Heat shock protein 70 v plodové vodě u pacientek s předčasným odtokem plodové vody

Súhrn

Cíl studie:
Cílem práce bylo zjistit změny HSP70 v plodové vodě u pacientek s předčasným odtokem plodové vody s a bez přítomnosti intraamniální infekce. A také, lze-li využít HSP 70 jako potencionální biomarker intraamniální infekce z plodové vody.

Typ studie:
Prospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Lékařská fakulta Hradec Králové, Univerzita Karlova Praha. Porodnická a gynekologická klinika FN Hradec Králové.

Metodika:
U 30 pacientek s předčasným odtokem plodové vody mezi 24. až 36. týdnem gravidity byl odebrán vzorek plodové vody transabdominální amniocentézou. Pacientky byly rozděleny do dvou skupin: bez a s přítomností intraamniální infekce. U 76 % (23/30) pacientek byla histologicky vyšetřena placenta a plodové obaly na přítomnost akutních zánětlivých změn. HSP70 v plodové vodě byl stanoven ELISA technikou pomocí komerční soupravy Hsp70- ELISA kit firmy Assay Designs, USA.

Výsledky:
Nebyl nalezen signifikantní rozdíl v hladinách HSP70 mezi skupinami pacientek s IAI a bez IAI (pacientky s IAI: medián 5,12 ng/ml, rozsah 3,01-90,37 ng/ml vs. pacientky bez IAI: medián 4,68 ng/ml, rozsah 0,58-84,28 ng/ml; p=0,56). Nebyl nalezen signifikantní rozdíl v hladinách HSP70 mezi skupinami pacientek se histopatologickými zánětlivými změnami a bez nich (pacientky se zánětem: medián 6,97 ng/ml, rozsah 2,61-90,37 ng/ml vs. pacientky bez zánětu: medián 4,63 ng/ml, rozsah 0,58-84,28 ng/ml; p=0,68).

Závěr:
Hladina HSP70 v plodové vodě u pacientek s předčasným odtokem plodové vody a intraamniální infekcí není signifikantně vyšší než u pacientek bez intraamniální infekce.

Klíčová slova:
HSP70, intraamniální infekce, chorioamnionitida, předčasný odtok plodové vody.

ÚVOD

Předčasný porod je stále závažným problémem, který má dopad nejen medicínský, ale i rodinný, sociální a ekonomický. Jeho frekvence se v posledních letech příliš nemění a stále se pohybuje kolem 6 %. Předčasný odtok plodové vody (PROM), definovaný jako porušení integrity plodových obalů s odtokem plodové vody předcházejícím minimálně 2 hodiny nástup děložní činnosti, komplikuje zhruba 4–7 % všech porodů. Je přímo spojen s nižším gestačním stářím plodů, vzestupem perinatální a maternální morbidity. Přestože existuje vztah mezi PROM, infekcí, cervikální inkompetencí a nízkým socioekonomickým statusem rodičky, je jeho přesná etiologie nejasná [15]. V případě infekcí podmíněné PROM jsou spouštěcím mechanismem porodu proinflamatorní cytokiny [25].

Heat shock proteiny (HSPs) se vyskytují téměř v každé subcelulární struktuře (jádro, mitochondrie, endoplasmatické retikulum a cytoplazma) všech buněčných typů od prokaryotických k eukaryotickým buňkám [24]. HSPs regulují intracelulární procesy udržující homeostázu v průběhu procesu buněčné proliferace a diferenciace. Fungují jako tzv. chaperony, tedy speciální proteiny, jež v buňce pomáhají k dosažení optimální terciální struktury proteinů, které po translaci opouštějí velkou podjednotku ribozomu [12]. Ke zvýšení jejich intracelulární exprese dochází při expozici stresovým stimulům, jako jsou hypoxie, ischémie a vysoká teplota [35]. Podle molekulárních hmotností je dělíme do několika skupin. Mezi nejlépe definované patří heat shock protein 70 (HSP70) [27]. HSPs se podílejí na specifické i nespecifické (přirozené) imunitní odpovědi. Jejich výskyt v extracelulárním kompartmentu odráží tkáňové poškození nebo tzv. nebezpečné „danger“ signály [32]. HSPs uvolněné z nekrotických buněk umožňují aktivaci monocytů pomocí různých receptorů lokalizovaných na povrchu buněk (CD 14, CD 40, Toll-like receptor a jiné) [21], stimulujících produkci proinflamatorních cytokinů [34]. Také se podílejí na zpracování antigenu v antigen prezentujících buňkách, a tím významně ovlivňují specifickou imunitní odpověď zprostředkovanou T lymfocyty [42]. HSPs se mohou také uvolnit z buněk bez nekrotických změn [8]. Například mononukleární buňky v periferní krvi mohou exocytózou uvolňovat HSPs i bez přítomnosti detekovatelné buněčné smrti [14]. HSP60 [20] a HSP70 [22] jsou přítomny i v séru zdravých lidí. Zvýšená hladina HSP70 v periferní krvi byla zjištěna u pacientek s preeklampsií [9]. Hladina HSP70 byla vyšší u těhotných porodivších předčasně, v porovnání s těmi, které porodily v termínu [9]. Vzestup exprese mRNA HSP70 byl nalezen v buněčných kulturách plodových obalů vystavených endotoxinové stimulaci [17]. Komplexy HSP70 antigen-protilátka byly detekovány v placentách předčasně narozených plodů [41]. Zatím jen dvě recentní práce se věnují HSP 70 a protilátkám HSP 70 v plodové vodě [10, 13].

Cílem práce bylo zjistit změny hladin HSP70 v plodové vodě u pacientek s předčasným odtokem plodové vody s a bez přítomnosti intraamniální infekce. A také je-li možné využít HSP 70 jako potenciální biomarker intraamniální infekce z plodové vody.

SOUBOR A METODIKA

Do studie bylo zařazeno 30 těhotných žen v gestačním týdnu 23+1 až 36+6 přijatých v období od března 2004 do ledna 2008 na porodní sál Porodnické a gynekologické kliniky Fakultní nemocnice Hradec Králové s předčasným odtokem plodové vody (PROM). Vyloučeny byly pacientky s vícečetným těhotenstvím. Předčasný odtok plodové vody byl potvrzen klinickým vyšetřením, Temešváryho zkouškou a/nebo PROM testem. Vzorek plodové vody byl odebrán za sterilních kautel transabdominální amniocentézou pod ultrazvukovou kontrolou. Vzorek plodové vody byl ihned transportován do laboratoře k provedení aerobní, anaerobní kultivace a stanovení genitálních mykoplazmat. Vzorek určený ke stanovení HSP70 byl centrifugován, supernatant byl až do analýzy uchován při –80 °C. U 23 z těchto pacientek byla po porodu odeslána placenta a plodové obaly k histologickému vyšetření. Všechny pacientky podepsaly informovaný souhlas před odběrem vzorku. Studie byla schválena lokální etickou komisí.

Statistika

Statistické analýza výsledků byla provedena pomocí Fischerova exaktního testu při použití 5% hladiny významnosti. Analýza byla provedena pomocí programu Statistica Cz 8.0 (StatSoft CR, s.r.o., Praha, Česká Republika).

Stanovení HSP 70 v plodové vodě

HSP70 v plodové vodě byl stanoven ELISA technikou pomocí komerční soupravy Hsp70- ELISA kit firmy Assay Designs, USA.

Stanovení genitálních mykoplazmat v plodové vodě

Z plodové vody byla provedena izolace DNA pomocí komerčního kitu firmy QIAGEN (QIAamp DNA Mini Kit-Tissue Protocol). Přímá detekce DNA Ureaplasma spp. a Mycoplasma hominis byla provedena komerční multiplex real-time polymerázovou řetezovou reakcí, umožňující stanovení obou mikroorganismů v jedné zkumavce.

Klinické definice

Intraamniální infekce (IAI) byla definována jako přítomnost mikroorganismů v plodové vodě, s výjimkou nálezu Staphylococcus koaguláza negativní, považovaného za kožního saprofyta. Chorioamnionitida byla definována jako přítomnost akutních zánětlivých změn v choriové plotně placenty. Funisitidou byla označena přítomnost neutrofilní infiltrace ve stěně pupečníkových cév, nebo whartonském rosolu. Amnionitida jako přítomnost akutních zánětlivých změn v plodových obalech.

VÝSLEDKY

Demografické charakteristiky

Průměrný věk pacientek byl 30 let (rozsah 17–40 let). Průměrné gestační stáří bylo 32 týdnů. Medián gestačního stáří pacientek s PROM a intraamniální infekcí byl nižší než pacientek s PROM bez intraamniální infekce (viz graf 1) Rozdíl však nebyl signifikantně významný (32 versus 35, p=0,07). Taktéž medián gestačního stáří pacientek s PROM a histopatologickými známkami zánětu na placentě či plodových obalech byl také nižší ve srovnání s pacientkami bez zánětlivých změn (viz graf 2). Rozdíl také nebyl statisticky významný (32 versus 35, p=0,234).

Změny hladin HSP70 v plodové vodě a intraamniální infekce

Intraamniální infekce byla verifikována u 30 % pacientek s PROM (9/30). V 7 případech byl nález genitálních mykoplazmat v plodové vodě (6krát Ureaplasma urealyticum, jednou Ureaplasma urealyticum a Mycoplasma hominis) a u tří pacientek byla pozitivní aerobní a anaerobní kultivace plodové vody (jednou Enterococcus species, jednou GBS a jednou Fusobacterium species se současným nálezem Ureaplasma urealyticum). Nebyl nalezen signifikantní rozdíl v hladinách HSP70 mezi skupinami pacientek s IAI a bez IAI (pacientky s IAI: medián 5,12 ng/ml, rozsah 3,01-90,37 ng/ml vs. pacientky bez IAI: medián 4,68 ng/ml, rozsah 0,58-84,28 ng/ml; p=0,56). Viz graf 3. Nejvyšší hladina HSP70 (90,37 ng/ml) byla v případě nálezu Mycoplasma hominis a Ureaplasma urealyticum v plodové vodě.

Změny hladin HSP70 v plodové vodě a histopatologické zánětlivé změny na placentě a plodových obalech

U 23 pacientek byly dostupné výsledky histopatologického vyšetření placenty a plodových obalů. V 11 případech jsme zde nalezli zánětlivé změny (6krát amnionitidu, 4krát chorioamnionitidu a jednou funisitidu). Nebyl nalezen signifikantní rozdíl v hladinách HSP70 mezi skupinami pacientek s histopatologickými zánětlivými změnami a bez nich (pacientky se zánětem: medián 6,97ng/ml, rozsah 2,61-90,37 ng/ml vs. pacientky bez zánětu: medián 4,63 ng/ml, rozsah 0,58-84,28 ng/ml; p=0,68), viz graf 4.

DISKUSE

HSPs byly objeveny více než před 30 lety a dostaly jméno podle toho, že exprese této skupiny proteinů může být indukována vysokou teplotou [31]. Protein HSP70 kóduje minimálně 17 genů, které jsou lokalizované na různých chromozomech [27]. HSP exprese je zvýšena působením rozličných faktorů jako např. environmentální vlivy (teplo, ultrafialové záření [36]), aminokyseliny [3], těžké kovy [19], fyziologické stavy (růstové faktory, buněčná diferenciace, hormonální stimulace) [30], patologické stavy (virové, bakteriální, parazitární infekce) [28], horečka [11], zánět [23], ischémie [16] a autoimunitní stavy [4]. HSPs fungují jako intracelulární molekulární chaperony regulující správnou prostorovou strukturu proteinů, transport, translokaci a translaci proteinů. Podporují též nápravu buněčné aktivy po působení stresového stimulu [6]. Navíc HSPs mají anti-apoptotickou aktivitu díky inhibici caspáz (caspase – cysteine aspartic acid protease), které patří do skupiny cysteinových proteáz hrajících esenciální roli v indukci programované buněčné smrti [29]. Vzestup exprese intracelulárního HSP70 v monocytech a makrofázích po endotoxinové stimulaci inhibuje produkci TNFα [6]. Tepelný šok z okolního prostředí, jež vede k vzestupu exprese HSP70 snižuje na zvířecích modelech sepsí indukovanou orgánovou dysfunkci a mortalitu [26]. Polymorfismus HSP70 genu byl popsán u pacientů s Parkinsonovou nemocí, což podporuje teorii protektivní úlohy HSP70 v případě rizika neuronálního poškození u degenerativních onemocnění [33].

Rodina HSP70 genů patří mezi kandidátní geny spojené s lidskou dlouhověkostí [6]. HSPs jsou uvolňovány extracelulárně jak pasivními (nekrotické buňky), tak aktivními mechanismy (viabilní buňky) [1]. Extracelulární HSPs mohou stimulovat komponenty nespecifického imunitního systému nezávisle na jejich chaperonové funkci. Pro jejich dvojí roli se někdy používá termín „chaperokin“ [18]. Některé studie potvrzují, že HSP70 utilizuje TLR-2 (receptor pro gram pozitivní bakterie) a TLR-4 (receptor pro gramnegativní bakterie) k indukci transkripčního faktoru NFκB a vyvolává proinflamatorní odpověď za pomoci CD14 [34]. HSP70 byl nalezen v plodové vodě u 57 % těhotných žen během druhého trimestru a u 91% žen s porodem v termínu [13]. To podporuje domněnku, že je do plodové vody uvolňován i za fyziologických podmínek. Hladiny HSP70 jsou, zřejmě díky své funkci „chaperokinu“, uvnitř amniální dutiny během růstu a vývoje plodu [13], vyšší v termínu porodu, oproti druhému trimestru. HSP70 v mateřském séru během gravidity byl cílem několika prací s rozdílnými výsledky. Zatímco Molvarec a kol. udává vzestup koncentrace v průběhu těhotenství [35], Fukushima a kol. nenalezl signifikatní změny v sérových koncentracích mezi jednotlivými trimestry gravidity [15]. Medián sérových koncentrací HSP70 je v graviditě vyšší než mimo graviditu. Chaiworapongsa a kol. ve své recentní práci uvádí, že vzestup mediánu HSP70 v plodové vodě žen v termínu porodu je jen o něco nižší než u předčasného porodu s intraamniální infekcí (IAI) ( 60,7 ng/ml a 82,9 ng/ml) [19].

Vzestup koncentrace v termínu porodu je zřejmě způsoben zvýšením exprese HSP70 mRNA v myometriu a tento intracelulární HSP70 se váže na progesteronový receptor. Funguje tedy jako korepresor tohoto receptoru a blokuje vazbu progesteronu [36, 37, 38]. I tak přesná příčina tohoto zvýšení zůstává nejasná. Je také možné, že extracelulární HSP70 (plodová voda je extracelulární kompartment) přímo stimuluje produkci prostaglandinů vedoucí k porodu, neboť HSP70 indukuje expresi proteinu enzymu cyklooxygenázy a prostaglandinu E₂ v endoteliálních buňkách umbilikální žíly [39]. Nejvyšší hodnotu HSP70 (90,37 ng/ml) v našem souboru měla pacientka s nálezem Mycoplasma hominis v plodové vodě. Tato spojitost již byla v minulosti publikována [13]. Chaiworapongsa nalezl u pacientek s intraamniální infekcí signifikantně vyšší medián než u pacientek bez infekce. V našem souboru jsme však nenalezli signifikantní rozdíl mezi mediány HSP70 u pacientek s IAI, či bez ní. Také jsme nenalezli rozdíl mezi hladinami HSP70 u pacientek s histopatologickým průkazem zánětu a pacientkami bez zánětlivých změn v placentě, pupečníku a plodových obalech. Naše výsledky jsou podpořeny závěry několika prací. Divers a kol. nenalezl žádné změny proteinové exprese HSP70, HSP60 a HSP90 v trofoblastu bazální plotny a decidui žen porodivších předčasně, ve srovnání s těhotnými porodivšími v termínu porodu [7]. Ziegert a kol.u pacientek s předčasným porodem detekoval v placentární tkáni komplexy HSP70 antigen-protilátka, ale ne samotné HSP70 [41]. Komplexy HSP70 antigen-protilátka jsou potentními induktory produkce TNFα [39]. K podobným závěrům dospěl ve své recentní práci Gelber. V plodové vodě hladiny autoprotilátek proti HSP70 ve třídě IgG, ale ne koncentrace HSP70, pozitivně korelovaly s hladinami TNFα a interferonu γ [18]. HSP70 antigen je přítomen v amniální dutině i za fyziologického stavu. V reakci na patologický stav dojde k produkci autoprotilátek proti HSP70 ve třídě IgG těhotnou ženou. Ty se následně transportují skrze placentu a zde mohou reagovat s HSP70 antigenem. Vzniklý komplex poskytuje senzitivní mechanismus velmi rychlé aktivace intraamniální imunity v reakci na potencionální ohrožení. Je otázkou, zdali tato odpověď je přínosná, či destruktivní [37]. Pravděpodobně závisí na rozsahu aktivace imunitního systému [18].

Hladinám HSP70 v plodové vodě u pacientek s PROM se zatím věnuje jen jedna zcela recentní práce [13]. Naše výsledky jsou v rozporu se závěrem této práce. Domníváme se, že vypovídací hodnotu o přítomnosti intraamniální infekce má zřejmě jen koncentrace komplexu HSP70 antigen-protilátka a ne jen samotná hladina HSP70.

ZÁVĚR

Koncentrace HSP70 v plodové vodě u pacientek s předčasným odtokem plodové vody a intraamniální infekcí není signifikantně vyšší než u pacientek bez intraamniální infekce. Změny koncentrací HSP70 v plodové vodě nelze u pacientek s PROM využít jako biomarker intraamniální infekce

Vznik této práce byl podpořen grantem GAČR 304/09/0494

MUDr. Marian Kacerovský

Porodnická a gynekologická klinika

FN a LF Hradec Králové

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové

E-mail: kacermar@fnhk.cz