Výskyt a vlastnosti baktérií Staphylococcus aureus ve vepřovém mase

Súhrn

Tato studie byla zaměřena na sledování kontaminace syrového vepřového masa bakteriemi Staphylococcus aureus v tržní síti a jejich schopnosti podílet se na vzniku alimentárních intoxikací. Kmeny byly charakterizovány genotypovými metodami. Ze 197 vyšetřených vzorků byly ve 43 (21,8 %) detekovány bakterie S. aureus. Schopnost produkovat enterotoxiny byla potvrzena u 21 (48,8 %) izolátů, gen zodpovědný za tvorbu enterotoxinu H byl potvrzen nejčastěji (81 %). U všech izolátů byla sledována rezistence k antimikrobiálním látkám diskovou difuzní metodou a přítomnost genu mecA zodpovědného za rezistenci k meticilinu (MRSA). Dva kmeny izolované v této studii nesly gen mecA (MRSA). U obou izolátů byla potvrzena příslušnost k sekvenačnímu typu 398 (ST398).

Klíčová slova:
MRSA – tržní síť – enterotoxiny – rezistence

ÚVOD

Staphylococcus aureus (S. aureus) je bakterií, která se významnou měrou podílí na vzniku alimentárních intoxikací bakteriálního původu [12]. Výskyt tohoto etiologického agens je popisován u lidí i zvířat. U lidí se vyskytuje zejména na sliznicích a kůži, přibližně 20 % dospělých osob je dlouhodobě osídleno baktériemi S. aureus a přibližně 60 % osob je kolonizováno v průběhu svého života intermitentně [21]. Infikována či kolonizována mohou být i potravinová zvířata a při následném jatečném opracování se mohou bakterie S. aureus přenést i na jatečně opracovaná těla [8]. Zdrojem kontaminace suroviny může ale být i prostředí a personál jatečných a maso zpracujících provozů nebo pracovní pomůcky a pracovní plochy v obsluhovaných úsecích prodeje masa v tržní síti.

Z pohledu bezpečnosti potravin je výskyt bakterií S. aureus v porcovaném mase distribuovaném v tržní síti významný, zejména kvůli své schopnosti produkovat termostabilní stafylokokové enterotoxiny, které u spotřebitelů mohou vyvolat stafylokokovou enterotoxikózu. V současné době je popsáno 21 stafylokokových enterotoxinů, ale v souvislosti se vznikem enterotoxikózy jsou popisovány pouze enterotoxiny A, B, C, D, E a H. [18].

Rezistence bakterií k antimikrobiálním látkám je v posledním desetiletí závažným problémem jak v humánní, tak i veterinární medicíně. Bakterie S. aureus a meticilin-rezistentní S. aureus (MRSA) se vyskytují kromě humánní populace i u zvířat včetně potravinových. Tyto bakterie se rozšířily zejména v chovech prasat, jedná se o klonální komplex MRSA označovaný jako CC 398 [6]. Výskyt MRSA tohoto klonálního komplexu byl v chovech prasat poprvé popsán ve Francii [2]. Později se tento klonální komplex rezistentních stafylokoků rozšířil i v Nizozemí [23] a dalších evropských zemích, USA, Kanadě a Asii [19]. Tyto bakterie se mohou šířit nejen na farmách, ale také na jatkách, kde může docházet ke kontaminaci jatečně upravených těl a následně i vybouraného masa. Výskyt tohoto klonálního komplexu je již zaznamenáván také v populaci lidí [6]. Při šíření tohoto typu MRSA se diskutuje také o otázce možné kolonizace spotřebitelů při manipulaci s masem v domácnostech.

MATERIÁL A METODY

Odběr a charakteristika vzorků

Celkem bylo v roce 2012 a 2013 odebráno 197 vzorků chlazeného vepřového masa. Vzorky byly nakoupeny v tržní síti v 16 obchodech a obchodních řetězcích České republiky. Vzorky masa byly buď balené přímo výrobcem (90) nebo porcované v obsluhovaných úsecích s prodejem masa (107). Maso pocházelo ze tří zemí, 158 (80,2 %) vzorků z České republiky a 39 (19,8 %) bylo importováno, 31 vzorků z Polska a 8 z Rakouska.

Při odběru byly všechny vzorky individuálně zabaleny do mikrotenových sáčků, aby se zabránilo vzájemné kontaminaci vzorků a v chlazeném stavu byly transportovány do laboratoře, kde byly neprodleně vyšetřeny.

Izolace bakterií S. aureus

V laboratoři byly odebrány stěry z povrchu masa pomocí sterilních houbiček (3MTM Sponge-stick, USA), které byly umístěny do sáčků s 30 ml pufrované peptonové vody (PPV, Oxoid, Velká Británie) a zhomogenizovány na zařízení typu Stomacher. Bakterie S. aureus byly ve vzorcích detekovány paralelně dvěma způsoby – izolací na médium Baird-Parker (Oxoid, Velká Británie) z pufrované peptonové vody inkubované při 37 °C po dobu 18–24 hodin a dále použitím metodiky s dvoustupňovým pomnožením. Po homogenizaci vzorku bylo 5 ml PPV přeneseno do média Mueller-Hinton (Oxoid, Velká Británie) s 6,5 % přídavkem NaCl a po inkubaci, která probíhala ve všech krocích při 37 °C 18–24 hodin, byl 1 ml inokulován do trypton-sojového bujonu s cefoxitinem (5 µg/ml) a aztreonamem (7,5 µg/ml) (Labmediaservis, CZ). Další den pak byla suspenze vyočkována na Baird-Parker agar a BrillianceTM MRSA 2 agar (Oxoid, Velká Británie).

Typické kolonie ze selektivních agarů byly vyočkovány na půdu s přídavkem 5 % ovčí krve (Labmediaservis, CZ) a uchovány pro následnou charakteristiku.

Identifikace suspektních bakterií S. aureus

Suspektní kolonie byly konfirmovány metodou PCR, byl detekován fragment specifický pro bakterie S. aureus o velikosti 108 bp [10].

Detekce genů zodpovědných za produkci stafylokokových enterotoxinů

U každého kmene S. aureus bylo metodou PCR provedeno stanovení přítomnosti genů sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei podle protokolu popsaném autory Monday a Bohach [11] a Løvseth et al. [9].

Stanovení rezistence k antimikrobiálním látkám

U kmenů S. aureus bylo provedeno stanovení rezistence k panelu 12 antimikrobiálních látek za použití diskové difuzní metody s antibiotickými disky firmy Oxoid (UK) na médiu Mueller-Hinton (Biokar, FR). Byla sledována rezistence k následujícím látkám: OXA, oxacilin (1 µg); TET, tetracyklin (30 µg); ERY, erytromycin (15 µg); SXT, sulfometoxazol s trimetoprimem (25 µg); CN, gentamicin (10 µg); DA, klindamycin (2 µg); C, chloramfenikol (30 µg); CTX, cefotaxim (30 µg); CIP, ciprofloxacin (5 µg); FOX, cefoxitin (30 µg); RD, rifampicin (5 µg); TEC, teikoplanin (30 µg). Jako kontrola byl použit kmen S. aureus ATCC 25923, výsledky byly interpretovány podle standardů CLSI [5].

Detekce genu mecA a sekvenačního typu 398 metodou PCR

Všechny izolované kmeny byly testovány na přítomnost genu mecA, kódujícího rezistenci k meticilinu [4] a dále bylo provedeno potvrzení příslušnosti ke sekvenačnímu typu 398 podle autorů [22].

Statistická analýza

Statistická analýza výsledků byla provedena programem STAT PLUS (VÚVeL, CZ).

VÝSLEDKY A DISKUSE

Prevalence S. aureus ve vzorcích masa

Ze 197 odebraných vzorků chlazeného masa byla přítomnost bakterií S. aureus potvrzena u 43 vzorků (21,8 %). Jednalo se o 31 vzorků masa baleného výrobcem a 12 vzorků masa z volného prodeje baleného v tržní síti. Rozdíly ve výskytu bakterií S. aureus ve vzorcích podle typu balení byly statisticky významné (p < 0,01), překvapivě však byla zjištěna vyšší incidence stafylokoků ve vzorcích masa baleného přímo výrobcem. Tento fakt může být způsoben vyšší vodní aktivitou na povrchu masa balených vzorků a tím i lepšími podmínkami pro přežívání stafylokoků.

Prevalence bakterií S. aureus ve vepřovém mase se liší podle výsledků zveřejněných různými autory. Zatímco autoři Pesavento et al. [14] uvádí 15,5 % pozitivních vzorků (10/66), autoři O’Brien et al. [13] uvádí 67 % pozitivních vzorků masa (201/300).

Prevalence genů zodpovědných za produkci stafylokokových enterotoxinů

U 15 kmenů byla zjištěna přítomnost genů zodpovědných za tvorbu enterotoxinů. Nejčastěji byl zjišťován gen seh (12), který kóduje produkci nově popsaného enterotoxinu H, jehož přítomnost se v potravinách (mase) nedá prokázat metodami běžně používanými pro průkaz klasických enterotoxinů. Přehled genů detekovaných u izolátů získaných v této studii je uveden v tabulce 1. Izoláty pocházely ze vzorků masa baleného i nebaleného a byly nakoupeny v různých obchodech a lokalitách. (Tab. 1)

Stafylokokový enterotoxin H byl charakterizován autory Ren et al. [16]. Jedná se o termostabilní protein, jehož schopnosti vyvolat enterotoxikózu byly již potvrzeny různými studiemi [15]. Tento enterotoxin není zařazen mezi klasické enterotoxiny, a proto se podle platné legislativy v potravinách ani neprokazuje. Běžně používané metody ke stanovení enterotoxinu v potravinách jako jsou ELISA a ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay, VIDAS) budou v přítomnosti enterotoxinu H vykazovat negativní výsledky. Také v České republice již byl výskyt genu seh u potravinových izolátů S. aureus opakovaně prokázán. Autoři Šťástková et al. [20] uvádí 5% prevalenci u izolátů ze syrového kravského mléka a 21% zastoupení genu seh v potravinách uvádí i autoři Růžičková et al. [17]. Také Kim et al. [7] uvádí výskyt genu seh u izolátů S. aureus získaných z potravin určených k přímé spotřebě z tržní sítě v Koreji za častý.

Stanovení rezistence k antimikrobiálním látkám

Rezistence izolátů S. aureus alespoň k jedné z testovaných antimikrobiálních látek byla zjištěna v 27,9 % případů (12/43). Z celkem 12 rezistentních kmenů jich 6 bylo izolováno z importovaných vzorků (50 %). Nejčastěji byla zjištěna rezistence k erytromycinu 14 % (6/43), následovaná rezistencí ke klindamycinu 9,3 % (4/43), tetracyklinu 7 % (3/43), gentamicinu a chloramfenikolu 4,7 % (2/43). Dva izoláty z vepřového masa vykázaly rezistenci k oxacilinu, cefotaximu, klindamycinu a tetracyklinu. Metodou PCR u nich byla potvrzena přítomnost genu mecA a byly proto označeny jako meticilin rezistentní S. aureus (MRSA). Jeden z těchto izolátů byl rezistentní i ke chloramfenikolu a ciprofloxacinu. U obou kmenů byla dále zjištěna přítomnost úseku DNA specifického pro kmeny náležící k sekvenačnímu typu 398. Aktuální situace výskytu MRSA ve vepřovém mase v tržní síti v České republice není známa, tato studie uvádí první nálezy MRSA ve vepřovém mase u nás Autoři Agersø et al. [1] uvádí nálezy MRSA ve sledované komoditě následovně – 19 % v Nizozemí (3/16), 4,6 % v Dánsku (7/153) a 2,1 % v Německu (3/142). V této studii byl potvrzen výskyt 1 % (2/197). V roce 2008 byl v České republice sledován výskyt MRSA v prostředí chovů prasat, byla potvrzena prevalence 1, 8 % (5/283) [3].

ZÁVĚR

Prevalence výskytu baktérií S. aureus ve vepřovém mase není vysoká (21,8 %), závažným ale může být výskyt kmenů nesoucích geny pro tvorbu stafylokokových enterotoxinů a kmenů s vícečetnou rezistencí k antimikrobiálním látkám.

V této studii bylo prokázáno, že ve vepřovém mase je dominantní výskyt kmenů S. aureus schopných produkovat enterotoxin H. Vzhledem k termostabilitě stafylokokových enterotoxinů může být pokrm (potravina) obsahující kontaminované vepřové maso vehikulem intoxikace. Laboratorní vyšetření na přítomnost enterotoxinů v potravině však může vykazovat falešně negativní výsledky, protože běžně používané metody tento typ enterotoxinu nedetekují. Vepřové maso může být kontaminováno i multirezistentními kmeny S. aureus včetně MRSA. První výskyt těchto kmenů ve vepřovém mase v tržní síti v České republice popisuje tato studie.

Tato studie vznikla za finanční podpory  Ministerstva zemědělství ČR, projektu NAZV KUS QJI210284 a projektu MŠMT AdmireVet CZ 1.05/2.1.00/01.006ED.

Do redakce došlo dne 12. 2. 2014.

Adresa pro korespondenci:

MVDr. Ivana Koláčková, Ph.D.

Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i.

Hudcova 296/70

621 00 Brno

e-mail: kolackova@vri.cz