Změny v hladinách prolinu v moči mohou korelovat s úspěšností operační léčby karcinomu prostaty

Súhrn

Od roku 1980 je pro sledování stavu nádorového onemocnění prostaty používáno stanovení prostatického specifického antigenu (PSA) v krevním séru, následované dalšími diagnostickými postupy. Relativní spolehlivost komplexu těchto vyšetření je vykoupena nepříjemným, invazivním poškozením tkáně. Z toho důvodu se v nynější době hledají molekuly, které by mohly stresové situace eliminovat a zvýšit záchyt (diagnostické markery) a také poskytnout informace o úspěšnosti operační léčby karcinomu prostaty (CaP). Naše výsledky srovnání dvou skupin pacientů (n = 30) ukazují, že pacienti, u kterých není jasné, zda byl karcinom operační léčbou kompletně odstraněn, vykazují v moči významně vyšší hladiny prolinu než pacienti, kteří byli po 6.–8. měsících po radikální prostatektomii prohlášeni za vyléčené. Ačkoliv se prolin jeví jako slibný prognostický biomarker, k potvrzení jeho spolehlivosti je nutná rozsáhlá studie velkého souboru dlouhodobě sledovaných pacientů.

Klíčová slova:
karcinom prostaty – biomarker – prognóza – iontově výměnná chromatografie – prolin

ÚVOD

V Evropě a Spojených státech amerických je karcinom prostaty (CaP) nejčastějším typem nádorového onemocnění u mužů v rozmezí 45–85 let (1, 2). Incidence roste ročně přibližně o 2–3 % a za posledních 15 let se počet nahlášených nemocných ztrojnásobil (1). Předpokládá se, že se u mladších mužů rozvíjejí agresivnější formy onemocnění než u starších ročníků (3). Příčinou vzniku všech zhoubných nádorů je řada změn v některých buňkách, v jejichž důsledku začnou tyto buňky vykazovat abnormální chování (4), nekontrolovaně se množí na úkor zdravé tkáně, kterou tím ničí (4). Mechanismus vzniku a vývoje karcinomu prostaty není zcela podrobně objasněn, avšak v současné době již bylo identifikováno několik rizikových faktorů odpovědných za vznik a progresi tohoto onemocnění. Jedná se zejména o etnický původ, genetické predispozice, věk, obezitu a životní styl (5). Bylo zjištěno, že s každou započatou dekádou života se riziko vzniku karcinomu prostaty zdvojnásobuje (6) a rozvoj jak benigních, tak maligních novotvarů je úzce spřízněn s rodinou anamnézou, zejména s dříve diagnostikovanými nádory prostaty či prsu (7). Zajímavostí také je, že incidence karcinomu prostaty je přibližně o 70 % vyšší u etnických černochů v porovnání s ostatními rasami (8), což bývá vysvětlováno vyšší expozicí androgenům v průběhu života v porovnání s jinými etnickými skupinami. V současné době se diagnostika karcinomu prostaty zakládá na stanovení hladiny prostatického specifického antigenu (PSA) v séru, digitálním rektálním vyšetření a následnou biopsii. Ačkoliv se diagnostické postupy neustále vyvíjí, při diagnózách karcinomů prostaty dochází stále k falešně pozitivním či negativním výsledkům (9), což mnohdy vede ke zbytečnému provedení invazivní biopsie (10). Z hlediska diagnostického i prognostického jsou hledány další biomarkery, které by mohly zvýšit specificitu a efektivitu diagnostických postupů a pomoci evaluovat úspěšnost aplikované léčby.

POTENCIONÁLNÍ BIOMARKERY KARCINOMU PROSTATY

PSA je doposud jediným biomarkerem karcinomu prostaty, který je používán v klinické praxi (11), nicméně bylo identifikováno několik faktorů, které zvyšují jeho hladinu v séru – jako zánět močových cest (12, 13) či jízda na kole (14). Pacienti s vyšší hladinou PSA jsou indikováni k transrektální biopsii pod ultrazvukovou kontrolou. Toto vyšetření vykazuje výbornou efektivitu, avšak je časově náročné a hlavně invazivní, což je pro pacienta velmi nepříjemné (15). Na tomto místě je také třeba zdůraznit, že i přes značný vývoj v invazivní diagnostice jsou pacienti stálé ohroženi nežádoucími komplikacemi při odběru bioptátu. Nejen z těchto důvodu jsou proto v současné době zkoumány nové ne-invazivní markery, které by v budoucnu výše zmíněné skutečnosti mohly eliminovat (16). Jako matrice pro identifikaci těchto molekul by ideálně měla posloužit moč, která je jednou z nejlépe dostupných tělesných tekutin. V literatuře již bylo popsáno mnoho potencionálních diagnostických biomarkerů, z nichž nejlepší výsledky byly prokázány u annexinu A3 (ANXA3) (17, 18), PCA3 (prostate cancer antigen 3) (19, 20), arginin amidázy (20), sarkosinu (N-methylgycin) (9, 22, 23) a prolinu (3, 24). Nepolární aminokyselina prolin (C₅H₉NO₂) byla již dříve vyhodnocena jako potencionálně vhodný diagnostický marker, jejíž hladiny se u pacientů s maligními novotvary prostaty rapidně liší od pacientů zdravých (25). Metabolismus prolinu hraje významnou roli v apoptických signalizačních drahách (26) a prolin dehydrogenáza (PRODH), katalyzující první krok v degradaci prolinu (obr. 1) odpovídá za řízení exprese strážce genomu – proteinu p53 (27). Ačkoliv naše dřívější studie potvrdila diagnostický potenciál prolinu (3), cílem této studie bylo provést pilotní experimentální studii určení hladiny prolinu v moči pacientů s diagnostikovaným karcinomem prostaty.

MATERIÁL A METODY

Klinické vzorky moči pacientů s karcinomem prostaty

V rámci experimentální práce byly použity vzorky moči (n = 60) získané od pacientů s karcinomem prostaty. Vzorky byly získány z Fakultní nemocnice v Motole v Praze a zpracovány se souhlasem etické komise (referenční číslo EK-377/13). Všichni pacienti byli podrobeni radikální prostatektomii a na základě pozorování byli rozděleni na dvě experimentální skupiny. První skupinu tvořili pacienti s potvrzeným pozitivním chirurgickým okrajem (n = 15). Pozitivní chirurgický okraj byl definován jako přítomnost nádorových buněk ve značeném okraji resekovaného preparátu. Druhá skupina byla tvořena pacienty, kteří byli prohlášeni po 6–8 měsících za vyléčené (n = 15). V každé skupině byly analyzovány vzorky odebrané před radikální prostatektomií a 3 měsíce po ní.

Příprava klinických vzorků pro analýzu

Před vlastní analýzou byly vzorky moči podrobeny kyselé hydrolýze v mikrovlnném reaktoru MW 3000 (Anton Paar, Graz, Rakousko). Po přidání ředícího pufru sodíkového cyklu (5 ml C₄H₁₀O₂S; 0,10 g N₃Na; 11 g NaCl; 14 g C₆H₈O₇ na 1 l vody) byly vzorky centrifugovány při 25 000 g, 4 °C po dobu 20 minut v mikrocentrifuze 5417R (Eppendorf AG, Hamburg, Německo). Po centrifugaci byly vzorky naředěny neutralizačním roztokem (0,6 M NaOH, rozpuštěný v ředícím pufru Na cyklu). Takto připravené vzorky byly analyzovány pomocí iontově-výměnné kapalinové chromatografie (podrobnosti o použité metodě jsou uveřejněny v pracích (3, 28, 29).

Statistické vyhodnocení

Pro statistickou analýzu rozdílů mezi jednotlivými skupinami byla použita analýza rozptylu pro opakovaná měření (Repeated measures ANOVA). K porovnání hladiny prolinu byl dále aplikován test Fischer LSD pro testování post-hoc. Hladina významnosti k zamítnutí nulové hypotézy byla stanovena na p < 0,05, pokud není uvedeno jinak. Pro statistické analýzy byl použit software Statistica 10 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA).

VÝSLEDKY A DISKUZE

Prolin je jediná sekundární aminokyselina, která je utilizována pro inkorporaci do struktury proteinů. Katabolizován je vlastní metabolickou cestou, kde hlavním enzymem transformujícím prolin na 1-pyrolin-5-karboxylát (P5C) je prolin dehydrogenáza/oxidáza (PRODH/POX). Indukce aktivity PRODH/POX je závislá na rozličných stresových faktorech. Mezi ně je řazena genotoxicita (mutace v p53, receptorech aktivovaných proliferátory peroxizomů – PPAR*gama) (30) či nutriční stres (glukózová deprivace) (31). Metabolická degradace prolinu vlivem POX dává za vznik prolin-dependentním reaktivním kyslíkovým radikálům (ROS), zejména superoxidům, které modulují buněčnou apoptózu (32). Bylo také dokázáno, že transkripční faktor Myc, jehož over-exprese je sledována u mnoha typů nádorových onemocnění, může down-regulovat expresi POX/PRODH, a tím inhibovat jeho funkci – katabolýzu prolinu a tvorbu ROS, vedoucí k apoptóze. Dalším důležitým spojením mezi prolinem a kancerogenezí je potenciál některých, v nádorech silně exprimovaných miRNA (zejména miR-23b*), inhibovat aktivitu POX (33). Z výše zmíněných skutečností vyplývá, že onkologická onemocnění, ač jsou značně heterogenní, zachovávají si určité charakteristiky (over-exprese MYC či miRNA), které ovlivňují metabolickou konverzi prolinu na P5C. Alterace v metabolismu prolinu tedy může vést k jeho zvýšenému množství, detekovatelnému ve vzorcích moči, jak bylo pozorováno v naší předchozí práci (3). U pacientů směřujících k remisi onemocnění se předpokládá návrat ke správně pracujícímu metabolismu prolinu, a tím se objevuje důležitý otazník – může být pooperační prognóza onkologických pacientů založena na determinaci prolinu v moči? V naší pilotní studii byly analyzovány vzorky moči pacientů s diagnostikovaným karcinomem prostaty před a po radikální prostatektomii. Gleasonovo skóre bylo u všech pacientů stanoveno v rozsahu 5–7. Nejdříve byla sledována hladina prolinu v obou sledovaných skupinách (obr. 2A). Pro základní porovnání hladin prolinu byla provedena adjustace ostatních proměnných (v tomto případě času). Z toho důvodu byl pro obě skupiny proveden součet (M0 + M3) a ten byl zprůměrován. Z obrázku 2A je zřejmé, že pacienti v remisi mají v porovnání s pacienty s pozitivním chirurgickým okrajem cca 0,8krát nižší hladinu prolinu v moči, F (1,28) = 0,78, p = 0,39. Tento výsledek ale nemá přílišnou výpovědní hodnotu ve smyslu prognostické role prolinu, jelikož nepopisuje trend změny jeho koncentrací v čase. Z toho důvodu jsme provedli analýzu kombinovaného efektu sledovaných faktorů na hladinu prolinu (obr. 2B) F (1,28) = 1,66, p = 0,21. Z obrázku 2B je patrné, že zatímco v čase M0, tedy u pacientů v předoperačním stadiu je v koncentraci prolinu moči mezi oběma skupinami pouze nepatrný rozdíl, nicméně v čase M3 a je již rozdíl značný. Pro lepší posouzení hodnot prolinu byla popisná statistika vynesena do tabulky 1.

Z výše zmíněných skutečností lze usuzovat, že zatímco před operací (M0) není v koncentraci prolinu v moči u obou skupin výrazný rozdíl (1297,3 µmol/mmol kreatininu pro remisi, 1168,9 µmol/mmol kreatininu pozitivní chirurgické okraje), pooperační hodnoty v odběrech 3 měsíce po operaci (M3) již vykazují značný rozdíl v hodnotách prolinu (657,9 µmol/mmol kreatininu pro remisi, 1295,1 µmol/mmol kreatininu pro pozitivní chirurgické okraje). Hladina prolinu je tedy u pacientů v remisi téměř 2krát nižší v porovnání s pacienty s vysokým rizikem relapsu. Tento jev je pravděpodobně spojen s návratem k ne-alterovanému prolinovému metabolismu, který již není ovlivňován over-expresí transkripčních faktorů či miRNA. To lze usuzovat i ze stagnace prolinu u skupiny pacientů s pozitivním okrajem (relaps M0 = 1168,9 µmol/mmol kreatininu, M3 = 1295,1 µmol/mmol kreatininu), u nichž pravděpodobně zůstává metabolismus prolinu patologicky narušen. Tuto hypotézu je nicméně potřeba řádně otestovat na rozsáhlé kohortě pacientů. Z našich pilotních výsledků vyplývá, že pokles hladiny prolinu po léčebném zákroku může sloužit pro monitoring zdravotního stavu pacienta a poskytnout velmi důležité informace o průběhu zotavovací fáze. V další fázi bude důležité také sledování poklesu či stagnace koncentrací prolinu v moči v kratších časových úsecích, díky čemuž může být stanoven statisticky významný časový bod s nejvyšší výpovědní prognostickou hodnotou.

ZÁVĚR

V této studii bylo předvedeno, že i jednoduše, ne-invazivně identifikovatelné molekuly, kam řadíme aminokyseliny obsažené v moči (v našem případě prolin) souvisejí s přítomností karcinomu prostaty, a proto si zaslouží naši plnou pozornost. I přes velký posun v proteomických či metabolomických technikách, které nabízí high-throughput screening rozsáhlého množství nejrůznějších molekul, nejčastěji proteinů, je stále možné navázat na práci Sreekumara a kolegů (22), kteří identifikovali diagnosticko-prognostický potenciál aminokyseliny sarkosinu, která stále vyvolává ve vědecko-lékařské obci velké diskuze. Prolin může sloužit jako jednoduše detekovatelný pomocný biomarker ukazující na prognózu pacientů s karcinomem prostaty.

Seznam použitých zkratek

ANOVA analýza rozptylu

ANXA3 annexin A3

CAP karcinom prostaty

GSA glutamyl-gama-semialdehyd

MYC myelocytomatosis onkogen

p53 tumor supresor fosfoprotein p53

P5C 1-pyrolin-5-karboxylát

PCA3 prostate cancer antigen 3

PPAR*gama proliferátory peroxizomů

PRODH/POX prolin dehydrogenáza/oxidáza

PSA prostatický specifický antigen

ROS reaktivní kyslíkové radikály 

Práce byla zpracována za finanční podpory projektu CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068.

Střet zájmů: žádný.

ADRESA PRO KORESPONDENCI:

prof. Ing. René Kizek, Ph.D.

Ústav chemie a biochemie MENDELU

Zemědělská 1, 613 00 Brno

e-mail: kizek@sci.muni.cz