Endometrial Receptivity Analysis – nástroj ke zvýšení podílu implantovaných embryí v programu asistované reprodukce

Súhrn

Úvod: Pro pozitivní výsledek in vitro fertilizace je klíčová úspěšná implantace embrya. Endometrium je však pro embryo receptivní jen v krátkém časovém úseku, toto tzv. implantační okno detekuje molekulárně diagnostická metoda ERA (Endometrial Receptivity Analysis).

Cíl studie: Zjistit, u jakého podílu pacientek bylo v době provedení ERA jejich endometrium nereceptivní a u jakého podílu z nich jsme následně po identifikaci implantačního okna zaznamenali klinické těhotenství.

Typ studie: Retrospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště: REPROMEDA Biology Park, Klinika reprodukční medicíny a preimplantační genetické diagnostiky, Brno.

Metodika: Studovali jsme soubor 85 pacientek, které v období od srpna 2015 do října 2018 podstoupily vyšetření ERA. Celkem 74 z nich absolvovalo ERA z důvodu předchozího selhání implantace embrya, průměrný počet neúspěšných kryoembryotransferů (KET) byl v této skupině 2,5, u 11 pacientek byla ERA provedena z preventivních důvodů již před prvním KET. V rámci všech KET bylo přeneseno vždy jen jedno euploidní embryo. Celkem 48 pacientek bylo na ERA či KET připravováno v nativním menstruačním cyklu, 37 v cyklu hormonální substituční terapie (HRT). Zajímalo nás, jaký podíl žen měl v době provedení ERA nereceptivní endometrium a následně zastoupení těch, které otěhotněly po transferu embrya do nově identifikovaného personalizovaného implantačního okna. Spočítali jsme, kolik personalizovaných kryoembryotransferů (pKET) bylo průměrně potřeba k dosažení gravidity.

Výsledky: Celkem 31 z 85 (36,5 %) pacientek mělo po první ERA endometrium v nereceptivní fázi. V nativním cyklu to bylo 13 ze 48 žen (27,1 %): pět mělo endometriumprereceptivní, tři časně receptivní, dvě ženy pozdně receptivní a tři ženy postreceptivní. V HRT cyklu mělo nereceptivní endometrium 18 ze 37 žen (48,6 %): u 12 žen bylo endometrium v prereceptivní fázi, u čtyř ve fázi časně receptivní, u jedné v pozdně receptivní a u jedné ženy ve fázi postreceptivní. pKET absolvovalo celkem 26 žen z celkových 31 s původně nereceptivním endometriem a otěhotnělo 18 z nich (69,2 %). V nativním cyklu otěhotnělo 6 z 11 žen (54,5 %), v HRT cyklu 12 z 15 žen (80,0 %). Pro vznik klinického těhotenství bylo třeba provést v průměru 1,5 pKET.

Závěr: Zjistili jsme posun implantačního okna u více než jedné třetiny žen a po personalizovaném transferu do receptivního endometria následné klinické těhotenství u 69,2 % z nich. Tento výsledek podporuje individuální přístup k pacientům v programu in vitro fertilizace mimo jiné při časování embryotransferu po identifikaci pWOI (personalizovaného implantačního okna).

Klíčová slova:

IVF – ERA – nativní cyklus – HRT cyklus – nereceptivní endometrium – pKET – těhotenství – implantační okno

ÚVOD

Léčba sterility metodami in vitro fertilizace (IVF) směřuje k jedinému cíli – implantaci kvalitního embrya a perspektivnímu těhotenství vedoucímu k porodu zdravého dítěte. Aby byla implantace úspěšná, je třeba zajistit synchronizaci mezi kvalitním embryem ve stadiu blastocysty a receptivním endometriem. Endometrium je po většinu menstruačního cyklu vůči embryu netečné, receptivním se stává 19.–20. den cyklu, 6–10 dnů po ovulaci, délka tohoto tzv. implantačního okna je 4–5 dnů [2, 5, 13] a obecně se předpokládá, že je u všech žen časově neměnné [24]. V přípravě endometria na implantaci sehrávají hlavní roli ovariální steroidní hormony, přičemž kritické je působení progesteronu. Vliv hormonů a jejich receptorů je doprovázen celou řadou molekul proteinové povahy (integriny, selektiny, kadheriny, muciny, cytokiny), prostaglandiny, kanabinoidy, proteolytickými enzymy matrix metaloproteinázy či NK buňkami [27, 31]. Přenos celé řady embryí do děložní dutiny nevede ke vzniku těhotenství, dochází k selhání implantace. Jednou z příčin implantačního selhání je transfer embrya do nereceptivního endometria, tedy v období mimo implantační okno.

S rozvojem molekulárně diagnostických metod se podařilo stanovit tzv. transkriptomický profil endometria, který je typický pro jednotlivé fáze menstruačního cyklu včetně krátkého receptivního období. V roce 2009 byla patentována ERA (Endometrial Receptivity Analysis), molekulárně genetický test, který v současnosti využívá metody NGS (next generation sequencing – sekvenování nové generace) a ve spojení s bioinformačními technologiemi umožňuje detekci exprese 248 genů na úrovni mRNA. Spolehlivě identifikuje receptivní, prereceptivní a postreceptivní fázi, a díky tomu se stal velmi kvalitním prediktorem implantačního okna [3]. Bylo jednoznačně prokázáno, že genetické testování je nadřazeno histologické klasifikaci endometria [4, 8], jak ji popsal Noyes v roce 1950 [20]. V uvedené práci [4] autorka Diaz-Gimeno navíc dokládá, že u jednotlivých žen zůstává stanovené implantační okno konstantní po dobu 29–40 měsíců.

Význam ERA spočívá v možnosti přesně stanovit individuální implantační okno a následným transferem embrya do receptivního endometria zvýšit šanci na úspěšnou implantaci. Na klinice REPROMEDA využíváme vyšetření ERA od roku 2015. Cílem naší práce bylo zjistit, u jakého zastoupení našich pacientek s předchozím selháním implantace bylo v době primárního přenosu embrya endometrium nereceptivní a zda a jakým způsobem se po novém transferu embrya v období implantačního okna změnil výsledek v podobě podílu dosažených klinických gravidit. Klinické těhotenství definujme jako přítomnost gestačního váčku v děloze.

SOUBOR PACIENTEK A METODIKA

Provedli jsme retrospektivní analýzu souboru 85 pacientek, které podstoupily vyšetření receptivity endometria ERA testem od srpna 2015 do začátku října 2018. Celkový počet biopsií pro primární nebo opakovanou analýzu ERA byl 94. Věkový průměr žen v tomto souboru byl 35,8 roku. U 74 pacientek bylo důvodem pro vyšetření předchozí selhání implantace, průměrný počet single kryoembryotransferů (KET) do ERA byl v této skupině 2,5 (minimum jeden, maximum šest), jedenáct žen podstoupilo vyšetření z preventivních důvodů již před prvním KET. V rámci všech kryoembryotransferů bylo přeneseno vždy jen jedno euploidní embryo ve stadiu blastocysty, které bylo po biopsii trofektodermu bez odkladu vitrifikováno a následně vyšetřeno metodou preimplantačního genetického testování všech 24 chromozomů.

Příprava pacientek na ERA byla shodná s přípravou na předchozí neúspěšný KET, u pacientek bez předchozího provedeného KET byla ERA provedena v předpokládaném implantačním okně. Celkem 48 pacientek podstoupilo ERA v nativním menstruačním cyklu, 37 ženám byla ERA provedena po HRT přípravě. Vhodný termín pro tzv. pipelle biopsii endometria byl stanoven na základě výsledku vyšetření vaginálním ultrazvukem. Po biopsii, kterou jsme prováděli ambulantně za aseptických podmínek, jsme odebranou tkáň přenesli do kryotuby se stabilizátorem mRNA, dodané firmou Igenomix, a uložili do lednice minimálně na čtyři hodiny. Pro množství odebírané tkáně jsme dodrželi předepsaný postup [1]. Kryotuba byla spolu s informovaným souhlasem pacientky a průvodním protokolem následně odeslána v originálním boxu do laboratoře Igenomix, Valencie, Španělsko. Výsledek jsme obdrželi do 14 dnů e-mailem v zaheslované podobě. Na základě identifikovaného tzv. personalizovaného implantačního okna (pWOI) jsme v průběhu následujících menstruačních cyklů provedli tzv. personalizovaný kryoembryotransfer (pKET), popřípadě biopsii endometria pro druhou ERA, byla-li doporučena. Při přípravě jsme zohlednili doporučenou délku expozice endometria progesteronu, působení progesteronu jsme tedy v případě zjištěného nereceptivního endometria buď zkrátili, nebo prodloužili o doporučený časový interval. Pokud bylo endometrium hodnoceno jako nereceptivní, dostali jsme ve výsledkovém formuláři informaci, zda se jedná o fázi prereceptivní, časně receptivní, pozdně receptivní nebo postreceptivní. V případě prereceptivního či časně receptivního endometria bylo doporučeno působení progesteronu na endometrium o 24 resp. 12 hodin prodloužit, v případě postreceptivního a pozdně receptivního endometria o 24 resp. 12 hodin zkrátit.

MONITOROVÁNÍ NATIVNÍHO CYKLU S INDUKCÍ OVULACE

KET respektive ERA v nativním cyklu s indukcí ovulace absolvovaly pacientky s pravidelným menstruačním cyklem, dříve prokázanou ovulací a výškou endometria minimálně 7,5 mm. Ultrazvukové vyšetření výšky a struktury endometria a velikosti dominantního folikulu bylo provedeno 2–4 dny před předpokládanou ovulací, v případě pravidelného menstruačního cyklu délky 28 dnů, tedy 10. až 12. den. Při velikosti dominantního folikulu 17 až 20 mm a výšce endometria ≥ 8 mm a jeho triple line struktuře byla indukována ovulace aplikací rekombinantního hCG (Ovitrelle 250 µg) ve 20.00–21.00 hodin, ob dva dny ráno, tedy zhruba za 60 hodin od aplikace hCG bylo zahájeno vaginální podání mikronizovaného progesteronu (Utrogestan v dávce 3krát denně 100 mg, respektive Crinone 8% gel 1×1). Progesteron byl podáván po dobu čtyř dnů a v průběhu pátého dne užití, tedy sedmý den od aplikace hCG, označíme-li den podání hCG jako den „0“ resp. den „hCG“, byla provedena biopsie endometria pro ERA. V tomto případě hovoříme dále v textu souhlasně s označením laboratoře Igenomix o vyšetření ERA v termínu hCG+7.

MONITOROVÁNÍ HRT CYKLU

Pomocí HRT byly ke KET resp. ERA připravovány pacientky s neovulačními cykly, nepravidelným menstruačním cyklem nebo zaznamenaným nízkým endometriem v přirozeném cyklu. Estradiol v transdermální (Climara) nebo perorální (Estrofem 2 mg) formě byl podáván od 1. do 3. dne menstruačního cyklu, 10.–12. den cyklu bylo provedeno vyšetření ultrazvukem, při triple line endometriu ≥ 8 mm byla zahájena transformace endometria vaginálně podaným mikronizovaným progesteronem (Utrogestan 3krát denně 200 mg). Progesteron byl podáván po dobu čtyř respektive pěti plných dnů, pátý resp. šestý den podání byla provedena biopsie endometria pro ERA. Při nálezu ovariální anechogenní struktury ovaria velikosti ≥ 13 mm bylo od vyšetření upuštěno a plánováno bylo po kontrole v dalším menstruačním cyklu. Čtyřdenní transformace endometria progesteronem byla prováděna do ledna 2018, všechny pacientky vyšetřené po tomto období měly pětidenní přípravu endometria progesteronem. Opět v souladu s označením laboratoře Igenomix užíváme termíny P+4 respektive P+5, kde „P“ znamená první den užití progesteronu, číslovka potom počet dalších dnů, po které byl podáván progesteron do provedení ERA. Ke změně délky podání progesteronu ze čtyř na pět dnů jsme přistoupili na základě průběžně dodávaných výsledků ERA, kdy jsme se po čtyřdenní aplikaci progesteronu a provedení ERA pátý den jeho podání častěji setkávali s prereceptivním endometriem. V režimu P+4 bylo vyšetřeno celkem 20 pacientek, v režimu P+5 to bylo 16 pacientek, jedna žena podstoupila ERA ve schématu P+6.

VÝSLEDKY

Z celkového počtu 85 vyšetřených pacientek mělo v době biopsie nereceptivní endometrium 31 žen (36,5 %), v nativním cyklu 13 ze 48 (27,1 %) vyšetřovaných žen, v HRT cyklu 18 ze 37 (48,6 %) žen. Po první biopsii a ERA testu nebylo možné u devíti žen období receptivity přesně definovat a byla doporučena druhá biopsie s definovaným časovým posunem. U všech devíti žen byla druhá analýza ERA již dostačující k identifikaci pWOI.

Při detailním rozboru skupiny pacientek podstupujících ERA v nativním cyklu s výsledkem nereceptivního endometria zjišťujeme, že ze 13 žen mělo pět žen endometrium v prereceptivní fázi, tři ženy v časně receptivní, dvě ženy v pozdně receptivní s doporučením provést pKET o 12 hodin dříve a tři ženy postreceptivní endometrium (graf 1). U tří žen z této skupiny nebylo možno o vhodném termínu pKET na základě první biopsie rozhodnout a byla doporučena nová ERA. U deseti žen bylo po první biopsii pWOI exaktně stanoveno a doporučen pKET.

Ve skupině žen s HRT přípravou mělo nereceptivní endometrium 18 žen ze 37 (48,6 %), při detailním pohledu mělo 12 žen endometrium v prereceptivní fázi, čtyři ženy v časně receptivní, jedna žena v pozdně receptivní a jedna žena ve fázi postreceptivní (graf 2). Šesti pacientkám z této skupiny, u nichž byl zjištěn profil odpovídající nereceptivní fázi, bylo doporučeno ERA vyšetření s definovaným časovým posunem opakovat.

Ve skupině pacientek s HRT přípravou v režimu P+4 jsme zjistili receptivní endometrium u sedmi z 20 (35 %), ve skupině s HRT přípravou v režimu P+5 u 12 ze 16 žen (75 %).

Do října 2018 absolvovalo pKET celkem 26 pacientek, u nichž bylo v době selhání implantace zjištěno nereceptivní endometrium, otěhotnělo 18 z nich (69,2 %). V nativním cyklu absolvovalo KET jedenáct žen s výslednými šesti graviditami (54,5 %) (graf 3), v HRT cyklu 15 žen, klinické gravidity dosáhlo 12 z nich (80,0 %) (graf 4). Pro vznik klinického těhotenství bylo třeba provést v průměru 1,5 pKET.

DISKUSE

V našem souboru 85 vyšetřených žen bylo zachyceno nereceptivní endometrium u více než třetiny z nich. Různí autoři udávají různý podíl pacientek s posunem implantačního okna, nejčastěji kolem 25 % [2, 8, 12, 14, 26, 30], laboratoř Igenomix ve svých materiálech uvádí při více než 32 000 vyšetřených žen v režimu P+5 podíl nereceptivního endometria 30,2 % [10], pilotní studie provedená u 17 pacientek s 1–6 implantačními selháními po IVF s darovanými oocyty zjistila nereceptivní endometrium v době ET u 100 % těchto žen [25]. V naší studii byl stejně jako v uvedených pracích mnohem častěji u žen s nereceptivním endometriem zastoupen výsledek „prereceptivní“ či „časně receptivní“ endometrium ve srovnání s postreceptivní fází, a to u 24 ze 31 pacientek (77,4 %).

Pokud jsme u pacientek s implantačním selháním po KET provedli po identifikaci jejich pWOI personalizovaný KET, zaznamenali jsme následně klinickou graviditu u 69,2 % z nich. Také autoři již dříve citovaných prací uvádějí podstatné zvýšení implantation rate, ev. pregnancy rate po pET resp. pKET ve srovnání s ET a KET [2, 10, 12, 25, 30]. Jako nejčastější příčiny selhání implantace morfologicky kvalitní blastocysty jsou uváděny aneuploidie embrya [17, 23], děložní patologie, jako myomy, endometriální polypy, intrauterinní adheze, nízké endometrium, děložní septum, endometritis, dále se uvádějí hydrosalpingy, endometrióza, imunologický faktor, trombofilní mutace [6, 22, 28]. V našich podmínkách jsme transferovali pouze euploidní embrya po provedeném preimplantačním genetickém testování počtu všech 24 chromozomů. U všech pacientek jsme předem vyšetřili hormonální profil, trombofilní mutace, antifosfolipidové protilátky, buněčnou imunitu, provedli vaginální ultrazvuk k vyloučení děložní anomálie, případně hysteroskopii, pokud bylo třeba a v případě zjištěné patologie byla užita odpovídající léčba. Pokud bychom s těmito vyšetřeními a provedenými opatřeními současně neprovedli identifikaci pWOI a při dalších transferech nezohlednili individuální posun implantačního okna, podstatná část našich pacientek by těhotenství nedosáhla. S možností užít nejnovější molekulárně diagnostické metody se ukazuje, že standardně prováděná výše popsaná vyšetření k maximalizaci efektu in vitro fertilizace, jakkoli mohou být rozsáhlá, nejsou dostačující. Identifikace pWOI se jeví jako zcela zásadní.

Po detekci receptivního období bylo k dosažení těhotenství potřeba provést průměrně 1,5 pKET, přičemž ve všech případech bylo striktně transferováno pouze jedno embryo. Například Ruiz-Alonso uvádí, že průměrný počet přenášených embryí v rámci jednoho pET byl 1,8 a k dosažení těhotenství bylo nutno po ERA provést průměrně 1,2 cyklu [25].

Pacientky s pozitivním výsledkem pKET absolvovaly tento transfer po různě dlouhé pauze od biopsie pro ERA, průměrně to byly 3,2 menstruační cykly. Jedna pacientka se dostavila k pKET dokonce s jedenáctiměsíčním odstupem od vyšetření ERA testu. Z toho je zřejmé, že detekované receptivní období zůstává, jak bylo v pilotních pracích prokázáno, konstantní po dlouhou dobu a také, že při vzniku těhotenství nehraje roli provedení samotné biopsie, jíž někteří autoři přisuzují pozitivní vliv na implantaci embrya. Tento tzv. scratching a jeho předpokládané uplatnění cestou lokální imunitní odezvy v děloze byl popsán celou řadou autorů, přičemž někteří se domnívají, že scratching zvyšuje pravděpodobnost implantace embryí [9, 18, 29], i když jiní tento pozitivní efekt nepotvrzují [11, 21, 32 ]. Spojitost implantace embrya po pKET a endometriálního scratchingu nepodporuje ani Maria Ruiz-Alonso, autorka prvních studií týkajících se ERA [24].

U dvou pacientek jsme zaznamenali velmi krátké implantační okno, přičemž receptivita endometria byla díky pokračující klinické graviditě potvrzena. V jednom případě se jednalo o vyšetření v nativním cyklu, kdy v době hCG+7 ERA detekovala postreceptivní a v době hCG+6, tedy o pouhý jeden den dříve, prereceptivní endometrium. Kryoembryotransfer byl z našeho rozhodnutí proveden v čase mezi dvěma biopsiemi, pacientka otěhotněla. Druhá pacientka podstoupila ERA v HRT cyklu, výsledek ERA P+5 zněl jako prereceptivní, výsledek druhé doporučené ERA P+7 byl postreceptivní. pKET byl proveden v čase P+6, výsledkem je pokračující těhotenství. Je tedy zřejmé, že v obou případech lze hovořit o období receptivity o délce trvání pouhých několika hodin.

Embryotransfer v cyklu s estrogen-gestagenní podporou by neměl být proveden dříve než po 3–4denní přípravě endometria progesteronem [19]. Na základě průběžného hodnocení dodaných výsledků ERA, z nichž jsme zjistili, že po čtyřdenním podání progesteronu mělo receptivní endometriumpouze 35 % pacientek, kdežto po pětidenním podání 75 % žen, jsme u všech žen v HRT cyklu prodloužili podání progesteronu z původních čtyř na pět dnů aplikace. Velmi pravděpodobně tímto krokem došlo ke zvýšení podílu těhotných po KET v cyklu s hormonální podporou.

V nativním cyklu po detekci pWOI a provedení pKET otěhotnělo 54,5 % žen, v HRT cyklu 80,0 %. V HRT cyklu posuzujeme pro naplánování KET pouze výšku a strukturu endometria, v nativním cyklu podle velikosti folikulu indukujeme ovulaci pomocí hCG. Nelze vyloučit, že v některých případech plánování pKET podle výsledku ERA dojde již před podáním injekce hCG k endogennímu peaku luteálního hormonu, a tím oproti našemu předpokladu k dřívější ovulaci a začátku produkce progesteronu. Tímto způsobem můžeme, zvláště u žen s krátkým implantačním oknem, transferovat embryo nechtěně opět do nereceptivního endometria. Roli může sehrát také přesnost měření dominantního folikulu, aktuální sonoakustické podmínky a interindividuální rozdíly v měření jednotlivými vyšetřujícími.

Diagnostika ERA nemá kontraindikaci, jde však o invazivní vyšetření, které většina žen pociťuje jako mírně bolestivé. Receptivita endometria může být hodnocena i proteomickou analýzou endometriálního sekretomu nebo cervikálního hlenu prostřednictvím hmotnostní spektrometrie, přičemž využití diagnostiky právě z cervikálního hlenu přináší výhodu neinvazivního přístupu [7].

Velmi slibnou se zdá být možnost rozšíření testu ERA o molekulárně diagnostickou metodu detekce endometriálního mikrobiomu. Děložní dutina byla dlouho považována za sterilní prostředí, nicméně jak klasické mikrobiologické kultivační techniky, tak nedávno zavedené molekulární metody, které mají výhodu v možnosti identifikovat i bakterie, u nichž kultivace selhává, odhalily u zcela asymptomatických žen v endometriu přítomnost celé řady bakterií. Osídlení endometria jinými bakteriemi než laktobacily je nově považováno za závažnou příčinu implantačního selhání a těhotenských ztrát. Testy EMMA (Endometrial Microbiome Metagenomic Analysis) a ALICE (Analysis of Infectious Chronic Endometritis), poskytované rovněž laboratoří Igenomix, umožňují ještě kvalitněji analyzovat a připravit děložní prostředí na implantaci embrya [15, 16]. Nespornou výhodou je možnost jejich provedení z identického vzorku endometria dodaného pro ERA.

ZÁVĚR

Námi prezentované údaje týkající se zjištěného významného podílu pacientek s posunem implantačního okna a současně vysokého zastoupení těch, které otěhotněly po personalizovaném kryoembryotransferu, podporují individuální přístup nejen při volbě stimulačního protokolu, přípravě na KET, užití jednotlivých laboratorních postupů a technik, ale i při správném časování přenosu embrya do přísně receptivního endometria po detekci implantačního okna.

MUDr. Lenka Hromadová

REPROMEDA

Biology Park

Studentská 812/6

625 00 Brno

e-mail: lhromadova@repromeda.cz