Funkční význam hERG: od fyziologické role po cíl protinádorové terapie

Súhrn

Lidský ether-à-go-go příbuzný gen (hERG; oficiálně označovaný jako KCNH2), kóduje strukturu proteinu tvořícího α podjednotku napěťově řízeného iontového kanálu, který vede rychlou složku opožděného K⁺ proudu z buňky (I_Kr). Tento proud hraje významnou úlohu zejména v repolarizaci srdečních buněk. Mutace v genu hERG vedou k projevům dědičných syndromů, které jsou charakteristické prodloužením nebo zkrácením intervalu QT na elektro­kardiogramu a vznikem život ohrožujících arytmií. Tato práce představuje kanály hERG i jako součást regulačních mechanizmů kontraktilní činnosti hladkého svalstva, aktivity neuronů, uvolňování některých hormonů i proliferace a apoptózy nádorových buněk. Zmíněná jsou rovněž onemocnění plynoucí z poruchy funkce těchto kanálů a také možnosti využití genu/kanálu hERG jakožto diagnostického markeru a možného terapeutického cíle u různých onemocnění, zejména u nádorových.

Klíčová slova:
epilepsie – hERG – KCNH2 – kontrakce svalu – K⁺ kanál – LQTS – membránové napětí – nádorové onemocnění – proliferace – schizofrenie

Úvod

Objevení lidského ether-à-go-go příbuzného genu (hERG) mělo velký dopad zejména v oblasti kardiovaskulárního výzkumu. Gen hERG totiž kóduje strukturu α podjednotky napěťově řízeného iontového kanálu vedoucího významný repolarizační K⁺ proud srdečních buněk. Narušení funkce tohoto kanálu vede ke změnám trvání repolarizace akčního napětí, a tím ke změnám délky intervalu QT na elektrokardiogramu (EKG), případně až k život ohrožujícím arytmiím. V posledních letech se pozornost vědců zaměřuje na úlohu genu hERG a jím kódovaného proteinu i v jiných tkáních, zejména ve tkáni nervové, endokrinní, v hladkém svalstvu a ve tkáních nádorových. Tato práce podává přehled nejnovějších poznatků v této oblasti a rovněž zmiňuje potenciální možnosti využití genu hERG a jeho produktu v diagnostice a terapii.

Charakteristika genu hERG

Gen hERG je oficiálně nazýván jako KCNH2; označení hERG je však používáno mnohem častěji a bude proto užíváno i v této práci. Gen hERG se nachází v oblasti 36.1 dlouhého raménka 7. chromozomu a skládá se z 33,3 kbp; je tvořen 19 exony (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3757). Poprvé byl tento gen nalezen v hipokampu, a to porovnáním DNA z knihovny komplementárních DNA fragmentů s myším homologním genem ether-à-go-go (EAG).

Stavba a funkce proteinu kódovaného genem hERG

Jak již bylo zmíněno, gen hERG kóduje strukturu α podjednotky tvořící napěťově řízený K⁺ kanál oficiálně nazývaný Kv11.1, častěji však hERG [1,2]. Existence několika startů transkripce genu umožňuje vznik 5 různých izoforem proteinu; konkrétně hERG1a, hERG1b, hERG1c, hERG1a_USO a hERG1b_USO. Zmíněné izoformy se navzájem liší počtem a uspořádáním aminokyselin [3] a rovněž některými vlastnostmi vrátkování kanálu [4]. V nehumánních tkáních se tento gen označuje jen jako ether-à-go-go příbuzný gen (ERG) [5].

Produkt genu hERG se ve formě podjednotek seskupuje do tetrameru. Každá podjednotka obsahuje 6 α-helikálních transmembránových segmentů S1 až S6 (obr. 1A). Mezi segmenty S5 a S6 se nachází selektivní pór pro K⁺. Segment S4 představuje napěťový senzor obsahující aminokyseliny s kladným nábojem. Transmembránové segmenty jsou v cytosolu lemované amino- (N-) a karboxylovými (C-) terminálními regiony [6]. N-konec některých izoforem obsahuje Per-Arnt-Sim (PAS) doménu, která má regulační funkci [7]. Na C-konci se nachází cyklická doména vážící nukleotidy (cNBD) [8]. Výsledný tetramer se začlení do plazmatické membrány buňky a tvoří kanál hERG (obr. 1B).

Iontové kanály se obecně vyskytují v 3 možných stavech: jako zavřené, otevřené a inaktivované [9]. Přechod mezi těmito stavy je u napěťově řízených kanálů, mezi které řadíme i kanál hERG, závislý na membránovém napětí (V_m). Jak na příkladu akčního napětí buňky pracovního myokardu ukazuje obr. 1C, pohyb aktivačních a inaktivačních vrátek hERG kanálu vykazuje při změnách V_m významně rozdílnou kinetiku – aktivační vrátka se pohybují velmi pomalu, zatímco inaktivační vrátka rychle [2,10]. Díky tomu dochází během depolarizace V_m k rychlé inaktivaci kanálu a proud tekoucí hERG kanály, tzv. rychlá složka opožděného K⁺ proudu z buňky (I_Kr), je minimální. Při nastupující repolarizaci dojde naopak k rychlému zotavení hERG kanálů z inaktivace za současného velmi pomalého zavírání aktivačních vrátek (tzv. deaktivace). V důsledku toho teče během probíhající repolarizace významný I_Kr.

Fyziologický význam kanálů hERG v různých tkáních

Kanály hERG jsou za fyziologických podmínek exprimovány v mnoha různých tkáních, zejména ve tkáních excitabilních (srdeční, nervové a hladkém svalstvu) a rovněž v některých endokrinních žlázách. Exprese hERG kanálů se zde podílí na regulaci V_m, což je podstatné pro funkci těchto tkání [6,11–13]. Fyziologická role hERG kanálů ve tkáních je názorně patrná v situacích, kdy dojde k jejich dysfunkci, jak bude dokumentováno v této podkapitole.

Srdeční tkáň: arytmogenní syndromy spojené s genem hERG

Jak vyplývá z výše uvedených vlastností vrátkování kanálů hERG, důležitou úlohu sehrává proud procházející tímto kanálem nazývaný I_Kr zejména ve fázi repolarizace (tj. ve fázi 3) akčního napětí srdečních buněk (graf 1) [2,14]. V souhře s dalšími repolarizačními proudy se tak I_Kr podílí na udržování adekvátní délky akčního napětí srdečních buněk.

Funkční změny kanálu hERG (a tedy i I_Kr) mohou vést v srdeční tkáni ke změnám rychlosti repolarizace akčního napětí srdečních buněk, a tím ke změnám délky intervalu QT na EKG, případně až ke vzniku arytmií včetně život ohrožujících arytmií. Samotná funkční změna jediného repolarizačního proudu však obvykle nemívá výrazné účinky na srdeční elektrofyziologii. Celková repolarizační síla je dána aktivitou řady repolarizačních proudů, které se mohou do jisté míry zastupovat – tzv. repolarizační rezerva popsaná poprvé v roce 1998 [15]. Projevy dysfunkce jednotlivých repolarizačních proudů včetně I_Kr jsou proto obvykle patrné jen za situace, v níž dojde k současné změně funkce u několika z nich.

Co se týká možné dysfunkce I_Kr, může dojít jednak ke snížení jeho funkce, a tím k prodloužení intervalu QT na EKG (graf 2, levá část). Pak vzniká tzv. syndrom dlouhého intervalu QT (LQTS), který může být buď dědičný [1] nebo získaný [16]. Méně často je funkce I_Kr navýšena, interval QT se zkracuje a vzniká syndrom krátkého intervalu QT (SQTS); graf 2, pravá část) [17]. Jelikož tyto syndromy jsou dobře známy, omezily jsme jejich popis na nutné minimum.

Dědičný LQTS je autosomálně dominantně dědičná porucha způsobená převážně mutacemi v genech kódujících strukturu srdečních iontových kanálů. Méně než 12 % mutací se vyskytuje de novo [18]. Mutace v genu hERG jsou spolu s mutacemi v genu KCNQ1 nejčastějším typem mutací asociovaných s LQTS; společně se podílí na 87 % diagnostikovaných dědičných LQTS. Samotné mutace v genu hERG jsou diagnostikovány až u 45 % všech pacientů s LQTS – tzv. LQTS typu 2 (LQT2) [1,19]. Doposud bylo identifikováno již více než 160 různých mutací v genu hERG; 61,7 % tvoří bodové substituční mutace jedné aminokyseliny, převážně se nacházející na C- a N-terminálním konci a v oblasti póru kanálu [6]. Mutace vedou u LQT2 ke snížení I_Kr. Tok K⁺ v buňkách myokardu důležitých pro jejich repolarizaci se tak významně sníží, což se projeví prodloužením repolarizace akčního napětí, a tím i prodloužením intervalu QT na EKG (graf 2, levá část) [2].

Klinicky je LQT2 charakterizován výskytem synkop v důsledku přechodného nedokrvení mozku během tachyarytmie, konkrétně obvykle polymorfní komorové tachykardie typu torsades de pointes. Tato arytmie může vyústit ve fibrilaci komor a vést tak až k náhlé srdeční smrti [20]. Arytmie postihují jedince s dysfunkcí genu hERG nejčastěji během spánku, méně častým spouštěčem bývá emocionální stres [21], což souvisí s existencí výše zmíněné repolarizační rezervy [22]. Prodloužený interval QT je často identifikován až po první synkopě či srdeční příhodě. Až u 30 % nediagnostikovaných pacientů s LQT2 je právě náhlá srdeční smrt první známkou choroby. Klinický průběh závisí na délce inter­valu QT, pohlaví, věku, genotypu, počtu synkop a na pozitivní rodinné anamnéze [23].

Z hlediska diagnózy má určující význam právě délka intervalu QT na EKG. V praxi se používá hodnota intervalu QT korigovaného na srdeční frekvenci (QTc) [24]. Hraniční hodnoty pro QTc jsou (mimo jiné i v závislosti na pohlaví) 420–470 ms [25]. Délka více než 500 ms již znamená značné riziko, přičemž každý nárůst hodnoty o 10 ms zvýší riziko srdečních příhod o 5 % [20]. Kromě prodlouženého intervalu QT je viditelná i specifická vlna T s nízkou amplitudou a často dvojitým vrcholem (graf 2, levá část) [26].

K léčbě a preventivním opatřením LQT2 se využívá antiadrenergní terapie v podobě podávání betablokátorů, případně sympatické denervace srdce [27]. Vysoce rizikovým pacientům a těm, u kterých i přes preventivní podávání betablokátorů synkopy přetrvávají, je doporučena implantace kardioverteru-defibrilátoru [28].

Získaný LQTS může vzniknout na různém podkladě, např. vlivem elektrolytové dysbalance nebo v důsledku aplikace léků (tzv. léky indukovaný LQTS). Nejčastější příčinou tohoto nežádoucího účinku léčiv je právě blokáda hERG kanálů. K lékům vyvolávajícím získaný LQTS patří široké spektrum antihistaminik, antibiotik, anti­psychotik či antiarytmik [16]. Léčiva způsobující získaný LQTS snižují I_Kr dvěma způsoby. Mohou buď přímo blokovat kanál navázáním na specifická vazebná místa, nebo účinkují nepřímo přerušením tvorby kanálového proteinu [29]. Podobně jako u dědičného LQTS může být výsledkem prodloužení intervalu QT a vznik komorových tachykardií typu torsades de pointes či náhlé úmrtí. Celkové proarytmické působení těchto léků však závisí i na predispozicích a rizikových faktorech jednotlivých pacientů [30].

SQTS je porucha činnosti srdce charakteristická zkráceným intervalem QT na EKG a vysokou incidencí komorových arytmií [31]. Dědičnost je stejně jako u LQTS autosomálně dominantní. SQTS je asociován s vysokým rizikem náhlé srdeční smrti hlavně během prvních měsíců života. Diagnostika se opírá o EKG obraz, výskyt arytmie a o pozitivní rodinnou anamnézu [32]. Mutace v genu hERG jsou příčinou SQTS typu 1. Bylo identifikováno několik mutací vyúsťujících do substituce jedné aminokyseliny [17,33]. Všechny vedou k nárůstu I_Kr, a tím ke zkrácení akčního napětí [17]. Výsledkem je zkrácení intervalu QT < 340 ms a vyšší vlna T na křivce EKG (graf 2, pravá část) [32].

Nervová tkáň: zvýšená excitabilita neuronů na podkladě snížené funkce hERG kanálů

Co se týče nervového systému, funkční exprese hERG kanálů byla mimo jiné identifikována v senzorických orgánech laboratorních zvířat, konkrétně v čichovém bulbu a vnitřním uchu (jak již bylo zmíněno, v nehumánních tkáních označovány jako ERG kanály/gen) [34,35].

V myším čichovém bulbu jsou kanály součástí mitrál­ních buněk, speciálních neuronů účastnících se přenosu vzruchu z primárních receptorových neuronů do příslušné oblasti mozkové kůry. Soudí se, že ERG kanály regulují excitabilitu a elektrickou aktivitu těchto buněk [34]. ERG kanály jsou součástí membrán i v myších inter­mediárních buňkách stria vascularis a ve vláskových buňkách vnitřního ucha, kde regulují výtok K⁺ z intermediárních buněk do endolymfy vnitřního ucha, čímž se podílejí na tvorbě endokochleárního potenciálu [35].

V Purkyňových buňkách mozečku myší se proud přes ERG kanály podílí na kontrole membránové excitability a frekvence výbojů neuronů včetně adaptace této frekvence [11]. Podobně je to u hybridních neuroblastomových buněk. Při depolarizaci membrány neuronů dochází k jejich výboji (tj. ke vzniku akčního napětí), který je zaznamenán na křivce jako hrot [36]. Aplikace specifického inhibitoru ERG kanálů, WAY 123,398, a následně indukovaných depolarizačních pulzů způsobuje v Purkyňových buňkách změnu trvání akčního napětí a zvýšení frekvence hrotů v porovnání s kontrolními buňkami bez inhibitoru. Tyto pokusy dokazují, že se ERG kanály účastní tvarování akčního napětí neuronů a snižování jejich excitability [11].

Uplatnění kanálů hERG v excitabilitě neuronů má své důsledky i u lidí. Dysfunkce těchto kanálů může mít v mozečku dopad na kontrolu motorických funkcí [11], jak naznačují i některé klinické práce [37,38]. Mutace nebo defektní exprese hERG v neuronech může vést k trvalé hyperexcitabilitě neuronů a jejich neschopnosti přizpůsobit se opakovaným stimulům. Tvoří se tak předpoklad pro vývoj některých poruch nervového systému, jako jsou schizofrenie nebo epilepsie [5,36].

Huffaker et al [39] identifikovali v mozku specifickou variantu hERG, izoformu hERG-3.1 (označovanou také jako hERG1c), která je exprimována ve zvýšené míře u schizo­freniků. Jak tato studie prokázala, podkladem rozvoje schizofrenie je přítomnost jednonukleotidových polymorfizmů, které zesilují expresi izoformy hERG-3.1 oproti obvykle přítomnému hERG. Jak již bylo zmíněno, jednotlivé izoformy hERG se liší nejen svou strukturou, ale i elektrofyziologickými vlastnostmi. Při zvýšené expresi hERG-3.1 se zvýší excitabilita neuronů, což vede k nárůstu frekvence neuronových impulzů a ke vzniku neadaptivní frekvence hrotů projevující se po opakované stimulaci neuronů. Dokonce i zdraví jedinci s rizikovou alelou (tj. se vzácnější variantou nukleotidu) vykazovali nižší inteligenci a rychlost kognitivních procesů a také pozměněné funkce hipokampu.

Již byla dokumentována i korelace mezi udržováním pozornosti, krátkodobou pamětí a genotypem schizo­freniků. Pacienti s rizikovou alelou T v polymorfizmu označeném jako rs3800779 prospívali v kognitivních testech výrazně méně než homozygotní jedinci s geno­typem GG. G je tomto případě v populaci běžnější varianta alely [40]. Sekvenční varianty v dalším polymorfizmu, rs1036145, zase korelovaly s účinností antipsychotických léčiv. Homozygotní jedinci v rizikové alele T (tj. s genotypem TT) reagovali na léčbu výrazněji – příznaky se u nich zmírnily markantněji než u heterozygotních pacientů s genotypem CT nebo homozygotních pacientů s genotypem CC [41].

Kromě schizofrenie bývá ve spojitosti s hERG zmiňována také epilepsie. LQT2 může být nesprávně diagnostikován jako epilepsie a následně léčen antiepileptiky [42], která však nevykazují požadovaný efekt [43]. Možným podkladem může být jednak specifický ráz synkop, které jsou vyprovokovány dočasným nedostatečným prokrvením mozku během tachyarytmie asociované s LQTS. Potenciální příčinou vzniku skutečného epileptického záchvatu u pacienta s LQT2 však může být i mutace v hERG, která se projeví v obou systémech, v nichž je tento gen fyziologicky exprimován. Zamorano-Leon et al [43] identifikovali de novo mutaci R863X v exonu 10 genu hERG. Výsledná delece 296 aminokyselin v proteinu byla podkladem epilepsie i LQT2 zároveň. Zkoumaný subjekt trpěl kromě prodlouženého intervalu QT na EKG i rekurentními epizodami záchvatů a synkop vznikajících na podkladě hyperexcitability neuronů v důsledku snížené funkce hERG kanálů v mozkové tkáni. Tento patogenetický mechanizmus zahrnuje gliové buňky astrocyty v hipo­kampu, v němž byl gen detekován [44].

Hladké svalstvo: regulace motility prostřednictvím hERG kanálů

Aktivita hERG kanálů byla zaznamenána v hladké svalovině různé lokalizace, konkrétně v trávicím traktu [45], myometriu [46] a části pohlavních žláz [47].

V gastrointestinálním traktu hERG kanály participují na kontrole motility hladkého svalstva díky schopnosti modulace elektrické aktivity buněk [12,45]. Izoformy hERG1a a hERG_USO byly identifikovány v podélné i kruhové svalovině a v enterických neuronech jejuna. Význam hERG byl zkoumán na základě inhibice blokátory. Ty depolarizují V_m a ovlivňují tak elektrické i kontraktilní vlastnosti tkáně. Nízká koncentrace inhibitoru E-4031 zesiluje amplitudu fázických kontrakcí, naopak vysoké koncentrace E-4031 snižují jejich amplitudu i frekvenci, až se vyvinou kontrakce tonické. Při nízkých koncentracích je efekt způsoben zvýšenou frekvencí akčních napětí v buňkách, což podněcuje vstup Ca²⁺ do buněk a svalový stah [12].

Vliv ERG na motilitu hladké svaloviny byl pozorován i v žlučníku morčete. Inhibice ERG specifickým blokátorem E-4031 způsobovala excitační vzplanutí (tj. vysokou frekvenci hrotů), které nastalo díky prodloužení repolarizace po fázi plató akčního napětí buňky. V důsledku toho došlo ke zvýšení kontraktility svalů, avšak na rozdíl od studie Farrelly et al [12] byl sledován tento účinek jen při nižších koncentracích E-4031, které zvýšily sílu a zároveň snížily frekvenci fázických kontrakcí. Klidový tonus svalu vzrostl [45].

Pozoruhodnou úlohou ERG kanálů je ovlivňování stahů myometria. V myším myometriu jsou tvořeny izoformy ERG1a a ERG1b, s převahou proteinu ERG1a. U negravidních myší vyvolá aplikace E-4031 a dofelitidu (tj. inhibitorů ERG) spontánní kontrakce. Aktivátory ERG, konkrétně PD118057 a NS1643, spontánní kontrakce naopak potlačují. Důvodem poklesu kontraktility může být repolarizace V_m umožněná aktivací ERG a zkrácení fáze plató akčního napětí myocytů. Redukuje se i tok Ca²⁺ proudících do buňky, čímž dochází ke snížení intenzity a trvání stahů [46,48].

Aplikace inhibitorů nebo aktivátorů ERG kanálů v pozdní stadiu gravidity nemá na rozdíl od negravidních myší na kontraktilitu dělohy žádný vliv. Předpokládá se tedy účast ERG kanálů na udržení plodu v děloze zejména během časné fáze gravidity [46]. Množství ERG1a nebo ERG1b je před graviditou a během ní téměř konstantní. Vystupňuje se však exprese genu KCNE2 a jeho produktu, tj. regulační pomocné β podjednotky, která redukuje tok iontů přes α podjednotku ERG/hERG kanálu [46,49]. Poklesem aktivity ERG před porodem se prodlouží trvání akčního napětí buněk a délka kontrakcí. Zjistilo se, že u žen s nadváhou je aktivita hERG zesílená úměrně s indexem tělesné hmotnosti, a to v důsledku snížené exprese inhibiční β podjednotky. Výsledkem je zkrácení fáze plató akčního napětí, a tím pádem i zeslabení stahů myometria. Tento fakt nesporně významně přispívá k nižší incidenci porodů přirozenou cestou u obézních žen [48].

Mewe et al [47] identifikovali funkční izoformy ERG, s dominující ERG1b, ve vývodu bovinních nadvarlat. Spontánní fázické kontrakce jsou v nadvarlatech nutné pro transport spermií. Aplikace E-4031, cisapridu nebo dofelitidu zesilovala spontánní kontrakce a snižovala jejich frekvenci, zatímco přítomnost aktivátoru NS1643 stahy potlačovala.

Na rozdíl od hladké svalové tkáně je v kosterní svalovině tvorba proteinu hERG limitována jen na embryonální stadium, během kterého se účastní vývoje svalového systému [50].

Endokrinní buňky: regulace sekrece hormonů prostřednictvím změn aktivity hERG kanálů

Inhibice nebo snížení aktivity hERG kanálů má v některých endokrinních buňkách podobný účinek jako v hladké svalové tkáni. Přítomná je depolarizace V_m a nárůst frekvence akčních napětí vedoucí ke vzrůstajícímu uvolňování hormonů [3].

Kolísající aktivitou hERG kanálů je regulovaná sekrece hormonů např. v α- a β-buňkách Langerhansových ostrůvků pankreatu, které se významně podílejí na stabilizaci glykemie [13,51]. V obou typech buněk mají hERG kanály odlišnou úlohu – jsou negativním regulátorem sekrece inzulinu v β-buňkách a pozitivním regulátorem sekrece glukagonu v α-buňkách [13].

V β-buňkách stimuluje glukóza produkci ATP, které omezí aktivitu K⁺ kanálů citlivých k ATP. Dojde k depolarizaci membrány, následnému vtoku Ca²⁺ a exocytóze inzulinu do krve. Repolarizaci β-buněk zabezpečují právě hERG kanály, čímž participují na regulaci sekrece inzulinu [13]. Při inhibici hERG kanálů dochází k hyperexcitabilitě β-buněk ústící do zvýšení sekrece inzulinu až o 77 % [52]. Inhibitor přidaný ke glukóze, která sekreci β-buněk stimuluje, způsobí nárůst vtoku Ca²⁺, což má za následek na glukóze závislou sekreci inzulinu. U α-buněk uvolňujících glukagon působí inhibice hERG přechodné zvýšení Ca²⁺ naopak jen v menšině případů. Za přítomnosti nízké koncentrace glukózy se přeruší při inhibici blokátory hERG kanálů uvolňování glukagonu. Dochází k tomu v důsledku výraznější depolarizace α-buněk, která inaktivuje Na⁺ a Ca²⁺ kanály. Předpokládá se, že příčinou je odlišný mechanizmus regulace vzniku akčních napětí v α- a β-buňkách. Různé působení hERG kanálů v pankreatických buňkách má potenciální terapeutické využití. Inhibice tohoto kanálu, která vede ke zvyšování hladiny inzulinu a poklesu tvorby glukagonu, by mohla být v budoucnu přínosná při léčbě diabetu [13].

Zvýšení sekrece inzulinu po aplikaci inhibitoru hERG kanálů naznačuje, že mutace v genu hERG či jinak navozené změny v aktivitě těchto kanálů mohou způsobit hyperinzulinemii. Jednou z poruch hladiny inzulinu je nezidioblastóza neboli dětská perzistující hyperinzulinemická hypoglykemie. Tuto poruchu způsobují převážně mutace v genu pro K⁺ kanály citlivé k ATP, nevylučuje se však ani původ v genu hERG [52].

Kanály hERG jsou důležitým regulátorem sekrece prolaktinu a luteinizačního hormonu. Aktivita hERG kanálů zajišťuje nízkou koncentraci Ca²⁺ v buňkách omezením jejich vtoku. Inkubace s E-4031 vede tedy k podstatnému nárůstu uvolňování prolaktinu a luteinizačního hormonu. Fyziologicky přítomným analogem inhibitoru hERG kanálů E-4031 je v případě prolaktinu tyreotropin uvolňující hormon (TRH). Při sekreci luteinizačního hormonu je aktivita hERG kanálů snížena gonadoliberinem. Podstatou uvolnění hormonů je depolarizace membrány a následně vstup Ca²⁺, které způsobí exocytózu váčků s preformovanými molekulami hormonu. TRH navíc v první fázi svého působení zvyšuje intracelulární koncentraci iontů z buněčných zásob pomocí inozitoltrifosfátu [53,54].

Význam kanálů hERG v nádorových tkáních

hERG v buněčné proliferaci a apoptóze

Za normálních okolností se nacházejí hERG kanály kromě výše zmíněných tkání i v embryonálním stadiu vývoje periferní nervové a kosterní svalové tkáně [50]. V pozdějších etapách vývoje jsou nahrazeny kanály s K⁺ proudem typu I_K1 [55]. Nádorové buňky vycházející z těchto tkání však hERG kanály opět obsahují. Tvorba hERG kanálů zde představuje buďto obnovu exprese genu hERG umlčovaného v diferenciovaných buňkách, anebo reaktivaci embryonálních genů [56]. Jak bude dále rozebráno, aktivita hERG kanálů poskytuje nádorovým buňkám výhodu oproti ostatním buňkám a přispívá k nekontrolovatelnému růstu nádoru [55].

Přítomnost kanálů hERG v membráně nádorových buněk sehrává prostřednictvím ovlivňování V_m během proliferace důležitou úlohu v regulaci buněčného cyklu. V_m podléhá během dělení buňky změnám (schéma), za které jsou odpovědné různé iontové proudy [57,58]. V buňkách se podle typu tkáně pohybuje hodnota V_m mezi -40 mV až -90 mV, přičemž u neproliferujících diferenciovaných buněk je to -70 mV až -90 mV [59]. Negativní hodnoty V_m nutné pro ustálení, ukončení buněčného cyklu a diferenciaci udržuje v normální tkáni výše zmíněný I_K1. V buňkách s proudem přes hERG kanály (I_hERG) se posouvá V_m ke kladnějším (avšak stále záporným) hodnotám, protože kanály hERG se zavírají dříve než kanály I_K1 v diferencovaných buňkách. Kombinace absence I_K1 a současné přítomnosti I_hERG způsobuje, že V_m nedosahuje zápornějších hodnot než -40/-50 mV. Díky tomu ztrácí buňka kontrolu nad proliferací a začne se neregulovaně množit. Nádorové buňky tak utvářením I_hERG získají selektivní výhodu [55], protože depolarizovanejší V_m oproti zdravým buňkám té stejné tkáně je považováno za stálý signál pro proliferaci [57]. Depolarizaci V_m v pravém smyslu slova způsobují během buněčného cyklu jiné proudy, zejména vtok Na⁺ a Ca²⁺ a výtok Cl^- [57,58]. I_hERG se rovněž účastní repolarizace na konci G1 fáze nutné pro přechod do S fáze, ve které se syntetizuje DNA [59]. Úlohu hERG kanálů v proliferaci nádorových buněk potvrdila jejich inhibice specifickými blokátory, která vedla k zástavě množení nádorových buněk přecházejících z G1 fáze buněčného cyklu do jeho S fáze, což dokazuje zapojení hERG kanálů právě do této části buněčného cyklu [60,61].

Mnohé nádorové buněčné linie exprimují kromě hERG i jeho izoformu hERG1b. Alternativní transkript hERG1b vytváří N-terminálně zkrácený protein neobsahující doménu PAS [56]. Kanály se dále liší elektrofyziologickými vlastnostmi – kanály hERG1b se aktivují i deaktivují rychleji [62]. Na plazmatické membráně nádorové buňky mohou tvořit hERG a hERG1b heterotetramerní struktury. Tyto proteiny jsou tvořeny v odlišných množstvích v závislosti na fázi buněčného cyklu, čímž mohou regulovat proliferaci buněk a poskytovat výhodu nádorovým buňkám v hypoxickém prostředí [56].

Kromě proliferace jsou hERG kanály zahrnuté i v některých apoptotických drahách. Mezi inhibitory hERG kanálů, které mohou indukovat apoptózu v nádorových buňkách a zabránit tak růstu nádoru, patří např. doxazosin, řadící se do skupiny léčiv s antihypertenzním účinkem. V buňkách glioblastomu obsahujících hERG kanály navozuje apoptózu aktivací proapoptotických faktorů a inaktivací antiapoptotických faktorů. Jako proapoptotické faktory se tu uplatňují p38 mitogenem aktivovaná protein kináza (MAPK) a apoptotické enzymy, jmenovitě kaspázy 9, 7 a 3. Apoptóze zamezuje poly ADP-ribóza polymeráza, opravující chyby v DNA, která je však působením doxazosinu inaktivována. S apoptózou navozenou doxazosinem je spojená i redukce proteinu hERG. Soudí se tedy, že inhibice hERG indukuje apoptózu glioblastomových buněk. Podobné výsledky jako doxazosin vyvolává i antidepresivum desi­pramin a krátká interferující RNA (siRNA), která snižuje expresi genu hERG [63].

Možným vysvětlením pro apoptózu vyvolanou doxazosinem je aktivace kaspáz, která vyústí do rozštěpení fokální adhezivní kinázy (FAK) a následné apoptózy. FAK tvoří kromě toho v buňkách neuroblastomu i makromolekulární komplex s hERG a integrinem β1. Integrin β1 je membránový receptor důležitý pro interakci buněk, jejich adhezi a aktivaci signálních drah. Adheze buněk pomocí integrinu β1 způsobuje aktivaci hERG kanálů, které jsou nutné pro fosforylaci FAK. FAK sehrává důležitou úlohu v adhezi a migraci buněk. Inhibice hERG tedy způsobí, že FAK se nemůže fosforylovat a účastnit se buněčné signalizace, což vyústí do buněčné smrti způsobené neschopností adheze. Nadměrná produkce FAK je naopak spojená se vzrůstající invazivitou nádoru [59,64].

hERG a různé typy nádorů

Exprese genu hERG byla prokázána v lidských nádorových buňkách různého původu [55]. Odpovídající protein chyběl v normálně funkčních buňkách, ze kterých se nádorové buňky vyvinuly [65].

Mezi epitelové nádory spojené s hERG se řadí karcinom endometria, tlustého střeva, žaludku a kůže [59]. V karcinomu endometria je gen hERG exprimován v mnohem vyšší míře než v endometriu bez neoplastických změn. Hyperplastické endometrium vyznačující se zmnožením počtu buněk bez maligní transformace gen neexprimuje [65]. Podobný výsledek byl zaznamenán i v kolorektálním karcinomu. Příslušný protein byl lokalizován ve všech patologických vzorcích bez ohledu na lokalizaci nebo stupeň diferenciace nádoru. V adenomech a histopatologicky negativních kontrolních vzorcích se jeho přítomnost neprojevila. hERG kanály tedy nemají v normální zdravé epiteliální tkáni tlustého střeva nejspíše žádnou funkci [66]. Aktivita hERG kanálů může v karcinomu kolorekta modulovat i invazivitu buněk. Jak ukázali Lastraioli et al [67], množství proteinu hERG přítomného na plazmatické membráně nádorových buněk stoupá s invazivitou nádoru; jeho vysoký výskyt je spojený s metastazujícími karcinomy.

V buňkách karcinomu žaludku se navíc od předchozí studie ukázala korelace mezi mírou exprese proteinu hERG, zralostí nádoru a jeho rozšířením v těle. Množství hERG bylo prokazatelně vyšší v málo diferencovaných buňkách karcinomu nežli v buňkách dobře diferencovaných. Proliferaci buněk karcinomu žaludku, a tím i růst tumoru a jeho invazivitu, je možné inhibovat pomocí umlčení genu pomocí siRNA, což dokazuje významnou úlohu těchto kanálů v procesu karcinogeneze buněk žaludku [68]. Induktor hERG kanálů PD118057 naproti tomu zvyšoval počet migrujících a invazivních buněk v melanomu [69].

Dominantní úlohu má hERG během fáze repolarizace akčního napětí v buňkách izolovaných od SH-SY5Y klonů neuroblastomu [70]. Vyšší expresi hERG vykazují též gliomy, nádory z podpůrných gliových buněk – astrocytů a oligodendrocytů. Bylo prokázáno, že tato exprese koreluje se stupněm diferencovanosti tumoru. Vysoká míra aktivity proteinu hERG v gliomech se zdá být spjatá s procesem neoangiogeneze. Proces je modulován sekrecí vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF) na úrovni mediátorové RNA [71].

V souvislosti s hERG kanály jsou také často zmiňovány leukemie, zejména akutní myeloidní a lymfoblastická leukemie [72]. Gen hERG se exprimuje v 78 % případů akutních myeloidních leukemií, a to v leukemických blastech periferní krve. V nepatologických mononukleárních buňkách je nedetekovatelný, rovněž i v buňkách CD34⁺, hemopoetických progenitorních buňkách kolujících v krvi. Jeho aktivace v buňkách CD34⁺ nastává po indukci mitotického cyklu cytokiny a růstovými faktory [61].

Při akutní myeloidní leukemii byla častěji evidována exprese genu hERG1b ve srovnání s hERG [73]. Následně tvořený protein hERG nebo hERG1b reguluje motilitu a migraci leukemických buněk přes endotel. Protein hERG1b vytváří makromolekulární signální komplexy s receptorem pro VEGF a s β1 podjednotkou receptoru pro integrin. VEGF produkovaný leukemickými buňkami hraje významnou roli v procesu neoangiogeneze. Spolupráce integrinů, VEGF a hERG1b kanálu stimuluje signální cestu fosfatidylinositol-3-kinázy/Akt, která je nutná pro migraci leukemických blastů. Akt je protein kináza B. Společně se signální cestou se aktivuje i MAPK zodpovědná za proliferaci buněk [74].

U akutní lymfoblastické leukemie hERG moduluje signály pro přežití vysílané mikroprostředím kostní dřeně a reguluje chemorezistenci [75]. Ve vysoké míře je nalézán transkript genu hERG1b, který má negativní vliv na prognózu leukemie. Exprese hERG je obecně potlačená, ale převažuje nad hERG1b u pacientů s T buněčnou lymfo­blastickou leukemií s vysokým počtem leukocytů nebo u pacientů s pro-B lymfoblastickou leukemií [72]. Přítomnost transkriptů hERG se objevuje dále u chronické myeloidní leukemie, akutní promyelocytární leukemie nebo Burkittova lymfomu [60].

Diagnostické a terapeutické využití hERG kanálů

Kanály hERG jsou primárně cílem působení antiarytmik třídy III, která nacházejí uplatnění v léčbě poruch srdečního rytmu včetně SQTS [17]. Výskyt kanálů i v dalších tkáních však rozšiřuje potenciální možnosti jejich apli­kace v terapii a diagnostice dalších poruch [5]. Týká se to např. ovlivňování sekrece inzulinu a glukagonu pomocí inhibice hERG kanálů, což by mohlo být podkladem pro léčbu diabetu [13].

Jako perspektivní se jeví využití hERG zvláště v diagnostice a léčbě nádorových onemocnění [68]. I když bylo v posledních letech v biomedicinském výzkumu identifikováno více nových biomarkerů a potenciálních terapeutických cílů, výsledky jsou doposud neuspokojivé. Východiskem by se mohlo stát zaměření na iontové kanály [76]. Jelikož se ve většině netransformovaných tkání hERG kanály nenacházejí, mohou být využity jako marker tumorů [59]. Příkladem je studie zabývající se kolo­rektálním karcinomem, v níž byl gen hERG se 100% specifitou a senzitivitou výhodnějším markerem než běžně určovaný karcinoembryonální antigen nebo cyto­keratin 19. Pomocí imunohistochemických metod bylo možné navíc identifikovat i velmi časná stadia recidivy tumoru [66]. Exprese hERG má i prognostický význam. U akutní myeloidní leukemie mají pacienti s nálezem funkčního genu hERG vyšší pravděpodobnost relapsu choroby. Znatelně se jim zkracuje délka přežití oproti pacientům neexprimujícím hERG, a to až o 11 měsíců [74].

Východiskem protinádorové terapie cílené na hERG kanály je jejich přímá inhibice s výsledným antiproliferativním a proapoptotickým efektem vedoucím k zastavení růstu nádoru a snížení jeho invazivity [59]. V buňkách glioblastomu redukuje léčivo doxazosin expresi proteinu hERG a navozuje apoptotický efekt aktivací proapoptotických faktorů [63]. Kanály jsou dále citlivé i na chemoterapeutika vinkristin a paklitaxel. Makrolidové antibiotikum erytromycin s inhibičním účinkem na hERG potencuje antiproliferativní efekt tohoto chemoterapeutika [77].

Systémová léčba nádorových nebo jiných onemocnění pomocí antagonistů hERG však může zasáhnout srdeční buňky a způsobit prodloužení intervalu QT vedoucí případně až k letální komorové tachykardii [59,78]. Z tohoto důvodu bylo v posledních letech velké množství rozmanitých léčiv buď staženo z trhu (prokinetikum cisaprid, antihistaminikum astemizol), omezených v užívání (antipsychotikum sertindol), nebo vydávaných s varováním (antibiotikum moxifloxacin). Časná a spolehlivá detekce účinku léčiv na hERG se tak díky možným konsekvencím stala důležitým aspektem při vývoji všech nových léčiv [79].

Potenciálnímu riziku vzniku arytmií by se v terapii nádorových onemocnění dalo vyhnout aplikací léčiv s kombinovaným účinkem. Mezi takovéto prostředky patří roskovitin blokující cyklin dependentní kinázu a aktivované hERG kanály, což je žádoucí v protinádorové terapii. Zároveň inhibuje i napěťově řízené depolarizační Ca²⁺ kanály v srdci, čímž se minimalizují potenciální vedlejší činky inhibice repolarizačních hERG kanálů [80]. Jinou alternativou léčby může být ovlivňování exprese genu hERG pomocí RNA interference. Jde o posttranskripční mechanizmus vedoucí k tzv. umlčování genů, jehož výsledkem je zabránění progrese nádoru [81]. Další možností jsou léčiva zabudovaná do nanočástic s afinitou jen k cílové tkáni, čímž se minimalizuje toxický účinek na ostatní buňky [82]. Při jakékoli metodě inhibující hERG je kvůli potenciálním život ohrožujícím vedlejším účinkům nutné pečlivé klinické pozorování s možností včasného odhalení nežádoucích účinků léčby.

Závěr

Kanály hERG byly donedávna spojovány primárně se srdeční elektrofyziologií a s poruchami funkce srdce typu LQTS nebo SQTS. Z dalších významných funkcí těchto kanálů je potřeba zdůraznit ovlivňování dráždivosti neuronů a jejich adaptaci na podněty, modulaci kontraktility hladkého svalstva, podíl na kontrole uvolňování některých hormonů a v neposlední řadě usměrňování proliferace a apoptózy nádorových buněk. Kanály hERG by se tak mohly v budoucnu stát významným diagnostickým markerem a modulování jejich aktivity terapeutickým nástrojem. Naděje se vkládají především do protinádorové léčby, která je však limitována možnými nežádoucími účinky léčiv ovlivňujících funkci hERG kanálů. Proto se hledají nové způsoby aplikace těchto léčiv nebo jiné alternativní možnosti. V nejbližších letech bude třeba provést mnohé další studie zabývající se komplexnějším prozkoumáním efektu hERG kanálů na různorodé buněčné procesy a zvýšit povědomí o jejich možném využití.

Podpořeno z programového projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č. 16–30571A.

doc. MUDr. Markéta Bébarová, Ph.D.

bebarova.lfmu@centrum.cz

Fyziologický ústav LF MU,

Brno

www.med.muni.cz

Doručeno do redakce 29. 11. 2016

Přijato po recenzi 2. 2. 2017