Trombin generační test u fyziologické a rizikové gravidity

Súhrn

Generace trombinu je klíčovým momentem krevního srážení. Na základě studií in vitro bylo zjištěno, že probíhá ve dvou fázích. Nejprve vzniká po aktivaci FX komplexem TF a FVIIa malé množství trombinu, takto vzniklý trombin potom potencuje koagulaci aktivací destiček, F V a F VIII. Komplex TF/FVIIa aktivuje také F VIIIa, F IX, F VIII a F IXa váže se na povrch trombocytů, což nadále aktivuje F X. Tento krok vede ke vzniku velkého množství trombinu, formaci fibrinu a nakonec k tvorbě krevního koagula.

Typ studie:
Souhrnný článek.

Název a sídlo pracoviště:
Porodnicko-gynekologická klinika FN, Olomouc.

Klíčová slova:
trombin generační test, těhotenství, koagulace.

ÚVOD

K posouzení funkce lidského hemostatického systému je k dispozici celá řada vyšetření, kdy jsou vyšetřovány jednotlivé komponenty koagulačního procesu, hladiny inhibitorů, specifické mutace, lupus antikoagulans, doba krvácivosti, agregace trombocytů. Všechny tyto vyšetřovací metody ale neposkytují informaci o komplexní funkci hemostatického systému. Centrálním enzymem hemostázy je trombin. Zhodnocení individuálního potenciálu pro generaci trombinu pomocí trombin generačního testu (TGT) může těsně korelovat s hyperkoagulačním nebo hypokoagulačním stavem. Trombin generační test měří schopnost vzorku plazmy vytvářet trombin po in vitro aktivaci koagulace tkáňovým faktorem. Na rozdíl od běžných testů koagulace jako PT nebo aPTT, které testují jen malé části koagulační kaskády (kdy dochází k formaci trombinu, nezbytného k tvorbě krevní sraženiny), trombin generační test sleduje fázi množení trombinu (kdy vzniká velké množství trombinu cestou zpětné vazby s faktory V, VIII a XI) a terminální fáze (kdy je dokončena formace trombinu a koagulační řetězec je inhibován proteiny plazmy). Výsledná křivka generace trombinu proto reflektuje a integruje prokoagulační a antikoagulační působky, které regulují formaci a zároveň inhibici trombinu. Díky tomu, že trombin je ústředním článkem koagulace, je trombin generační test komplexním testem koagulačního systému plazmy.

První používaný test byl vytvořen v roce 1953. Tento test byl založen na běžném vyšetření aktivované plazmy a kvantifikaci trombinu v každém vzorku, měřením schopnosti ke tvorbě fibrinového koagula. To byla velmi náročná a nepřesná metoda. Časem došlo k nahrazení fibrinogenu syntetickými substráty trombinu a vyšetření generace trombinu je založené na měření aktivity trombinu přidáním fluorogenních nebo chromogenních substrátů přímo do vyšetřované plazmy. Je tak možné kontinuální měření trombinové aktivity.

FUNKCE HEMOSTATICKÉHO SYSTÉMU

Hlavním úkolem hemostatického systému je zajištění integrity cévního řečiště a umožnění kontinuální cirkulace krve. Je to komplexní systém zahrnující endotelovou cévní výstelku, cirkulující buněčné složky – trombocyty, erytrocyty, leukocyty, z nich uvolňované buněčné mikropartikule a složitý systém plazmatických koagulačních proteinů, které při své aktivaci vedou k tvorbě hlavního koagulačního enzymu trombinu štěpícího solulibilní fibrinogen na fibrin, jenž je hlavní komponentou nerozpustné fibrinové matrix.

Při poškození cévní stěny se rozbíhá mnohaúrovňový proces: v endotelu dochází k syntéze a uvolňování působků ovlivňující buněčné složky i plazmatický koagulační systém. V buněčném systému hrají dominantní úlohu trombocyty, které procházejí procesem adheze, agregace a formací primární trombotické zátky. Trombocyty poskytují esenciální povrch pro průběh plazmatických reakcí koagulační kaskády. Koagulační kaskáda má více stupňů.

Po poškození cévní stěny dochází k odhalení subendoteliálních struktur a uvolnění tkáňového faktoru a dojde velmi rychle k iniciaci koagulačního děje a vytvoření malého množství trombinu. Ten dále působí zpětnou vazbou na aktivaci celého děje a stupňuje aktivitu prokoagulačního enzymatického komplexu, jehož výsledkem je tvorba velkého množství trombinu respektive fibrinu, který mění primární hemostatickou zátku v nerozpustnou sraženinu, trombus. Během této fáze již trombin aktivuje fibrinolýzu a aktivuje inhibitory krevního srážení. Terminální fáze celého procesu je zajištěna inhibicí prokoagulačního enzymatického komplexu buď přímo antitrombinem, nebo aktivací bílkovinných kofaktorů. Tím je lokalizace hemostatického procesu omezena jen do místa poškození endotelu.

V poslední fázi hemokoagulační kaskády dochází k aktivaci fibrinolytických dějů, které vedou k rozpuštění starého trombu a opravě poškozené tkáně. Správná funkce hemostatického systému je závislá na rovnováze mezi jeho prokoagulačními a antikoagulačními složkami. Vychýlení jedním nebo druhým směrem vede k hypokagulačnímu nebo hyperkoagulačnímu stavu. Výsledkem této nerovnováhy je buď krvácení, nebo trombotické komplikace.

KOAGULACE V GRAVIDITĚ

Těhotenství je asociováno s podstatnými změnami v hemostáze a 6krát vyšší incidencí venózních tromboembolických komplikací. Nejdůležitějším iniciálním faktorem pro hemostázu za porodu je kontrakce uterinních svalů. Běžné testy i nové metody vyšetřování hemostázy ukazují na hyperkoagulaci v těhotenství. Zvýšená endogenní generace trombinu, zvýšená rezistence aktivovaného proteinu C, mírně snížený aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aPTT), zvýšený počet protrombinových komplexů, INR je v graviditě nižší než 0,9. Měření času krvácivosti není graviditou ovlivněno. Množství většiny koagulačních faktorů a fibrinogenu se v průběhu gravidity zvyšuje. Faktor XI (F XI) je jediným faktorem, který se snižuje v průběhu gravidity. Inhibitory koagulace jsou graviditou ve většině případů neovlivněny, ale dochází k poklesu volného proteinu S a zvyšuje se množství tkáňového faktoru. Trombomodulin se v graviditě také zvyšuje. V graviditě dochází ke snížení fibrinolytické aktivity, zejména vlivem zvýšené hladiny inhibitoru aktivátoru plazminogenu-l (PAI-1) z endotelu a inhibitoru aktivátoru plazminogenu-2 (PAI-2) z placenty. Inhibitory fibrinolýzy aktivované trombinem se nezdají být těhotenstvím ovlivněny. Během gravidity je aktivována koagulace a simultánně se zvyšuje fibrinolýza, což probíhá bez známek orgánové dysfunkce. Tyto změny progredují podle délky gravidity. Během porodu dochází ke spotřebování krevních destiček a koagulačních faktorů včetně fibrinogenu. Fibrinolýza se po porodu opět zvyšuje a může vést ke zvýšené hladině D-dimerů. Některé změny v hemostáze, které probíhají v graviditě, se vrací do normálu během 4-6 týdnů po porodu. Počet destiček a hladina volného proteinu S mohou být změněny déle. Hemostáza by proto neměla být vyšetřována dříve, než za 3 měsíce po porodu, nebo po zástavě laktace. Po porodu dochází k rychlému poklesu PAI-1, PAI-2, nicméně byla prokázána přítomnost PAI-2 i 8 měsíců po porodu. Alfa 2 antiplazmin, urokináza, inhibitor kallikreinu se zvyšuje za 6 týdnů po porodu.

TRADIČNÍ VYŠETŘOVACÍ TESTY HEMOSTÁZY

Běžně užívané metody vyšetření hemostázy jsou založeny na měření koagulačních časů. Jako příklad může být uveden aktivovaný tromboplastinový test (aPTT), protrombinový test (PT, dříve také označován jako Quickův test) či trombinový test (TT). APTT mapuje vnitřní cestu aktivace přeměny protrombinu na trombin, štěpení fibrinogenu trombinem a genezi fibrinu. PT monitoruje vnější cestu aktivace přeměny protrombinu na trombin. Po vytvoření trombinu dochází k přeměně fibrinogenu na fibrin. TT zachycuje přeměnu fibrinogenu na fibrin. Další skupinou testů jsou ty, které lze použít ke kvantitativnímu stanovení jednotlivých koagulačních faktorů nebo jejich inhibitorů, složek fibrinolytického sytému. Molekulárně genetické testy umožňují vyšetření vrozených trombofilních mutací, jako je např. mutace faktor V Leiden G1691A, nebo protrombinová mutace G20210A. Tyto vyšetřovací metody postihují vždy jen část hemostatického systému a neodrážejí globální vztah plazmatických a buněčných složek.

Komplexní hemostatické testy

V současné době se používá několik metod, které jsou založeny na přímém nebo nepřímém sledování generace trombinu. Tromboelastografie zachycuje kvalitativní a kvantitativní údaje, které charakterizují tvorbu krevní sraženiny, kinetiku jejího růstu. Sleduje pevnost, stabilitu a schopnost refrakce krevní sraženiny. Toto vyšetření je vhodné zejména pro urgentní medicínu k posouzení základního stavu hemostázy, hypokoagulace, fibrinolýzy, trombopenie a ke sledování efektu substituční léčby.

Přesnější a klinicky lépe využitelný se jeví test, který je založený na měření kinetiky vzniku trombinu – trombin generační test (TGT). TGT se využívá pro klinické i výzkumné účely. Klinicky má význam zejména při sledování trombofilních a krvácivých stavů. Dále jej lze využít k monitorování léčby hemofiliků nebo tromboembolických nemocí a k určení rizika rekurence trombózy.

Měření generace trombinu

Trombin představuje centrální enzym v hemostatickém systému. Trombin zajišťuje aktivaci krevního srážení, zároveň v pokročilých fázích působí samotnou inhibici hemostázy. Hraje významnou roli v mezibuněčné signalizaci, ovlivňuje fibrinolýzu a zánětlivé procesy. V řadě reakcí je trombin enzymatickým faktorem, v jiných funguje jako kofaktor. Jeho fukce v hemostáze je multifunkční. Monitorování tvorby trombinu je vhodným postupem pro posouzení globální funkce hemostázy. Reakce probíhá za účasti negativně nabitých fosfolipidů a kladně nabitých vápenatých iontů. Generovaný trombin štěpí chromogenní nebo fluorogenní substrát, který je odpovídající metodou detekován. Nevýhodou chromogenních substrátů je jejich pomalejší štěpení trombinem, nižší afinita k trombinu a potřeba blokace fibrinu ve vyšetřované plazmě. Použití fluorogenního substrátu je vhodnější. Výsledkem měření je křivka odrážející aktuální kapacitu sytému pro generaci trombinu, která je charakterizována třemi parametry: dobou do nástupu generace trombinu (lag fáze), maximální koncentrací vznikajícího trombinu (c max) a plochou pod křivkou odrážejí celkové množství vzniklého trombinu (endogenní potenciál ETP). K vyšetření lze použít plazmu chudou na destičky (PPP) nebo plazmu na destičky bohatou (PRP).

Technické provedení testu

K provedení trombin generačního testu se odebírá periferní žilní krev do zkumavky s 3,2% citrátem sodným. Vzorek je následně centrifugován 10 minut při 3000 g za laboratorní teploty. Získaná horní frakce (plazma chudá na destičky – PPP) je alikvotována a uchovávána při –80 °C do doby analýzy. Generace trombinu je stanovována plně automaticky pomocí kitu Technotrombin TGA, (Technoclone, Vienna, Austria) a analyzátoru Ceveron Alpha (Technoclone, Vienna, Austria) s plně automatickým softwarovým vyhodnocením. Při stanovení generace trombinu v plazmě je reakce iniciována 71,6 pM rekombinantního lidského tkáňového faktoru (rTF) nesuspendovaného v 3,2 uM fosfolipidových micel (obsah fosfatidyl cholinu 2,56 uM a fosfatidylserinu 0,64 uM). Hlavním parametrem je vyhodnocení: maximum generace trombinu (TGTm), celkové množství generace trombinu, tzn. plocha pod křivkou (TGTe) a lag fáze (TGTt).

Podpořeno hgrantem IGA NR 9282-3/2007 a NS 10319-3/2009.

MUDr. Veronika Lattová

Porodnicko-gynekologická klinika FN

I. P. Pavlova 6

775 20 Olomouc