Stanovenie hladín sukcinylacetónu u časti zdravej detskej populácie na Slovensku

Súhrn

Cieľ štúdie: Cieľom štúdie bolo získať fyziologický rozsah hladiny sukcinylacetónu ako markera pre tyrozinémiu typu I u časti detskej populácie na Slovensku.

Metódy: Na splnenie cieľa sa v práci aplikovala tandemová hmotnostná spektrometria s priamym nástrekom, na úpravu vzorky suchej kvapky krvi sa použil komerčný kit Chromsystems pre aminokyseliny a acylkarnitíny a sukcinylacetón s derivatizáciou.

Výsledky: Z nášho súboru vzoriek a zvoleného postupu vyplýva fyziologický rozsah hladiny SUAC stanovený v suchej kvapke krvi od 0,32 do 0,70 µmol/l, s priemernou hodnotou 0,50 µmol/l a mediánom 0,49 µmol/l.

Záver: Vzhľadom na výhodu súčasného stanovenia aminokyselín, acylkarnitínov a sukcinylacetónu z jednej vzorky suchej kvapky krvi je táto metóda vhodná pre rutinnú prax v laboratóriách zaoberajúcich sa dedičnými metabolickými chorobami pre veľmi dôležitý skorý záchyt tyrozinémie I.

Klíčová slova:

tyrozinémia – sukcinylacetón – skríning – suchá kvapka krvi – tandemová hmotnostná spektrometria

ÚVOD

Za účelom identifikácie dedičných porúch metabolizmu tyrozínu sa stanovuje hladina tyrozínu pomocou tandemovej hmotnostnej spektrometrie (MS/MS). V rámci tyrozinémií rozlišujeme viacero typov – I, II, III a dočasný fyziologický stav nazývaný prechodná neonatálna tyrozinémia [1].

Neonatálna tyrozinémia je najčastejšia tyrozinémia u novorodencov spôsobená oneskorením dozrievania enzýmu 4-hydroxyfenylpyruvátdioxygenázy (HPPD). To spôsobuje prechodné zvýšenie hladiny tyrozínu v krvi, ako aj 4-hydroxyfenyllaktátu a 4-hydroxyfenylpyruvátu v moči [2]. Na druhej strane, tyrozinémia typu III je spôsobená nedostatkom HPPD v dôsledku genetickej poruchy. Tyrozinémia typu II sa vyskytuje v dôsledku nedostatku cytoplazmatickej tyrozíntransaminázy, ktorá inhibuje prvý krok metabolizmu L-tyrozínu na 4-hydroxyfenylpyruvát (obr. 1). Vrodená nedostatočná aktivita enzýmu 4-fumarylacetoacetáthydrolázy (FAH) spôsobuje tyrozinémiu typu I (Tyr I), autozomálne recesívnu poruchu, nazývanú tiež hepatorenálna tyrozinémia (OMIM 276700). Nedostatok FAH v dráhe katabolizmu tyrozínu vedie k progresívnym ochoreniam pečene, neurologickým poruchám a hypofosfatickým rozvratom [3]. Tyrozinémia predstavuje významný zdravotný problém v regiónoch s vysokým výskytom choroby, ako je Kanada [4], India [5] a Tunisko [6]. Tyrozinémia typu I postihuje celosvetovo približne 1 zo 100 000 novorodencov, v regiónoch Quebec je však incidencia 1:16 000, v severovýchodnej podoblasti Quebecu Saguenay-Lac-St.Jean v období rokov 1982–1986 bola dokonca 1:1846 [7], v Nórsku 1:60 000 [8].

Tyrozinémie II a III vykazujú signifikantné zvýšenie L-tyrozínu v krvi, zatiaľ čo u tyrozinémie typu I sú normálne hladiny tyrozínu pozorované v takmer tridsiatich percentách [9] diagnostikovaných pacientov s Tyr I, ktoré kulminujú falošne negatívne výsledky. Naproti tomu, zníženie hraničných hodnôt L-tyrozínu podstatne zvyšuje falošne pozitívne výsledky a zvyšuje záťaž opakovanej analýzy. Skríning založený na analýze a kvantifikácii L-tyrozínu ako markera na detekciu Tyr I nie je preto ani špecifický, ani dostatočne citlivý [10].

Defekt v enzýme FAH má za následok hromadenie 4-fumarylacetoacetátu (obr. 1), 4-sukcinylacetoacetátu a sukcinylacetónu (SUAC), o ktorých sa predpokladá, že spôsobujú hepatorenálne poškodenie [11]. Prejavom akútnej formy Tyr I je akútne zlyhanie pečene, u subakútnej formy majú pacienti ochorenie pečene so závažnou hepatopatiou, hepatomegáliou a koagulopatiou, ktoré môžu viesť k cirhóze pečene alebo hepatocelulárnemu karcinómu. Tyr I sa vyznačuje dysfunkciou renálnych tubulov, jej symptómami sú tiež krivica, neprospievanie a svalová hypotónia. Chronická forma je charakteristická pomaly postupujúcim ochorením pečene a obličiek, možná je kardiomyopatia a bolesti dolných končatín pri neuropatii [12]. Nové metódy vyvinuté na diagnostiku Tyr I zahŕňajú stanovenie SUAC ako špecifického markera produkovaného metabolizmom nahromadeného 4-fumarylacetoacetátu v dôsledku nedostatku FAH [10, 13–17].

Väčšina toxického SUAC sa viaže na bielkoviny, ako je albumín a niektoré aminokyseliny (lyzín, alanín), zatiaľ čo približne 10 % zostáva neviazaných [18]. Predchádzajúce snahy o skríning Tyr I s využitím vzorky moču [19–22] boli časovo náročné a neboli použiteľné pri vysoko priepustnom skríningu novorodencov.

Zatiaľ čo L-tyrozín spolu s inými aminokyselinami sa v novorodeneckom skríningu bežne stanovuje vo vzorkách suchej kvapky krvi (SKK) pomocou MS/MS, zistenie hypertyrozinémie sa najčastejšie spája s bežnou a prechodnou tyrozinémiou novorodenca. Na zlepšenie špecifickosti NS pre Tyr I sa vyvinulo niekoľko testov na meranie SUAC v SKK. Počiatočné prístupy k jeho meraniu boli nepriame, a to stanovením aktivity dehydratázy kyseliny delta-aminolevulónovej, ktorá sa inhibuje pôsobením SUAC. Rutinné merania dehydratázovej aktivity na kyseline delta-aminolevulónovej kolorimetrickou metódou [7] sa prvýkrát implementovali v programe NS v Quebecu. Schulze a kol. ďalej zlepšili analýzu pomocou spektrofotometrie, ktorá umožnila kvantitatívne merania a objektívnejšiu interpretáciu výsledkov [23]. Allard a kol. v programe NS [24] vyvinuli analýzu na báze MS/MS na priame meranie SUAC. Pretože extrakcia SUAC z SKK vyžaduje kyslé roztoky, súčasná extrakcia SUAC, aminokyselín a acylkarnitínov metanolom nie je možná. Allard preto použil SKK po extrakcii aminokyselín a acylkarnitínov na extrakciu a derivatizáciu SUAC pomocou hydrazínu s následnou analýzou pomocou MS/MS. Nevýhodou tohto prístupu je potreba dodatočného vybavenia a personálu potrebného na meranie SUAC v každej SKK. Z tohto dôvodu táto metóda nebola nikdy začlenená v skríningových laboratóriách ako primárny skríningový test. Avšak od polovice roka 2008 v rámci NS programu v Novom Anglicku (USA) túto metódu modifikovali a použili tak, že spojili viacero vzoriek dokopy a stanovovali SUAC v spojených extraktoch. Následne sa jednotlivo analyzovali len tie vzorky, ktoré boli obsiahnuté v spojenom extrakte so zvýšenou hodnotou SUAC [25]. Magera a kol. [26] stanovovali izoxazolpropionát, ako derivát SUAC v dvojstupňovom postupe, kedy sa SUAC stanovoval len vo vzorkách s koncentráciami L-tyrozínu nad zníženou hraničnou hodnotou. Tento prístup sa však považoval za nedostatočne citlivý vzhľadom na významné prekrytie koncentrácií tyrozínu u pacientov s Tyr I a normálnej populácie [27].

Jedna z metód súčasného stanovenia SUAC, aminokyselín a acylkarnitínov je navrhnutá tak, že sa najprv extrahujú aminokyseliny a acylkarnitíny, ktoré sa následne derivatizujú na butylestery. V ďalšom kroku sa extrahuje SUAC zo zostávajúcej SKK po pôsobení hydrazínu a následne sa adukt hydrazínu a SUAC derivatizuje na butylester. Derivatizované vzorky sa potom spoja a aminokyseliny, acylkarnitíny a SUAC sa stanovujú spoločne pomocou MS/MS v rámci jednej analýzy. Koncentrácia SUAC sa stanoví porovnaním s izotopicky značeným SUAC (¹³C5-SUAC) ako vnútorným štandardom [9, 14, 28]. Priemerná koncentrácia SUAC v 13 521 kontrolných vzorkách bola 1,25 μmol/l, 99,5% percentil koncentrácie SUAC bol 2,65 μmol/l, rozsah koncentrácie SUAC u pacientov s tyrozinémiou I bol 13–81 μmol/l [9]. Marca a kol. [28] uvádzajú hraničnú hodnotu SUAC v SKK <2,4 µmol/l. Al-Dirbashi a kol. [29] uverejnili prácu, v ktorej sa SUAC extrahoval z terčíka SKK a derivatizoval danzylhydrazínom. Derivátový extrakt sa analyzoval pomocou UPLC-MS/MS. Hraničná hodnota SUAC v SKK u zdravých detí bola 0,63 µmol/l (n = 151). Vo vzorkách SKK od pacientov so stanovenou Tyr I (n = 11) bola koncentrácia sukcinylacetónu 6,4 až 30,8 µmol/l. V práci Sander a kol. [30] sa uvádza  hraničná hodnota pre SUAC <10 μmol/l.

V roku 1992 bola navrhnutá liečba herbicídom 2-(2-nitro-4-trifluórmetylbenzoyl)-1,3-cyklohexándiónom (NTBC), pretože je účinným inhibítorom HPPD, ktorá je enzýmom v dráhe degradácie tyrozínu pred reakciou s FAH [31]. Tento farmakologický zásah zabraňuje tvorbe 4-maleyl- a 4-fumarylacetoacetátu, ako aj súvisiacich derivátov, o ktorých je známe, že spôsobujú patológie pozorované v Tyr I [32]. Spolu s diétou so zníženým obsahom L-fenylalanínu a L-tyrozínu [33] sa perorálne podávanie NTBC stalo základnou liečbou pre pacientov s Tyr I. NTBC je komerčne dostupný ako Orfadin^® (nitizinón) od roku 2002. Larochelle a kol. [34] opisujú výsledok pacientov s Tyr I narodených v rokoch 1984 až 2004 v Quebecu. Dokázalo sa, že perorálne podávanie NTBC je nielen lepšie ako samotná diétna liečba a bezpečnejšie ako transplantácia orgánov, ale je obzvlášť účinné, keď sa s liečbou začne počas prvého mesiaca života [34, 35].

METÓDY

Príprava vzoriek

K dispozícii sme mali 840 vzoriek suchej kvapky krvi, z toho 720 zdravých novorodencov a 120 vzoriek zdravých detí vo veku od 2 mesiacov do 10 rokov. Vzorky SKK sme získali z Novorodeneckej kliniky Univerzitnej nemocnice v Martine a Oddelenia klinickej biochémie Národného ústavu detských chorôb v Bratislave.

Príprava vzorky je založená na účinnej extrakcii analytov z odberového papiera a následnej derivatizácii analytov na butylestery pomocou komerčného kitu Chromsystems^@ pre aminokyseliny a acylkarnitíny a sukcinylacetón s derivatizáciou. Aby sa zabezpečila reprodukovateľná kvantifikácia analytov, pre kalibráciu a meranie sa využívajú stabilné, izotopovo značené interné štandardy. Pre SUAC sa použil ¹³C značený štandard SUAC.

Z odobratej vzorky suchej kvapky krvi sa vystrihne terčík s priemerom 3 mm a vloží sa do jamky v 96-jamkovej doštičke. Pridá sa 200 µl roztoku zmesi interných štandardov aminokyselín a acylkarnitínov v extrakčnom činidle a nasleduje miešanie doštičky, ktorá je prikrytá vzduchotesnou fóliou po dobu 20 min pri laboratórnej teplote a otáčkach 650 rpm. Po odstránení fólie sa supernatant odoberie, prenesie do novej jamky a ďalej sa spracováva na stanovenie aminokyselín a acylkarnitínov. K zostávajúcemu terčíku sa pridá 150 µl interného štandardu sukcinylacetónu v extrakčnom činidle s obsahom hydrazínu. Sukcinylacetón s hydrazínom tvorí aromatický pyrazolový derivát sukcinylacetónu (obr. 2), čím sa umožní jeho extrakcia.

Prikrytá doštička sa mieša pri otáčkach 600 rpm po dobu 30 min pri 60 °C, následne sa odkryje, supernatant sa prenesie do novej jamky a nechá sa pod prúdom vzduchu pri miešaní odpariť do sucha pri teplote 60 °C. Pridá sa 60 µl derivatizačného činidla (HCL v butanole), doštička sa opäť prikryje fóliou a nasleduje derivatizácia po dobu 15 min pri 60 °C a 650 rpm (obr. 3).

Po derivatizácii sa fólia odstráni, derivatizačné činidlo sa nechá odpariť pod prúdom vzduchu do sucha pri otáčkach 650 rpm a teplote 60 °C. Nakoniec sa pridá 100 µl rekonštitučného činidla, pretrepe sa pri laboratórnej teplote po dobu cca 2 minúty a tento roztok sa dávkuje do systému FIA-MS/MS.

FIA-MS/MS

Desať µl vzorky sa dávkuje použitím autosamplera (Finnigan Surveyor Autosampler Plus) do hmotnostného spektrometra s trojitým kvadrupólom TSQ Quantum QC (Thermo Fisher Scientific Inc.) použitím HPLC pumpy Finnigan Surveyor MS Plus. Ako iónový zdroj sa použil elektrosprej (ESI) pracujúci v pozitívnom móde. Nastavenia ESI ionizátora boli nasledovné: napätie 3500 V, tlak dusíka ako sušiaceho plynu 20, pomocného plynu 7 a čistiaceho plynu 1 i.u. (prístrojová jednotka); teplota kapiláry iónového transferu do MS bola 325 °C.

Merania MS/MS sa uskutočnili v SRM (selective reaction monitoring) móde s nasledujúcimi m/z prechodmi pre SUAC m/z 211→137 a pre izotopovo značený štandard m/z 216→142. Ako kolízny plyn sa použil argón s tlakom 0,6 mTorr a hodnotou kolíznej energie 14 V.

VÝSLEDKY

Kvantifikácia sa uskutočnila porovnaním plôch píkov pre analyt a zodpovedajúci ¹³C izotopovo značený vnútorný štandard. Správnosť merania sa overila použitím kontrolnej kvapky krvi so známou hladinou SUAC, ktorá sa použila aj na výpočet korekčného faktora pre každú várku vzoriek.

Výťažnosť SUAC bola cca 50%, rovnako ako uvádza výrobca používaného kitu. V rámci 4 mesiacov, kedy sa merania uskutočňovali každý týždeň, bola priemerná hodnota korekčného faktora 2,37 v rozsahu od 1,94 do 2,96 (medián 2,37).

Na štatistické vyhodnotenie sme dáta získané zo skupiny zdravých novorodencov a zdravých detí vo veku od 2 mesiacov do 10 rokov porovnali pomocou analýzy dvoch nezávislých výberov (QC Expert, p = 0,05). Výsledkom testu zhody rozptylov, testu zhody priemerov a testu dobrej zhody rozdelenia je zhoda vo všetkých testovaných parametroch na hladine významnosti 0,05 (tab. 1).

Opakovateľnosť sa hodnotila pri opakovaní merania hladín SUAC u zdravých jedincov v rámci dvoch týždňov pri dvoch koncentračných hladinách, medziľahlá presnosť merania sa hodnotila v štyroch nezávislých meraniach pri dvoch koncentračných hladinách. Hodnoty nepresiahli 3 % a sú uvedené v tabuľkách 2 a 3.

Obrázok 4 zobrazuje jednotlivé hodnoty sukcinylacetónu (SUAC) vo vzorkách suchej kvapky krvi namerané nami použitou metódou. Po štatistickom vyhodnotení 95. percentil určuje hornú hladinu fyziologickej hodnoty a 5. percentil určuje dolnú hladinu fyziologickej hodnoty. Z nášho súboru vzoriek a zvoleného postupu vyplýva fyziologický rozsah hladiny SUAC stanovený v suchej kvapke krvi od 0,32 do 0,70 µmol/l, s priemernou hodnotou 0,50 µmol/L a mediánom 0,49 µmol/l.

DISKUSIA

Rozptyl korekčného faktora, ktorý sa vypočítaval pri príprave vzorky, v rozsahu od 1,94 do 2,96, je veľký. Dôvodom je výťažnosť. Najväčší vplyv na výťažnosť SUAC má teplota pri extrakcii, rozsah vysušenia, resp. presušenia extraktu a teplota pri derivatizácii.

Pri teplote extrakcie a derivatizácie nižšej ako 60 °C dochádza k nekvantitatívnej extrakcii a derivatizácii, pri teplote 85 °C je uvádzaný rozklad SUAC. Pri sušení prvého supernatantu z kroku extrakcie je potrebné dbať na dodržanie vhodného času sušenia, t.j. do stavu, kedy je jamka suchá, presušenie vedie k rozkladu žiaduceho produktu. Pri kroku derivatizácie je optimálny čas 15 minút, pri predlžovaní tohto času sa výťažnosť už ďalej nezvyšuje. Viackroková príprava vzorky, vrátane dvoch krokov sušenia a derivatizácie vyžaduje, aby sa všetky vzorky v rámci jednej mikrotitračnej doštičky spracovali súčasne pri rovnakých podmienkach a je nutná súčasná analýza referenčnej suchej kvapky krvi so známou hodnotou koncentrácie SUAC.

Hodnota SUAC získaná nami použitou metódou zo suchej kvapky krvi 0,70 µmol/l, ktorú považujeme za hraničnú hodnotu, je porovnateľná s publikovanou hodnotou 0,63 µmol/l [29] a značne nižšia ako publikované hodnoty <2 μmol/L [24], <2,4 μmol/L [28], <5 μmol/L [26] a <10 μmol/L [31]. Nami stanovený fyziologický rozsah je nižší ako publikovaný 0,5–3,0 µmol/l [9] a vyšší ako publikovaný 0–0,30 µmol/l [36]. Rozdielnosť v týchto hodnotách vyplýva z rozdielností použitých metodík, preto pre správnu interpretáciu výsledkov analýz je pre každé laboratórium podmienkou určenie vlastného rozsahu fyziologických hodnôt a hraničnej hodnoty pre SUAC.

ZÁVER

Pri súčasnej ročnej pôrodnosti na Slovensku je výskyt tyrozinémie typu I približne 1 prípad za 2 až 3 roky. V súčasnosti je základom liečby detí s tyrozinémiou typu I liek Orfadin^® a súčasne veľmi prísna nízkobielkovinová diéta, ktorá znižuje príjem aminokyseliny L-tyrozínu v strave, doplnená preparátom esenciálnych aminokyselín bez fenylalanínu a tyrozínu. Aminokyselinové zmesi zabezpečujú, že nutričné požiadavky pre všetky ďalšie aminokyseliny sú splnené a podporujú tak rast a vývoj. Tyrozinémia typu II a III sú ešte vzácnejšie a ich príznaky sú miernejšie.

Táto práca sa zamerala na stanovenie hladiny sukcinylacetónu v suchej kvapke krvi u zdravej novorodeneckej a detskej populácie na Slovensku. V našom laboratóriu sme na vzorke 840 zdravých jedincov určili fyziologický rozsah sukcinylacetónu (SUAC) v suchej kvapke krvi od 0,32 do 0,70 µmol/l, s priemernou hodnotou 0,50 µmol/l a mediánom 0,49 µmol/l. Zvolená metóda spracovania suchej kvapky krvi je viackroková a vyžaduje, aby sa všetky vzorky v rámci jednej mikrotitračnej doštičky spracovali pri rovnakých podmienkach. Vzhľadom na citlivosť na zmenu podmienok predúpravy je tiež pre spoľahlivú interpretáciu výsledkov nevyhnutná súčasná analýza referenčnej suchej kvapky krvi so známou hodnotou koncentrácie SUAC.

Pre výhodu súčasného stanovenia aminokyselín, acylkarnitínov a sukcinylacetónu z jednej vzorky suchej kvapky krvi vzhľadom k tomu, že v súčasnosti nie je zavedený na Slovensku skríning hepatorenálnej tyrozinémie a súčasne je veľmi dôležitý včasný záchyt tyrozinémie I a nasadenie terapie, by sa táto metóda mala dostať do rutinnej praxe v laboratóriách zaoberajúcich sa dedičnými metabolickými chorobami.

Poďakovanie

Tento článok vznikol vďaka podpore v rámci OP Výskum a vývoj pre dopytovo-orientovaný projekt: Univerzitný vedecký park Univerzity Komenského v Bratislave, ITMS 26240220086 spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja a projekt: Vybudovanie kompetenčného centra pre výskum a vývoj v oblasti molekulárnej medicíny, ITMS 26240220071.

Došlo: 9. 7. 2019

Přijato: 20. 11. 2019

RNDr. Gabriela Addová, PhD.

Chemický ústav

Prírodovedecká fakulta Univerzity Komenského

Ilkovičova 6

842 15 Bratislava

Slovenská republika

e-mail: gabriela.addova@uniba.sk