koncentrácia sa vypočíta podľa vzťahu: c = (A – a₀) / a₁. V získaných regresných rovniciach hodnota F je F-testom na testovanie štatistických hypotéz (štatistická indukcia) a n znamená počet prípadov. 

Stanovenie obsahu UPB-2 RP-HPLC metódou vnútorného štandardu 

Použité chemikálie

Metanol UV (Lachema, Brno, ČR), nátriumacetát tavený čistý (Spolana, Neratovice, ČR), vnútorný štandard – p-OHBA. 

Prístroje a zariadenia

Pozri stanovenie retenčného faktora k’ pomocou RP-HPLC. 

Chromatografické podmienky

Mobilná fáza – 90% metanol upravený roztokom nátriumacetátu; prietoková rýchlosť – 0,6 ml.min^-1; tlak – 7,7 MPa; vlnová dĺžka – 248 nm; pracovná teplota – 21 °C. 

Pracovný postup

Pripravil sa zásobný roztok UPB-2 navážením množstva 0,020 g substancie, ktoré sa kvantitatívne prenieslo do 25-ml odmernej banky a rozpustilo sa v metanole. Z tohto roztoku sa odpipetovalo do piatich 25-ml odmerných baniek postupne po 1, 2, 3, 4 a 6 ml, pridalo sa 5 ml vnútorného štandardu (pripraveného navážením 0,010 g p-OHBA, ktoré sa kvantitatívne prenieslo do 25-ml odmernej banky a doplnilo sa po značku metanolom) a doplnilo sa metanolom po značku¹⁰⁾. Pomocou dávkovacieho ventilu sa z takto pripravených roztokov na kolónu nanášal objem 20 ml. 

Vyhodnotenie výsledkov

Z pamäti počítača bol vyvolaný záznam analýzy vzorky, integrovali a opísali sa plochy zodpovedajúce analyzovanej látke (P₁) a jej vnútornému štandardu (P₂). Výsledky analýz¹⁰⁾ sa vypočítali z pomeru plôch píkov P₁/P₂ (tab. 4).

 

Výsledky a diskusia 

V predchádzajúcej publikácii¹¹⁾ bola komplexne hodnotená zlúčenina s potenciálnym ultrakrátkym antagonistickým pôsobením na ß-adrenergné receptory s pracovným označením UPB-1, v ktorej štruktúre bola bázická časť tvorená izopropylamóniovou skupinou. Podobne ako UPB-1 aj UPB-2, chemicky mono[{3-[4--(2-etoxyetoxy)-benzoyloxy]-2-hydroxypropyl}-terc--butylamónium]fumarát, ktorej vypracovanie analytického profilu je predmetom tejto publikácie, bola pripravená na Ústavě chemických léčiv FaF VFU v Brne. Jedná sa o bielu kryštalickú látku, ktorej chemická štruktúra, sumárny vzorec (bázická forma ako aj forma soli), M_r a interval teploty topenia sú prezentované v tabuľke 1. Pri syntéze UPB-2 bola použitá ako vstupná reagencia kyselina p-hydroxybenzoová (p-OHBA), ktorej niektoré experimentálne stanovené fyzikálno-chemické parametre boli už sumarizované v práci¹¹⁾ a ktorá bola aj v tomto prípade využitá pri orientačnom hodnotení čistoty látky UPB-2 pomocou adsorpčnej chromatografie na tenkej vrstve, pri stabilitných skúškach ako aj pri stanovení jej obsahu s využitím RP-HPLC.

Totožnosť hodnotenej zlúčeniny UPB-2 bola potvrdená príslušnými spektrálnymi metódami. V ¹H- a ¹³C--NMR spektre boli identifikované signály, ktoré prislúchali alkylovým fragmentom, resp. jednotlivým atómov vodíka a uhlíka v lipofilnej ako aj v bázickej oblasti molekuly. V ¹H-NMR spektre boli v intervale 6,70 až 7,20 ppm pozorované signály troch protónov, u ktorých možno predpokladať, že zodpovedajú signálom protónu OH-skupiny v spojovacom 2-hydroxypropán-1,3-diylovom reťazci a protónom NH₂⁺-skupiny. V ¹H- a ¹³C--NMR-výstupoch boli identifikované a priradené signály protónov a atómov uhlíka tvoriacich aromatický skelet molekuly ako aj príslušný fumarátový anión.

Analýza IR spektier potvrdila prítomnosť terc-butylového substituenta, lipofilného aromatického jadra ako aj karboxylu. Pás IR spektra valenčnej vibrácie (C=O)-skupiny pri 1699 cm^-1 sa môže pri UPB-2 využiť pre kvantitatívne hodnotenie, pri UPB-1 bol tento pás pozorovaný pri 1704 cm^-1.

UPB-2 je pomerne hydrofilnou zlúčeninou; je ľahko rozpustná v kyseline chlorovodíkovej s c = 0,1 mol.l^-1, v hydroxide sodnom s c = 0,1 mol.l^-1 a v dimetylsulfoxide, dobre rozpustná v destilovanej vode, mierne rozpustná v metanole a v liehu 96 %, ťažko rozpustná v chloroforme a veľmi ťažko rozpustná v acetóne a v dietyléteri. Mierne zvýšenie lipofility hodnotenej štruktúry UPB-2 v porovnaní s UPB-1, t.j. zámena izopropylu (UPB-1) za terciárny butyl (UPB-2), však spôsobilo, že UPB-2 je relatívne ťažšie rozpustná v niektorých zvolených rozpúšťadlách ako UPB-1.

Na orientačné hodnotenie čistoty UPB-2 bola okrem RP-HPLC použitá adsorpčná chromatografia na tenkej vrstve. Súčasne s UPB-2 bola chromatograficky hodnotená aj p-OHBA. Z mnohých vyskúšaných dvoj- a trojzložkových vyvíjacích sústav bola ako najvhodnejšia vyhodnotená sústava S₁₁: etanol : benzén : dietylamín (ϕ = 10 : 3 : 0,1). V systéme S₁₁ nastalo jednoznačné oddelenie ohraničených škvŕn prislúchajúcich UPB-2 (R_f = 0,34) a p-OHBA (R_f = 0,58), pričom na príslušnom „stĺpci“ UPB-2 neboli pozorované iné škvrny. V identickej vyvíjacej sústave a pri rovnakých laboratórnych podmienkach bola pre UPB-1¹¹⁾ stanovená nižšia hodnota R_f (0,29).

Povrchové napätie bolo študované nepriamou Traubeho stalagmometrickou metódou počítania kvapiek. Nárast lipofility spôsobil, že UPB-2 (γ = 0,06867 N.m^-1) je mierne povrchovoaktívnejšou zlúčeninou ako UPB-1 (γ = 0,06954 N.m^-1) pri zachovaní rovnakých experimentálnych podmienok.

Na štúdium acidobázických vlastností bola použitá metóda alkalimetrickej titrácie (roztok hydroxidu sodného s c = 0,1 mol.l^-1) pri potenciometrickej indikácii bodu ekvivalencie. Študovaná zlúčenina UPB-2 mala mierne kyslý charakter, o čom svedčí stanovená hodnota pK_a = 5,56. Zámena izopropylu za terciárny butyl znamenala pokles hodnoty pK_a – pre UPB-1 bola v práci¹¹⁾ experimentálne určená hodnota pK_a = 5,71.

Pri štúdiu spektier v UV/VIS oblasti vykazovala UPB‑2 dve absorpčné maximá. Vo vodnom roztoku sú to maximá pri λ_1max = 198 nm a λ_2max = 260 nm, v prostredí metanolu nastal mierny posun – absorpčné maximá boli zistené pri λ_1max = 210 nm a λ_2max = 258 nm. Modifikácia bázickej časti molekuly nemala vplyv na posun jednotlivých absorpčných maxím, keďže identické hodnoty boli indikované aj pre UPB-1¹¹⁾.

Pri látke UPB-2 bola charakterizovaná aj jej lipofilita prostredníctvom určenia retenčných faktorov k’, resp. log k’ v sústavách s rozdielnym percentuálnym zastúpením metanolu ako súčasťou mobilnej fázy a rozdeľovacích koeficientov v troch rozdielnych rozdeľovacích systémoch.

Rozdielna miera lipofility UPB-2 a UPB-1¹¹⁾ sa odzrkadlila v hodnotách log k’ v oboch systémoch (tab. 2); v 90 % metanole boli zistené takéto retenčné charakteristiky: log k’_UPB-1 = –0,071; log k’_UPB-2 = –0,027; v 95 % metanole boli získané tieto údaje: log k’_UPB-1 = 0,015; log k’_UPB-2 = 0,037. Pre porovnanie sú uvádzané aj stanovené hodnoty log k’ prislúchajúce p-OHBA: –2,153 (v 90 % metanole) a –2,643 (v 95 % metanole).

Hodnoty log P_exp pre UPB-2 boli určené klasickou shake flask metódou; pre určenie koncentrácie látky vo vodnej fáze sa využila UV/VIS spektrofotometria. V zvolených rozdeľovacích sústavách bol pozorovaný minimálny rozdiel v stanovených hodnotách log P_exp. V rozdeľovacom systéme oktán-1-ol/TFR predstavoval log P_exp hodnotu 1,92 (pre UPB-1 to bola hodnota 1,70); v sústave heptán/TFR bola hodnota log P_exp = 2,00 (pre UPB-1 predstavoval tento parameter hodnotu 1,66) a v systéme cyklohexán/TFR log P_exp = 2,03 (pre UPB-1 to bolo 1,62). Ako dokumentujú tieto výsledky, štruktúrny rozdiel medzi UPB-2 a UPB-1 sa pomerne výrazne odzrkadlil aj v hodnotách rozdeľovacích koeficientov určených vo všetkých troch systémoch.

Nežiaduce účinky ßB spojené so stimuláciou CNS sú známe dlhodobo – bežne je pozorovaná letargia, útlm, únava, menej často sa vyskytujú vážnejšie stavy spojené s užívaním ßB, ako napríklad depresie, živé sny, halucinácie, delírium, paranoidné psychózy alebo schizofrénia¹²⁾. Schopnosť ßB pasívne prechádzať cez hematoencefalickú bariéru (blood-brain barrier, BBB) je determinovaná, okrem iných faktorov, mierou ich lipofility. Relatívna afinita ßB proti krvnému riečišťu a mozgovému tkanivu je vyjadriteľná vzťahom:   

kde parametre C_mozog a C_krv predstavujú rovnovážne koncentrácie liečiva v mozgu a v krvi¹³⁾. Distribúciu liečiva do nepolárnych oblastí mozgu odzrkadľuje hodnota log P_exp stanovená pre systém cyklohexán/TFR (log P_exp c), zatiaľ čo hodnota log P_exp stanovená v rozdeľovacej sústave oktán-1-ol/TFR (log P_exp o) vyjadruje väzbu na proteíny v periférnom krvnom riečišti¹⁴⁾. Zlúčenina má tým hydrofilnejší charakter, čím je jej hodnota log P_exp o-c (t.j. rozdiel medzi log P_exp o a log P_exp c) pozitívnejšia; to znamená, že ochotnejšie tvorí vodíkové väzby, v menšej miere preniká do nepolárnych oblastí mozgu a je v organizme distribuovaná prednostne do krvi. Hodnota logP_exp o-c = –0,11 pre UPB-2 teda indikuje, že u nej existuje určitý predpoklad permeácie cez hematoencefalickú bariéru práve do nepolárnych oblastí mozgu.

Pre predikciu schopnosti UPB-2 prechádzať cez BBB bolo zvolených niekoľko modelov a schém. V Youngovom modeli¹⁵⁾ vyjadreného vzťahom:

logBB = 0,889–0,485 × logP_exp o-c,

hodnota log BB pre UPB-2 predstavovala 0,942, čo by znamenalo jej preferenčnú interakciu s mozgovým tkanivom. Hlavnou nevýhodou Youngovej schémy je pomerne limitovaný počet zlúčenín ako aj ich výber v pôvodnom training súbore, preto sa v rámci tejto práce aplikovali aj iné možnosti predikcie prechodu UPB-2 cez BBB.

Podľa Kaliszana¹⁶⁾ pre koreláciu log P_exp o-c a logBB platí vzťah, v ktorom bola ako aditívna veličina implementovaná aj M_r: logBB = 0,888 + 0,272 × logP_exp o-c  – 0,00112 × M_r;

podľa tohto modelu je hodnota logBB látky UPB-2 –1,008.

Hodnota polárneho povrchu molekuly (polar surface area, PSA), je zakomponovaná aj v modeloch Keldera¹⁷⁾ charakterizovaného vzťahom: logBB = 1,330 – 0,032 × PSA (logBB pre UPB-2 je –1,135) a Clarka¹⁸⁾ definovaného rovnicou: logBB = 0,550 – 0,016 × PSA (logBB pre UPB-2 je –0,682).

Pri aplikovaní Panovej¹⁹⁾ schémy: logBB = 0,064 + 0,200 × logP_exp o – 0,010 × PSA bola hodnota logBB pre látku UPB-2 –0,322.

Podľa Abrahamovho a Weathersbyho modelu predikcie²⁰⁾ logBB platí nasledovný vzťah: logBB = 0,119 + 0,350 × logP_exp o – 0,00502 × M_r. Po dosadení príslušných parametrov bola hodnota logBB v tomto prípade –3,200.

Feher²¹⁾ navrhol model, v ktorom zohľadnil aj schopnosť látky vytvárať väzby vodíkovým mostíkom: logBB = 0,4275 – 0,0017 × PSA + 0,1092 × logP – 0,3873 × n_acc, v ktorom logP = logP_exp o a n_acc bol počet akceptorov vodíkov v molekule vo vodnom prostredí (pre bázickú formu UPB-2 je to šesť akceptorov). Vypočítaná hodnota log BB pre UPB-2 bola –1,818.

Podľa Crucianiho et al.²²⁾ je liečivo schopné prestupovať hematoencefalickou bariérou vtedy, ak je jeho hodnota logBB vyššia ako –0,300. V prípade, ak nadobúda spomínaný parameter menšiu hodnotu ako –0,300, potom liečivo nie je schopné vstupovať do mozgového tkaniva. Na základe získaných údajov z jednotlivých prediktorových modelov možno predpokladať, že hodnotená zlúčenina UPB-2 bude s vysokou pravdepodobnosťou preferovať väzbu na proteíny krvného riečišťa pred prechodom cez hematoencefalickú bariéru (okrem výstupu z Youngovej schémy predikcie) podobne ako jej izopropylový analóg, UPB-1¹¹⁾.

Podľa hodnoty log P_exp o-h (rozdiel medzi hodnotami log P_exp v systéme oktán-1-ol/TFR a v rozdeľovacej sústave heptán/TFR) pre látku UPB-2 (–0,08) možno usudzovať, že tá je ešte slabším donorom protónu ako UPB-1 (0,04).

Kyslé ako aj zásadité prostredie spôsobilo nestabilitu látky UPB-2, pri chromatografickom hodnotení (adsorpčná TLC) sa na chromatograme(-och) v „línii“ UPB-2 okrem jej „vlastnej“ škvrny objavili v oboch prostrediach aj ohraničené škvrny prislúchajúce jednak p-OHBA (ktorá bola súčasne nanášaná na chromatogram ako referenčná substancia), ako aj ďalším „štiepnym“ produktom vznikajúcim pri rozklade UPB-2 – zlúčeninám s pracovným označením X₁ a X₂. V kyslom prostredí boli určené z chromatogramov tieto R_f hodnoty: 0,35 (pre látku UPB‑2), 0,68 (p-OHBA), 0,48 (X₁) a 0,80 (X₂); hodnoty R_f spomínaných látok pri pôsobení zásaditého média boli len nepatrne nižšie: 0,33 (UPB-2), 0,65 (p-OHBA), 0,45 (X₁) a 0,78 (X₂). Pravdepodobne nastalo vplyvom príslušného prostredia parciálne štiepenie molekuly UPB-2 v jej esterovej časti alebo v alkoxylovom zoskupení v lipofilnom fragmente. Rovnako tomu bolo aj pri hodnotení stability látky UPB-1 v publikácii¹¹⁾.

UV/VIS žiarenie nemalo v priebehu 1 h negatívny vplyv na stabilitu vodného a metanolového roztoku UPB-2; nedošlo k zmene hodnôt absorbancií pri konkrétnych absorpčných maximách a ani k ich posunu. Identický záver¹¹⁾ bol formulovaný aj pri hodnotení látky UPB-1.

Na „metodickú prípravu“ pre (možné) stanovenie obsahu UPB-2 v konkrétnej liekovej forme alebo v telových tekutinách možno využiť spektrálne (UV/VIS spektrofotometriu) alebo aj chromatografické (RP-HPLC) metódy. Zlúčenina UPB-2 bola stanovená spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke druhého absorpčného maxima, t.j. pri λ_2max = 260 nm (pre vodné prostredie), resp. pri λ_2max = 258 nm (pre prostredie metanolu). Na základe získaných údajov bola zostrojená kalibračná krivka, výsledkom stanovenia vo vodnom prostredí bolo formulovanie rovnice lineárnej regresie v tvare: y = 35844(±405)x – 0,0038(±0,0061); R² = 0,999; F = 7831; n = 5 (tab. 3); resp. pre stanovenie obsahu v metanolovom prostredí: y = 44003(±715)x – 0,0061(±0,0119); R² = 0,999; F = 3783; n = 5 (tab. 3). V týchto rovniciach parameter y predstavoval absorbanciu, x vyjadroval koncentráciu stanovovanej látky v mol.l^-1.

Vhodnou mobilnou fázou pre analýzu UPB-2 pomocou vysokoúčinnej chromatografie s obráteným systémom fáz sa ukázal metanol 90 %. Pre stanovenie obsahu UPB-2 pomocou RP-HPLC (tab. 4) mala formulovaná regresná rovnica nasledujúci tvar: y = 7571(±347)x + 0,0986(±0,0571); R² = 0,992; F = 477; n = 5; parameter y znamenal pomer plôch píkov študovanej látky UPB-2 a vnútorného štandardu (p-OHBA), x vyjadroval koncentráciu stanovovanej látky v mol.l^-1.

V ďalších štúdiách sa bude pozornosť venovať spektrálnym identifikačným charakteristikám a stanoveniu niektorých fyzikálno-chemických konštánt štruktúrne podobných zlúčenín, v ktorých molekule bude, v porovnaní s UPB-2, variabilne substituovaná lipofilná časť molekuly. Všetky experimentálne získané údaje budú v budúcnosti slúžiť ako zdrojový súbor informácií pre komplexné hodnotenie vzťahov medzi chemickou štruktúrou a biologickou aktivitou.

Konflikt záujmov: žiadny.

Došlo 25. srpna 2011/ Přijato 17. října 2011

PharmDr. Ivan Malík

Katedra farmaceutickej chémie, Farmaceutická fakulta Univerzity Komenského

Odbojárov 10, 832 32 Bratislava, Slovenská republika

e-mail: malik@fpharm.uniba.sk