Hodnocení apoptózy buněk akutní myeloidní leukemie a B−lymfocytární chronické lymfatické leukemie po kultivaci s cytostatiky a její vztah k mnohočetné rezistenci

Súhrn

Selhání apoptózy při cytostatické léčbě leukemických onemocnění představuje jeden z mechanizmů rezistence buněk k cytostatikům. Cílem práce bylo zavedení in vitro modelu ke sledování citlivosti klonu maligních buněk akutní myeloidní leukemie (AML) k doxorubicinu a buněk B-lymfocytární chronické lymfatické leukemie (B-CLL) k chlorambucilu. Zajímal nás také vztah apoptózy po kultivaci buněk s cytostatikem k molekulám P-gp, MRP, LRP, Bcl-2 a Bax. Veškeré analýzy byly hodnoceny pomocí průtokové cytometrie. K detekci apoptotických buněk ve vzorku bylo použito 3 metod: annexinového testu, testu TUNEL (Tdt-mediated dUTP nick end labeling) a detekce kaspázy 8. Po kultivaci buněk byl statisticky významný nárůst apoptotických buněk v kultuře pozorován u buněk AML, nikoliv u buněk B-CLL. Při analýze znaků mnohočetné rezistence byly zjištěny některé tendence ke vztahu především znaků P-gp a Bcl-2 k in vitro apoptóze buněk AML a B-CLL. U AML se jednalo zejména o negativní korelaci mezi funkcí P-gp a počtem apoptotických buněk hodnocených testem TUNEL. U B-CLL se jednalo o negativní korelaci mezi expresí P-gp a výsledky annexinového testu a expresí Bcl-2 a kaspázy 8.

Klíčová slova:
akutní myeloidní leukemie – B-lymfocytární chronická lymfatická leukemie – apoptóza – mnohočetná rezistence – průtoková cytometrie

Úvod

Poslední dekáda vykazuje výjimečný nárůst v poznání mechanizmů, které souvisejí s chemoterapií, indukovanou apoptózou a mechanizmy rezistence [11]. Ta je často spojována s výskytem proteinů snižujících intracelulární koncentraci cytostatik. Patří mezi ně členové rodiny ABC (ATP-binding cassette) transportérových proteinů P-gp a MRP, které se vyskytují v buněčných membránách a protein LRP náležící do rodiny vault-proteinů [21,33,37]. Proteiny P- gp a MRP působí jako pumpy odčerpávající ven z buňky řadu chemicky i funkčně rozdílných cytostatik, LRP představuje ribonukleoproteinové tělísko zprostředkující transport cytostatik do buněčných vezikulů [1,23,19]. Laboratorně je výskyt těchto proteinů nejčastěji zjišťován pomocí monoklonálních protilátek nebo na úrovni mRNA [6,24,32]. Speciální metodikou pro testování aktivity membránových pump jsou funkční testy s fluorescenčními substráty a inhibitory pump [7,18,25,26].

Další významnou problematikou v oblasti chemorezistence nádorových buněk jsou změny v apoptotickém procesu, které znemožňují cytostatikům navodit smrt buňky apoptózou tak, jak je tomu při léčebném zásahu obvyklé [8,15,36]. Klíčovou efektorovou roli v apoptóze sehrává systém cysteinových proteáz – kaspáz, který čítá zhruba 10 proteinů interagujících s dalšími faktory apoptotického procesu a účastnících se proteolytické kaskády, na jejímž konci dochází k degradaci životně důležitých buněčných struktur jako je DNA, nitrobuněčné enzymy a strukturální proteiny [10,41]. Kaspázová kaskáda spojuje tzv. vnější a vnitřní signální dráhu apoptózy, která je spjata s řadou především mitochondriálních pochodů [3,4,11,39]. Důležitou roli v apoptotickém procesu hrají proteiny Bcl-2, Bax a další jim příbuzné proteiny [17,31,40]. Mají buď proapoptotické (Bax, Bad, Bak, Bik, Hrk, Bid, Bcl-XS) nebo protiapoptotické (Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, A1/BFL-1, Bcl-W) účinky a nadměrná exprese protiapoptotických členů této Bcl-2 rodiny proteinů často způsobuje rezistenci k navození apoptózy působením cytostatika [2,30]. Zvýšený výskyt proteinu Bcl-2 je uváděn u některých lymfomů, 85 % případů B-CLL, 40 % případů AML a také v blastické fázi chronické myeloidní leukemie [31].

Uvádí se 3 základní oblasti apoptotického procesu, k nimž se vztahuje řada buněčných dějů a potažmo metod ke stanovení apoptózy buněk. Jedná se o kondenzaci chromatinu (test TUNEL – Tdt-mediated dUTP nick end labeling), zhroucení membránového potenciálu mitochondrií a změny plazmatické membrány (annexinový test) [3,14,38]. Kultivace leukemických buněk s cytostatiky pomáhají zjišťovat účinnost cytostatika a míra odumírání leukemických buněk v kultuře se dá hodnotit různými testy, např. MTT (metylthiazoltetrazolium) testem nebo některým z testů na přítomnost apoptotických buněk [5,9,20].

Soubor nemocných a metodika

Soubor nemocných

Do studie bylo zařazeno 25 pacientů, 6 s diagnózou akutní myeloidní leukemie v záchytu onemocnění (1 muž a 5 žen) a 19 s diagnózou chronické lymfatické leukemie v různých stadiích onemocnění (14 mužů a 5 žen). Průměrný věk pacientů byl 66 let. Studie byla schválena etickou komisí a byl obdržen informovaný souhlas každého účastníka studie. Spolupráce byla vedena s hematologickými pracovišti Fakultní nemocnice Hradec Králové a hematologickými pracovišti východočeského regionu.

Vzorky

Pro analýzu byly použity vzorky periferní krve, popř. kostní dřeně. Jako protisrážlivé agens byl použit heparin. Pro kultivační pokusy byly použity výlučně vzorky periferní krve. Separované mononukleární buňky byly použity pro nepřímé značení nekonjugovanými protilátkami a pro funkční testy. Separace mononukleárních buněk byla uskutečněna v hustotním gradientu s použitím LymphoprepuTM (Nyegaard & Co. A/S).

Značení proteinů asociovaných s rezistencí k cytostatikům

Protein P-gp byl značen pomocí monoklonální protilátky UIC2 (Immunotech) konjugované s fykoerytrinem (PE) a dále pomocí monoklonální protilátky MRK16 (Kamiya Biomedical Company) a sekundární protilátky konjugované s fykoerytrinem [F(ab’)2 anti-IgG, Immunotech]. Protein Bcl-2 byl po permeabilizaci pomocí kitu firmy Immunotech IntraPrepTM Permeabilization Reagent (Immunotech) značen monoklonální protilátkou Bcl-2/100 (PharMingen). Před značením proteinů MRP, LRP a Bax byla provedena separace mononukleárních buněk z periferní krve nebo kostní dřeně, vzorek byl fixován a permeabilizován pomocí roztoků IntraPrepTM Permeabilization Reagent (Immunotech). Protein MRP byl značen monoklonální protilátkou MRPr1 (Monosan, ředění 1 : 20), protein LRP byl značen monoklonální protilátkou LRP-56 (Monosan, ředění 1 : 50) a protein Bax byl značen monoklonální protilátkou 4F11 (Immunotech, ředění 1 : 20). Následně byly vzorky inkubovány se sekundární protilátkou konjugovanou s fykoerytrinem [F(ab’)2 anti-IgG, Immunotech]. Inkubace s přímou protilátkou probíhaly 20 minut a inkubace se sekundární protilátkou 25 minut.

Kontroly a vyhodnocení

Vzorky byly analyzovány na průtokovém cytometru Epics®XL (Beckman Coulter Company). Pozitivity proteinů P-gp, MRP, LRP, Bax a Bcl-2 byly hodnoceny podle střední intenzity fluorescence MFI (mean fluorescence intensity) gatované populace. Za tímto účelem bylo striktně dodržováno stabilní nastavení parametrů cytometrické analýzy. Ve všech analýzách bylo dodrženo stejné ředění protilátek. Jako výsledek byl stanovován index MFI (MFI dané protilátky/MFI kontroly). Ke statistickému hodnocení výsledků byl použit program NCSS 6.0.21 (1996) a STATISTICA 99. Ze statistických testů byla použita analýza rozptylu s Bonferroniho porovnáním a Spearmanův korelační test Funkční testy Jako fluorescenční substrát P-gp byl testován daunorubicin (625 ng/ml, Cérubidine, Laboratoire Roger Bellon) a Rhodamin 123 (62,5 nM, Sigma). Jako inhibitor P-gp byl testován verapamil (250 nM, Sigma) a cyklosporin A (120 μg/ml, Sigma). Vyseparované buňky byly inkubovány 30 min při 37 °C s fluorescenčním substrátem, pak 2krát promyty v PBS a 1 hod inkubovány s inhibitorem P-gp při 37 °C. Paralelně byla inkubována zkumavka bez inhibitoru a zkumavka bez fluorescenčního substrátu – kontrola autofluorescence.

Kultivace buněk pacientů s diagnózou akutní myeloidní leukemie (AML) a B−lymfocytární chronické leukemie (B−CLL)

Vyseparované mononukleární buňky z periferní krve byly inkubovány v médiu RPMI 1640 s přídavkem 10 % telecího séra a gentamicinu, v 37 °C v prostředí 5 % CO2. U vzorků B-CLL byla před kultivací provedena separace T-lymfocytů pomocí magnetických kuliček amonoklonální protilátky proti CD2, 6f10.3 (Immunotech). Koncentrace buněk byla 1 × 106/ml. Vzhledem k následným analýzám byla doba kultivace s cytostatiky 22 hodin a 46 hodin. Každý vzorek byl paralelně kultivován ve třech kultivačních nádobách objemu 50 ml – kontrolní, testovací pro 22hodinovou inkubaci a testovací pro 46hodinovou inkubaci. K vzorkům AML byl přidán doxorubicin (1 μg/ml, Sigma) a k vzorkům B-CLL byl přidán chlorambucil (6 μg/ml, Sigma) jako jeden z nejčastěji užívaných cytostatik v léčbě tohoto onemocnění.

Annexinový test

Annexinový test – Annexin V FITC (Immunotech) jsme použili k rychlé detekci apoptotických buněk. Annexin V byl konjugován s fluorochromem FITC (fluorescein izothiokyanát). Buňky byly inkubovány ve tmě a v ledové lázni v přítomnosti pufru, annexinu V a propidium jodidu 10 minut. Následně byla provedena cytometrická analýza.

Značení kaspázy 8 pomocí protilátky 5F7 Buněčná suspenze o koncentraci 5 × 105/ml byla permeabilizována roztoky IntraPrepTM Permeabilization Reagent (Immunotech). Permeabilizované buňky byly značeny monoklonální protilátkou proti kaspáze 8 – 5F7 (Immunotech) 20 minut. Vzorek byl dále značen čerstvě ředěnou (1 : 20) sekundární protilátkou konjugovanou s fykoerytrinem [F(ab’)2 anti IgG, Immunotech] v případě vzorků B-CLL. V případě vzorků AML byla buněčná suspenze inkubována s čerstvě ředěnou (1 : 20) sekundární protilátkou konjugovanou s fluorescein izothiokyanátem FITC (anti-IgG, Biotest AG). Inkubace se sekundární protilátkou trvala 25 minut.

Test TUNEL (TdT−mediated dUTP nick end labelling)

Vzorek buněčné suspenze o koncentraci 5 × 105/ml byl fixován 5,5 % roztokem formaldehydu v PBS (fosfátový pufr) 30 minut při 4 °C. Fixované buňky byly proprány a k sedimentu byl přidán 1,5 ml 0,5 % roztok TWEENU 20 (Sigma) v PBS. Permeabilizace probíhala 15 min při pokojové teplotě, následně byly buňky proprány. K permeabilizovaným buňkám byla přidána reakční směs obsahující TdT pufr, FITC-značené dUTP a TdT (komponenty kitu MEBSTAIN Apoptosis kit Direct, Immunotech). U vzorku představujícího negativní kontrolu byla v reakční směsi vynechána TdT. Inkubace se směsí enzymu a dUTP byla vedena při 37 °C 60 minut.

Výsledky

1. AML

Porovnání hodnot kultivace v čase

Výpočty byly získány metodou analýzy rozptylu s opakováním měření (Bonferroniho test) a zjištěny byly následující tendence: počet apoptotických buněk hodnocených annexinovým testem po přidání cytostatika významně vzrostl za dobu kultivace 22 hodin (p = 0,0010). Další kultivace buněk až do 46 hodin od počátku kultivace již nepřinesla žádnou statisticky významnou změnu. Docházelo, avšak v podstatně menší míře k nárůstu apoptotických buněk v kultuře (graf 1). Testem na přítomnost kaspázy 8 nebyla za 22 hodin zjištěna žádná statisticky významná změna v kultuře buněk kultivovaných s cytostatikem, zato v dalším časovém intervalu (kultivace do 46 hod od podání cytostatika) je již změna statisticky významná. Jedná se o pokles procenta apoptotických buněk pozitivních v tomto znaku (p = 0,0180) (graf 2). Počet apoptotických buněk zjištěných testem TUNEL po podání cytostatika za 22 hodinové a 46 hodinové kultivace mírně zvýšil, ale tento nárůst nebyl prokázán jako statisticky významný (graf 3; tab).

Vztah výsledků kultivačních pokusů a znaků rezistence vůči cytostatikům

Korelační analýzou vztahu výsledků kultivačních pokusů a znaků mnohočetné rezistence byla nalezena negativní korelace mezi reakcí v testu TUNEL a výsledky funkčního testu membránových pump v obou časových intervalech (22 hod. – Spearmanův korelační koeficient Rs = –0,95; počet pacientů n = 6; p = 0,014; 46 hod – Rs = –0,97; n = 6; p = 0,005) (graf 4).

2. B−CLL

Porovnání hodnot kultivace v čase

Analýzou rozptylu výsledků kultivačních pokusů u každé ze 3 použitých metod nebyly zjištěny žádné významné změny v počtu živých resp. apoptotických buněk po podání cytostatika (tab). Jsou patrné velké rozdíly mezi jednotlivými pacienty a soubor se jeví co do apoptózy buněk BCLL in vitro velmi nehomogenní.

Vztah výsledků kultivačních pokusů a znaků rezistence vůči cytostatikům

Korelační analýzou mezi výsledky kultivačních pokusů a znaky mnohočetné rezistence buněk byly nalezeny některé zajímavé závislosti, a to u těchto dvojic: v intervalu 22 hodin pozitivní korelace mezi reakcí v testu na kaspázu 8 a expresí P-gp při značení protilátkou UIC2 (Rs = 0,53; n = 19; p = 0,041) (graf 5), negativní korelace mezi počtem apoptotických buněk v annexinovém testu a expresí P-gp při značení protilátkou MRK16 (Rs = –0,56; n = 19; p = 0,016) (graf 6) a v intervalu 46 hodin pozitivní korelace mezi reakcí v testu TUNEL a expresí P-gp při značení protilátkou UIC2 (Rs = 0,56; n = 19; p = 0,031) (graf 7) a negativní korelace mezi reakcí v testu na kaspázu 8 a expresí proteinu Bcl-2 (Rs = –0,58; n = 19; p = 0,024) (graf 8).

Diskuse

Pro in vitro simulaci, i když značně zjednodušenou, působení cytostatika na leukemické buňky jsme použili kultivační testy buněk AML s doxorubicinem a B-CLL s chlorambucilem. Kultivace probíhaly vždy po dobu 22 a 46 hodin paralelně s kontrolami bez cytostatika, tak jak byla realizace testu uskutečnitelná v podmínkách běžného chodu klinické laboratoře. Cílem práce bylo ustavit model pro testování in vitro rezistence leukemických buněk k cytostatikům, stanovit nejvhodnější podmínky a testy vyhodnocující reakci buněk v kultuře. Podle Filipitse et al je AML považována za modelové onemocnění pro studium rezistence k cytostatikům [12].

U AML docházelo u většiny vzorků ke značnému nárůstu apoptotických buněk po 22 hodinách kultivace s doxorubicinem, měřeno annexinovým testem. Oba další provedené testy na kaspázu 8 a test TUNEL neprokázaly nárůst apoptotických buněk v kultuře jako statisticky významný. Test exprese káspázy 8 se jeví pro hodnocení apoptózy po in vitro kultivaci buněk s cytostatiky jako ne zcela vhodný. Účast kaspázy 8 v apoptóze blastů AML indukované doxorubicinem je nejspíš zanedbatelná. Bylo publikováno, že spontánní apoptóza buněk AML vykazuje signifikantní korelace s odpovědí na indukční chemoterapii [40]. Některé další studie však ukazují, že in vitro testy s cytostatiky mají svá úskalí. Při studiu reakcí myeloidních buněk v kultuře bylo zjištěno, že nedostatek cytokinů, které zabraňují apoptóze, může přispívat in vitro k citlivosti k daunorubicinu, a tak poskytovat falešné výsledky [9].

U buněk B-CLL naopak nebyl statisticky významný nárůst apoptotických buněk po kultivaci s chlorambucilem v žádném časovém intervalu. Mezi vzorky jednotlivých pacientů byl poměrně velký rozdíl týkající se apoptotické reakce B-CLL buněk in vitro. Tato skutečnost pravděpodobně souvisela s odlišnými stadii onemocnění, ale i předešlou léčbou u jednotlivých pacientů. Na rozdíl od pacientů s AML totiž nebyly vzorky pacientů s B-CLL vyšetřovány pouze při záchytu onemocnění. Buňky B-CLL, které v organizmu jen těžko podléhají apoptóze, v kultuře spontánně hynuly docela dobře, avšak tato tendence nebyla umocněna přidáním chlorambucilu do kultury. Toto zjištění se shoduje s výsledky jiných studií. Vermes et al uvádějí, že ačkoliv jsou in vitro kultivované B-CLL lymfocyty velice náchylné ke spontánní apoptóze, více než normální B-lymfocyty [38], in vivo je tomu naopak [27]. To odpovídá též patogenezi tohoto doposud nevyléčitelného onemocnění, které je charakteristické zablokováním buněk v G0/G1 fázi buněčného cyklu, inhibicí apoptózy a následujícím hromaděním dlouhožijících nádorových buněk [20]. Co se týče apoptózy B-CLL buněk, bylo publikováno, že je inhibována imunokomplexy za účasti okolních leukocytů [13] a že in vitro testy ukázaly proapoptotický efekt anti-sense oligonukleotidů proti Bcl-2 mRNA [28] a proapoptotický efekt IL-4, kterého by se dalo s úspěchem využít v imunoterapii B-CLL [22].

Výsledky kultivačních testů, tedy míru apoptózy ve vzorcích po kultivaci buněk s cytostatiky jsme hodnotili také ve vztahu ke znakům mnohočetní rezistence. Korelační analýzou u vzorků AML byly zjištěny silné negativní korelace mezi výsledky testu TUNEL a výsledky funkčního testu membránových pump s použitím doxorubicinu a verapamilu. Silná negativní korelace výsledků testu TUNEL a výsledků funkčního testu odpovídá předpokladu, že čím rezistentnější buňky, tím méně podílu apoptotických buněk v testu TUNEL a zároveň narůstající index MFI u funkčních testů.

Analýza vzorků B-CLL ukázala také závislosti mezi některými znaky mnohočetné rezistence a výsledky kultivačních pokusů. Jelikož efekt chlorambucilu na in vitro apoptózu buněk B-CLL nebyl prokázán, můžeme zde hodnotit pouze vliv in vitro kultivace B-CLL buněk na spontánní apoptózu. U proteinu Bcl-2 byla zjištěna negativní korelace s výsledky testu na kaspázu 8 po 46hodinové kultivaci buněk. Toto naše zjištění podporuje skutečnost, že buňky pozitivní v Bcl-2 mají menší schopnost podlehnout apoptóze. Význam hladiny proteinů Bcl-2 a Bax při procesu apoptózy je takový, že by bylo zajímavé měřit hladinu těchto proteinů v leukemických buňkách před kultivací a po ní, abychom si mohli udělat představu, jakou změnu jsou podmínky kultivace v tomto směru schopny navodit. Po 48hodinové kultivaci buněk B-CLL s chlorambucilem dokázali Pepper et al, že zvýšená exprese Bax byla nezbytná pro indukci apoptózy a stejná práce ukázala, že rezistence ke chlorambucilu je zprostředkována neúspěšnou indukcí Bax a selekcí subklonů s vysokou expresí Bcl-2 [27]. U proteinu P-gp byla nalezena negativní korelace s výsledky annexinového testu při detekci P-gp protilátkou MRK16. Tato negativní korelace odpovídá představě, že buňky exprimující ve větší míře P-gp méně reagují na kultivační podmínky apoptózou. Dále byly u proteinu P-gp nalezeny pozitivní korelace s expresí kaspázy 8 a výsledky testu TUNEL při detekci P-gp protilátkou UIC2. Tyto pozitivní korelace jsou v rozporu s předchozí a nedokážeme je vysvětlit. Celá situace je však natolik složitá, že výsledky lze považovat pouze za orientační také vzhledem k malému souboru vyšetřených pacientů. Je známo, že chlorambucil není substrátem P-gp, a proto by neměla být exprese P-gp a reakce buněk B-CLL na chlorambucil v přímé souvislosti. Přesto jsme měli v úmyslu reakci B-CLL buněk na chlorambucil vzhledem k expresi P-gp sledovat, a to z důvodu dalších možných vlivů P-gp na apoptózu buněk kromě odčerpávání cytostatik. Práce Higashiho et al ukázala, že P-gp vykazuje kromě effluxu ještě jiné nepopsané funkce, které modulují citlivost AML blastů k chemoterapii [16,26]. Bylo také zjištěno, že leukemické buňky pozitivní v P-gp mají větší obsah mtDNA, což vede ke změnám energetického metabolizmu, a může to ovlivnit citlivost buněk k apoptóze [19]. Dále bylo zjištěno, že P-gp inhibuje apoptózu zprostředkovanou kaspázami [34] a inhibuje apoptózu indukovanou ozářením buněk [35].

Závěrem lze poznamenat, že se podařilo zavést vhodné modelové podmínky pro testování citlivosti buněk AML k doxorubicinu, ne však buněk B-CLL k chlorambucilu. Je však otázkou, zda spontánní apoptóza in vitro sama o sobě neskýtá cenné informace, které by vypovídaly o citlivosti konkrétního nádorového klonu k apoptóze. Z testů použitých k detekci apoptotických buněk ve vzorku bychom jednoznačně doporučili annexinový test pro svou jednoduchost a bezkonkurenční rychlost zpracování vzorku. Co se týče korelací apoptotické reakce buněk a exprese znaků spojených s mnohočetnou rezistencí, je nutno je považovat pouze za orientační a považovat je za jakýsi impulz k dalším výzkumům. V návaznosti na tuto práci by bylo vhodné zejména rozšířit soubor pacientů, pokusit se paralelně testovat více koncentrací cytostatika, popř. další cytostatika používaná při léčbě těchto onemocnění.

Výhledově se v této oblasti otevírají nové možnosti dané zejména novými poznatky o procesech apoptózy, ale i mnohočetné rezistence jako takové. Molekulární objevy v oblasti mnohočetné rezistence odhalily mnoho genů pro transportní proteiny, byly vyvinuty nové metodiky, objeveny nové modulátory [29]. Společně s novými poznatky přibývá též různých laboratorních možností, fluorescenčních substrátů membránových pump, monoklonálních protilátek dostupných pro klinické laboratoře i technických možností daných přístrojovým vybavením.

Práce vznikla za podpory grantu IGA MZ ČR č projektu: M/20-3/98.

Poděkování

Autoři děkují Janě Hrdinové za pomoc při úpravách textu.

Mgr. Karolína Jankovičová

www.fnhk.cz

e-mail: kajako@email.cz

Doručeno do redakce: 28. 1. 2004

Přijato po recenzi: 26. 4. 2004