Možnosti ochrany reprodukčních funkcí u žen podstupujících léčbu cytotoxickými léky

Súhrn

Terapie závažných orgánových postižení u systémových chorob pojiva a systémových vaskulitid vyžaduje často použití cytostatik. K závažným nežádoucím účinkům těchto léků patří i nevratné poškození zárodečné tkáně gonád. Na rozdíl od jiných rychle proliferujících tkání organizmu bývá poškození ovarií většinou nevratné, a to v důsledku předem determinovaného počtu ovariálních folikulů při narození. Destrukce folikulů vede k primární ovariální nedostatečnosti a k rozvoji následné neplodnosti s příznaky klimakterického syndromu. Otázka ochrany ovariálních funkcí není dosud zcela vyřešena. V následujícím textu je podán přehled současných možností ochrany reprodukčních funkcí u žen podstupující léčbu cytotoxickými léky zahrnující moderní metody asistované reprodukce a nové možnosti farmakologické ochrany ovarií využívající analoga gonadoliberinu.

Klíčová slova:
asistovaná reprodukce - GnRH analoga - neplodnost - systémové onemocnění pojiva

Úvod

Některá onemocnění, se kterými se revmatolog setkává ve své praxi, zejména systémová onemocnění pojiva nebo systémové vaskulitidy a současně terapie těchto onemocnění, jsou významnými faktory, které mohou způsobit úplnou ztrátu plodnosti. V terapii těchto onemocnění jsou často používána cytostatika [1]. K závažným nežádoucím účinkům zejména alkylačních cytostatik patří i nevratné poškození zárodečné tkáně gonád. Na rozdíl od jiných rychle proliferujících tkání organizmu bývá poškození ovarií většinou nevratné, a to v důsledku předem determinovaného počtu ovariálních folikulů při narození. Destrukce folikulů vede k primární ovariální nedostatečnosti a k rozvoji následné neplodnosti s příznaky klimakterického syndromu. Otázka ochrany reprodukčních funkcí u žen není dosud zcela vyřešena.

Předčasné ovariální selhání (premature ova­rian failure - POF) je častým dlouhodobým následkem cytostatické léčby. Klinicky je definováno jako vymizení menzes po dobu delší než 6 měsíců u ženy mladší 40 let s elevací sérových hladin gonadotropinů - folikulostimulačního hormonu (FSH) a luteinizačního hormonu (LH) - nad 20 IU/l. Z důvodu předem determinovaného počtu ova­riálních folikulů při narození bývá po­škození ovarií většinou nevratné. Destrukce foliku1ů vede k primární ovariální insufi­cienci a následné sterilitě s příznaky klima­kterického syndromu [2].

Mechanizmus nepříznivého účinku alkylačních cytostatik na ova­riální tkáň není dosud zcela objasněn. Předpokládá se zejména toxické působení na buňky membrana granulosa nebo oocyt, vedoucí ke konečné atrézii folikulu. Cyklofosfamid zasahující do buněčného cyklu převážně rychle se množících buněk působí na buňky membrana granulosa, jejichž dělení probíhá pod kontrolou hypofyzárních gona­dotropinů. Nepřímé důkazy naznačují, že právě gonadotropní stimulace je předpokla­dem pro negativní působení cytostatické léčby na ovarium. Její podávání vede k rychlému zániku již zralých folikulů, ná­slednému nástupu dozrávání ještě nezralých folikulů a urychlení deplece počtu primor­diálních folikulů [3].

Riziko rozvoje POF u žen podstupujících léčbu cytotoxickými léky závisí zejména na věku pacientky, typu použitého gonadotoxického agens, použitém léčebném režimu a dosažené kumulativní dávce. Gonadotoxický účinek cytostatik je rozdílný. Mezi látky s nejsilnějším gonadotoxickým účinkem patří alkylační cytostatika (cyklofosfamid, chlorambucil, busulfan). Uvádí se, že kumulativní dávka 20 g cyklofosfamidu je asociována s rozvojem POF až u 50 % 20letých pacientek s autoimunitním onemocněním podstupujících cytotoxickou léčbu [4-6]. Naopak metotrexát vykazuje minimální nežádoucí vliv na folikulární aparát ovarií.

Klinicky se poškození ovarií u ženy v reprodukčním věku projeví jako sekundární amenorea nebo oligomenorea, která se po skončení léčby může spontánně upravit. U některých žen zvláště po 30. roku života dochází však k trvalé amenorey, k rozvoji POF s obrazem hypergonadotropního hypogonadizmu [7]. Moderní metody asistované reprodukce (AR) mohou dnes nabídnout pacientkám se závažnými systémovými chorobami pojiva šanci na vlastní rodinu. V posledních letech jsou usilovně vyví­jeny i postupy k prevenci neplodnosti již před zahájením a v průběhu cytostatické léčby. Přehled jednotlivých metod ochrany reprodukčních funkcí u žen podstupujících cytotoxickou léčbu, jejich výhody a nevýhody, podává následující tab. 1.

Kryokonzervace gamet

Rutinně používanou metodou, která vede k záchraně fertility u žen, je kryokonzer­vace oocytů před zahájením cytostatické léčby. Jedná se o metodu intenzivně rozvíjenou zejména v posledním desetiletí, nicméně je­jímu rutinní rozšíření do běžné praxe zatím brání poměrně malá úspěšnost při dosažení fertility z kryokonzervovaných oocytů [8]. Přestože významných úspěchů v této oblasti již bylo dosaženo, je třeba dořešit ještě mnoho otázek při standardizaci procesu kryokonzervace i rozmrazování lidských oocytů [9]. Intenzivně jsou zkoumány technické postupy při kryokonzervaci a rozmrazování, které by byly schopny předejít poškození obalu oocytu (zona pelucida hardening) a sítě mikrotubulů (meiotic spindle), která je nezbytná k dokončení meiózy maturovaného oocytu [10]. Významným limitujícím faktorem tohoto postupu je nutnost podstoupit hormonální ovariální stimulaci s následným odběrem oocytů, což posouvá možnost zahájení cytostatické terapie o 3-4 týdny. Hormonální stimulace může navíc zhoršit průběh estrogen-dependentního onemocnění, jakým je kupříkladu systémový lupus erythematodes. Současnou podmínkou pro použití této metodiky je i relativně dobrý zdravotní stav pacientky.

Kryokonzervace embryí

Další klinicky běžně používaný postup, který může vést k zajištění fertility ženy před zahájením cytostatické léčby, je provedení IVF-cyklu s oplozením a následnou kryokonzervací embryí po jejich kultivaci v podmínkách in vitro [11]. Tato metoda je technicky již dobře zvládnuta a zavedena do běžné praxe, nic­méně její využití je limitováno několika zá­važnými podmínkami. Významně limitujícím požadavkem, podobně jako při předchozím postupu ochrany reprodukčních funkcí ženy, je po­žadavek relativně dobrého zdravotní stavu pacientky, který dovolí posu­nutí zahájení cytostatické léčby o asi 3-4 týdny s nutností podstoupit hormonální ovariální stimulaci s ná­sledným odběrem oocytů. I v tomto případě je nutné počítat s možným negativním vlivem hormonální stimulace na aktivitu systémového onemocnění pojiva. Dalším převážně legislativním a etickým omezením je existence partnera pacientky a jeho písemný souhlas s provedením IVF-cyklu a poskytnutí jeho spermií k oplození získaných oocytů. Proto tento postup není vhodný u velmi mladých pacientek, které nemají stálého partnera.

Kryokonzervace ovariální tkáně

Metodou volby u pacientek, které nesplňují některé z výše uvedených podmínek, je možnost kryokonzervace ovariální tkáně před zahájením cytostatické léčby. Výhodou této metody je její rychlá proveditelnost bez nutnosti odložit zahájení léčby systémového onemocnění pojiva. Další nespornou výhodou této metody je rovněž fakt, že pacientka nemusí podstupovat hormonální ovariální stimulaci, která může negativně ovlivnit průběh systémového onemocnění. Pro pacienty s nově diagnostikovaným systémovým onemocněním pojiva se závažným orgánovým postižením, kteří vyžadují včasné zahájení léčby cytotoxickými léky, je kryokonzervace ovariální tkáně vhodnou alternativou prevence ovariálního poškození či selhání [12,13]. Cílem procesu je nabídnout pacientce po úspěšném ukončení léčby základního onemocnění, bez známek jeho aktivity či recidivy, možnost reimplantace takto zachované ovariální tkáně do malé pánve či na jiné místo lidského těla (heterotopická autotransplantace).

Technika odběru a kryokonzervace ovariální tkáně je již poměrně dobře propracovaná. Základní limitací me­tody je ovšem proces in vitro maturace nezra­lých oocytů v takto získané ovariální tkáni [14]. Pokroky v kryobiologii ovariální tkáně, vyzkoušené na laboratorních zvířatech, od­startovaly mnoho projektů bank ovariální tkáně, které mohou urychlit rozvoj této pro­zatím experimentální metody v běžné kli­nické praxi [15]. V pilotní studii Hovatty a Newtona, publikované v roce 1996, autoři vyzkoušeli kryokonzervační postupy s využitím různých kryoprotektantů a potvrdili, že ovariální tkáň je odolná k procesu hlubokého zamražení [16-18]. Později Newton a zejména Gook prokázali, že právě primordiální folikuly jsou nejodolnější vůči celému procesu zamražení a rozmražení a následně získali maturované oocyty, které pocházely ze zamražené a následně rozmražené ovariální tkáně implantované imunodeficitním myším [19,20].

Doposud byla ovariální tkáň úspěšně zamražena a následně transplantována kromě myší také u ovce, králíka a kosmana [21-23]. Tyto studie ukázaly jasnou korelaci mezi poškozením tkáně a délkou trvání ischemie při odběru a zpracování ovariální tkáně. Pokles počtu primordiálních folikulů v důsledku hypoxie je odhadován na 50-65 %. Podle některých studií jsou buňky ovariální tkáně schopny tolerovat ischemii minimálně po dobu 3 hod. V současnosti jsou zkoumány možnosti využití látek, zejména antioxidantů (kyselina askorbová) či růstových faktorů (VEGF), které by dokázaly snížit procento buněk poškozených kryokonzervací [24].

Tyto úspěchy vedly k vypracování kryokonzervačních protokolů v humánní medicíně. V současné době jsou využívaný 2 základní typy kryokonzervačních protokolů podle typu použitého kryoprotektantu. K hodnocení úspěšnosti kryokonzervačních postupů jsou využívány metody histologického vyšetření tkáně, zejména procento přežívání primordiálních folikulů a procento fibrotizace ve štěpu po transplantaci.

V roce 2004 byl popsán první případ, kdy došlo po ortotopické autotransplantaci zamraženého vzorku ovariální tkáně k vývoji euploidního embrya a v zápětí k porodu dítěte u pacientky léčené pro lymfom [25]. U pacientky byla však pozorována sporadická ovulace, a proto je možné, že gravidita vznikla z oocytu ovaria ponechaného in situ. V roce 2005 byla publikována práce izraelských autorů, ve které bylo dosaženo gravidity a porodu zdravého dítěte po ortotopické autotransplantaci ovariální tkáně a následném IVF-cyklu u 28leté ženy 3 roky po ukončení chemoterapie pro nonhodgkinský lymfom [26].

Odběr ovariální tkáně se provádí laparoskopicky v krátkodobé celkové anestezii. Více než 90 % buněk ovariálního kortexu tvoří primordiální folikuly obklopené vrstvou granulózových buněk a vazivové tkáně. Většina folikulů je umístěna v oblasti do 1 mm pod kortikálním epitelem ovaria. Z důvodu zachování růstového potenciálu folikulů je nutné odebrat několik plátků ovariálního kortexu v tloušťce 1-3 mm a zachovat tak integritu těchto doprovodných struktur ovariální tkáně. Nejoptimálnější z hlediska dalšího zpracování se jeví odběr 2-3 plátků tkáně z obou ovarií, které jsou před kryokonzervací zpracovány na menší kousky o velikosti 10 × 3 × 2 mm.

Techniky autotransplantace ovariální tkáně u člověka lze rozdělit na ortotopické a heterotopické. Ortotopická technika znamená uložení štěpu do malé pánve do peritoneální duplikatury, ovarické fosy či přímo do hormonálně inaktivního ovaria, případně mnohočetné injekce suspenze malých kousků ovariální tkáně do ovariálního kortexu [26,27]. Některými autory bylo prokázáno, že peritoneální tkáň se lépe hodí k transplantaci než jiné oblasti (sval, podkoží), protože zde došlo k menší ztrátě počtu primordiálních folikulů [28]. Nevýhodou ortotopické transplantace je větší invazivnost převážně laparoskopického, někdy i laparotomického výkonu. Méně invazivní metodou bez nutnosti celkové anestezie je heterotopická autotransplantace ovariální tkáně do podkoží předloktí nebo podbřišku. V humánní medicíně bylo dosaženo vývoje diploidního embrya v autotransplantátu, zatím bez dosažení gravidity, po embryotransferu [25].

Klinickým důkazem funkce autotransplantátu ovariální tkáně je obnovení menstruačního cyklu u pacientky s iatrogenní amenoreou po cytostatické terapii. Podle doposud publikovaných prací došlo k obnovení menstruace v intervalu 6-12 měsíců po transplantaci. Nejjednodušší možností sledování funkce ovariálního štěpu je monitorování poklesu hladin ovariálních steroidů a gonadotropinů, případně sledování nových markerů a ukazatelů ovariální funkce a rezervy - inhibinů (INH A, INH B) a antimülleriánského hormonu (AMH). Jejich hladiny začnou v krvi stoupat o několik týdnů dříve, než je v krvi detekován signifikantní pokles hladiny gonadotropinů.

Odborná debata o výhodách a potencionálních rizicích této metody vedla k vytvoření expertní pracovní skupiny a doporučeného postupu Americké společnosti pro reprodukční medicínu (American Society for Reproductive Medicine - ASRM) publikovaného v roce 2004 [29]. V těchto doporučeních je mimo jiné konstatováno, že se doposud jedná o experimentální metodu, má být vyžadován písemný souhlas pacienta a souhlas etické komise a je nezbytná mezioborová spolupráce. V Evropě vstoupila v dubnu roku 2004 v platnost směrnice Evropské unie č. 2004/23/EC o darování, zprostředkování, testování, zpracování, ochraně, skladování a šíření lidských tkání a buněk. Tato směrnice stanovuje standardy a podmínky pro pracoviště, které se touto problematikou zabývají.

Farmakologická ochrana GnRH analogy

Všechny výše popsané metody vycházejí s rozvinutých metod AR a využívají zkuše­ností s kryokonzervací lidských gamet, embryí, či ovariální tkáně. Zásadní otázkou však zůstává možnost prevence ovariálního poškození agresivní cytotoxickou léčbou.

Opakovaně bylo pozorováno, že dívky lé­čené pro nádorové onemocnění v prepuber­tálním věku nevykazují ve srovnání s do­spělými ženami, jejichž zárodečné buňky podléhají cyklické hormonální stimulaci a proliferaci, tak častá poškození ovariál­ních funkcí [30].

Základní vlastností oocytů je jejich rozsáhlý germinační potenciál a dělící schopnosti, které je předurčují k tomu, aby byly jednou z prv­ních obětí agresivní cytotoxické terapie. Na druhé straně proces folikulogeneze a maturace oocytu je vysoce hormonálně závislý a je ovlivňován řadou endokrinních i pa­rakrinních signálů. Mezi hormony, které hrají významnou roli v těchto procesech, patří FSH a LH, produkované v adenohypofýze, pod regulační kontrolou gonadoliberinu (GnRH). Působe­ním výše uvedených hormonů je možné oocyty zastavit ve vývoji na úrovni primordiálních folikulů, jako je tomu v pre­pubertálním období vývoje ženy. Takto in­hibované oocyty pak vykazuji výrazně niž­ší senzitivitu na cytotoxickou léčbu, jak bylo již potvrzeno v pilotních studiích izraelských autorů Blumenfelda et al [31]. Hormonální suprese ovarií tedy vychází z hypotézy, že ovarium je v klidovém stadiu méně citlivé na cytotoxické léky. Tato hypotéza byla již ověřena experimentálně a také několika pilotními studiemi na lidských ovariích [32]. K útlumu činnosti vaječníků dochází až po několika dnech. Přesný mechanizmus této ochrany však není znám, protože primor­diální folikuly, které tvoří rozhodující část folikulární rezervy, nejsou pod vlivem gona­dotropinů [31]. Jedním z předpokládaných mechanizmů protektivního působení GnRH analogů je jejich inhibiční vliv na produkci FSH. Alkylační cytostatika vedou k nárůstu destrukce a apoptózy dozrávajících a diferencujících se folikulů, což je spojeno se snížením produkce pohlavních hormonů a některých růstových faktorů ze superrodiny TGFβ peptidů, např. AMH, inhibinu, aktivinu, produkovaných dozrávajícími folikuly. Snížená plazmatická koncentrace těchto látek pak vede zpětnovazebně s nárůstu produkce FSH, jehož vyšší hladina stimuluje klidové folikuly k diferenciaci a dozrávání. Ty se následně stávají náchylnějšími k toxickému působení alkylačních cytostatik. Další z možných mechanizmů protektivního účinku GnRH analogů může být jejich inhibiční vliv na uteroovariální perfuzi a snížení kumulativní expozice ovarií cytotoxickým lékům. Další z mechanizmů účinku těchto léků připouští existenci GnRH receptorů v lidských pohlavních orgánech, jejichž stimulace může vést k inhibici apoptózy dozrávajících folikulů.

Léky, schopné zastavit cyklickou sekreci FSH a LH, jsou analoga GnRH v dlouhodobém kontinuál­ním podání. Běžně se používají v protokolech ovariální stimulace při IVF [33]. Důkaz o protektivním účinku současného podávání analogů GnRH při cytotoxické terapii z důvodu maligních, ale i systémových autoimunitních chorob, byl již opakovaně podán a v současné době probíhá řada prospektivních randomizovaných studií, které si kladou za cíl potvrdit efektivitu tohoto postupu [34]. Výsledky ukazuji efektivitu této metody zejména u mladších pacientek. Určitou nevýhodou použití GnRH analogů je pře­chodné zvýšení sekrece gonadotropinů po dobu 7-10 dnů od podání, tzv. flare-up fenomén, při němž je naopak senzitivita ovariální tkáně na chemoterapii zvýšena. Metodou volby je v tomto případě použití GnRH antagonistů, jejichž apli­kace v kombinaci s GnRH analogem, zajistí ovariální supresi do 4-5 dnů [35]. V praxi tedy tento postup zahrnuje aplikaci GnRH analoga (Diphereline 3 mg) v podobě intramuskulární injekce a následnou aplikaci GnRH antagonisty (Cetrotide 3 mg) opět v podobě intramuskulární injekce 6 hod po aplikaci GnRH analoga. Tento postup zajistí ovariální inhibici a možnost zahájení agresivní cytotoxické léčby po 4-5 dnech. K udržení ovariální suprese je nezbytné opakované podání GnRH analoga (Diphereline 3 mg) po dobu terapie základního onemocnění v 1měsíčních intervalech. Po ukončení této léčby dochází k obnovení ovariálních funkcí a menstruace obvykle během 5 měsíců.

Na našem revmatologickém pracovišti je tento postup realizován ve spolupráci s Centrem asistované reprodukce CAR 01 Gynekologicko-porodnické kliniky LF MU a FN Brno, ve kterém probíhá výzkumný projekt ochrany reprodukčních funkcí u žen podstupujících chemoterapii pro hematologickou malignitu (OvarOnko), který si klade za primární cíl ověření protektivního podávání GnRH ana­log za účelem ochrany ovariální tkáně v průběhu tří různých režimů chemoterapie u pacientek s Hodgkinovým lymfomem ve fertilním věku [35-38].

Komentář

Terapie závažných systémových chorob pojiva a systémových vaskulitid vyžaduje často použití cytotoxických léků. K nežádoucím účinkům těchto léků patří i nevratné poškození zárodečné tkáně gonád způsobující trvalou neplodnost. Na rozdíl od jiných rychle proliferujících tkání organizmu bývá poškození ovarií většinou nevratné, a to v důsledku předem determinovaného počtu ovariálních folikulů při narození. Destrukce folikulů vede k primární ovariální nedostatečnosti a k rozvoji následné neplodnosti s příznaky klimakterického syndromu. Zachování funkce ovarií závisí přede­vším na gonadotoxickém účinku použité cytotoxické léčby a ovariální rezervě pri­mordiálních folikulů ve vaječnících, která klesá s věkem.

Moderní metody AR mohou dnes nabídnout pacientkám se závažnými systémovými chorobami pojiva šanci na vlastní rodinu. Metody kryokonzervace oocytů a embryí před zahájením cytotoxické léčby základního onemocnění jsou však zatíženy řadou problémů. Oocyt je vzhledem ke své stavbě při kryo­konzervaci velmi zranitelný. Po rozmražení dochází k oplození a dosažení těhotenství jen výjimečně [39]. Proces zmražení a roz­mražení velmi dobře snáší jen kvalitní emb­rya. Neopomenutelnou limitací těchto postupů je nutnost podstoupit hormonální ovariální stimulaci s následným odběrem oocytů, což posouvá možnost zahájení cytostatické léčby o 3-4 týdny a může negativně ovlivnit průběh systémového autoimunitního onemocnění. Limitující podmínkou je tedy i relativně dobrý zdravotní stav pacientky.

V posledních letech je věnována maximální pozornost výzkumu možnosti kryokon­zervace ovariální tkáně. Tato metoda odstraňuje některé limitující faktory metod kryokonzervace oocytů a embryí, zejména nutnost oddálení zahájení cytotoxické terapie. Vlastní protokol kryokonzervace je již dobře propracován, ale využití zamraženého materiálu a proces in vitro maturace je stále ve stádiu expe­rimentu. Vyře­šení problémů in vitro maturace oocytů by znamenalo zásadní přínos pro zachování plodnosti u žen ve fertilním věku podstupujících léčbu cytotoxickými léky.

Zásadní otázkou zůstává možnost prevence trvalého ovariálního poškození agresivní cytostatickou léčbou. Slibnou metodou se ukazuje být hormonální ovlivnění aktivity ovarií s využitím GnRH analogů. Jejich působe­ním je možné oocyty zastavit ve vývoji na úrovni primordiálních folikulů. Takto in­hibované oocyty pak vykazuji výrazně niž­ší senzitivitu na cytotoxickou léčbu.

Povinností revmatologů, ale i jiných odborníku setkávajících se s touto problematikou je zajistit léčeným pacientkám se systémovými chorobami pojiva dostatečnou kvalitu života, z daného pohledu zejména nabídnout šanci na založení vlastní rodiny.

Podpořeno grantovým projektem IGA MZ ČR - NR/8469-3.

MUDr. Petr Němec, Ph.D.

www.fnusa.cz

e-mail: petr.nemec@fnusa.cz

Doručeno do redakce: 5. 12. 2007

Přijato po recenzi: 28. 12. 2007