Acyklické nukleosidfosfonáty jako potenciální antineoplastika

Súhrn

Nedávno bylo firmou Gilead Sciences (Foster City, CA, USA) zveřejněno potenciální cytostatikum GS‑9219. Jde o nové lipofilní profarmakum látky cyprPMEDAP, z kterého se in vivo, ve dvou stupních, uvolní účinná látka PMEG. Látka GS-9219 má významný terapeutický potenciál při léčbě spontánního nehodgkinského lymfomu u psů a je perspektivní i pro použití v humánní medicíně. cyprPMEDAP tedy představuje klíčový intermediát v intracelulární aktivaci GS-9219. Oba acyklické nukleosidfosfonáty PMEG i cyprPMEDAP, na jejichž základě byla látka GS-9219 vyvinuta, byly objeveny v Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR a tamtéž byl i podrobně prostudován jejich mechanismus účinku. Biologické studie na potkaním lymfomu byly provedeny na 1. LF UK.

Klíčová slova:
PMEG, GS-9219, nehodgkinský lymfom.

Acyklické fosfonátové analogy nukleotidů (acyklické nukleosidfosfonáty, ANP) jsou skupinou virostatik nové generace. Racionální důvody, které vedly konstrukci molekul tohoto typu, vycházely z předpokladu zachování metabolické stability alifatického řetězce, který nahrazuje cukernou část molekuly a jehož relativně volná konformace si podržuje schopnost simulovat přirozený substrát – nukleotid. Navíc zavedením katabolicky neodštěpitelné fosfonátové skupiny do alifatického řetězce byla získána výsledná izosterní a izopolární analogie s nukleotidem (1).

Cytosinový derivát této řady – ((S)-HPMPC, cidofovir, Vistide^®) – získal roku 1996 ve Spojených státech amerických a poté i v Evropě a dalších částech světa povolení ke klinickému použití proti CMV (cytomegalovirus) infekcím u AIDS (syndrom získané imunodeficiencie) pacientů. Látka se jeví jako velmi účinná též k léčbě papilomatózy hrtanu (2), molluscum contagiosum (3), i HPV (human papilloma virus) indukované intraepiteliální neoplazie děložního hrdla (4). Strukturně podobné N–[2–(fosfonometoxy)etyl] deriváty (PME sloučeniny) purinů, zejména adeninu, jsou účinné proti retrovirům včetně HIV (human imunodeficiency virus), který způsobuje onemocnění AIDS (5–10). Tato skupina acyklických nukleotidů též potlačuje multiplikaci DNA virů včetně těch, které v konečné fázi nemoci působí smrt AIDS pacientů (11–15). PMEA a od ní odvozené orální profarmakum bis(POM)–PMEA jsou účinné zejména proti hepatitidě B (Hepsera^®, 2002) (16–18). Posléze objevené N–[2–(fosfonometoxy)propyl] deriváty (PMP sloučeniny), patří mezi nejúčinnější od nukleosidů odvozené antiretrovirální látky vůbec (19–22). Pro léčbu AIDS bylo povoleno profarmakum látky (R)–PMPA (tenofovir disoproxilfumarát, Viread^®, 2001). Tenofovir [(R)-PMPA] je rovněž účinný i proti HBV (virus hepatitidy B) (23).

Prokázali jsme, že tyto látky vykazují též cytostatické a cytotoxické efekty. PMEA, (S)-HPMPA a zvláště PMEDAP mají vliv na růst myších leukemických buněk L1210 in vitro a na syntézu DNA (24). In vivo byla na dvou myších modelech tumorů prokázána významná protinádorová aktivita u guaninového derivátu PMEG (25). Dále jsme nalezli cytostatický efekt PMEA u lymfatické leukémie KHP-Lw-I (spontánní leukémie vzniklá u potkana inbredního kmene Lewis) (26), na spontánní T-buněčný lymfom inbredních potkanů kmene Sprague-Dawley (SD-lymfom) (27) a embryotoxicitu PMEA a (S)-HPMPC na kuřecím a potkaním modelu (28). Zároveň byly zjištěny chromozomové aberace vyvolané PMEA a (S)-HPMPC na HEL buňkách (lidské embryonální plicní buňky) (28). Úvodní studie dále prokázaly významnou protinádorovou aktivitu zejména u látky PMEA (24, 26–28), tj. u adeninového derivátu této řady a později zejména u obdobné látky obsahující 2,6 diaminopurin (PMEDAP). PMEA má také signifikantní účinky imunomodulační (29–33) a antiartritické (34). Srovnání protinádorové aktivity PMEA in vivo, které bylo provedeno na různých experimentálních tumorech u myší a potkanů, ukazuje, že analog je účinný u spontánních nádorů (potkaní SD lymfom, LW13K2 – sarkom potkana kmene LEW, A870N sarkom a ALL – akutní lymfoblastická leukémie, myší LLC plicní karcinom) (35). Na tumorech indukovaných chemicky je látka zcela neúčinná (potkaní FBN sarkom indukovaný ferridextranem a HEP-LEW hepatokarcinom) (35). Protinádorové účinky PMEA byly potvrzeny i v konkurenční laboratoři na modelu potkaního choriokarcinomu (36). U některých nádorových buněčných linií (37) a u choriokarcinomu dochází vlivem PMEA i k indukci diferenciace buněk (38).

Pro další studium protinádorových účinků byl zvolen již zmíněný model T-buněčného lymfomu inbredního kmene laboratorních potkanů Sprague-Dawley (39), a to se zaměřením na látky PMEDAP, PMEG a posléze na N⁶-substituované deriváty PMEDAP, které mají rovněž významnou cytostatickou aktivitu (40–42).

Biochemické studie, které probíhaly paralelně, jsme zaměřili především na transport těchto acyklických nukleosidfosfonátů do buněk, jejich metabolické transformace a dále na nalezení cílových enzymů, které představují molekulární podstatu jejich mechanismu účinku.

Biologické studie

Výše uvedené sloučeniny PMEDAP, PMEG a N⁶-substituované deriváty PMEDAP byly vybrány pro cílené sledování cytostatických účinků na základě signifikantní inhibice proliferace myší linie L929, myší leukémie L1210, HeLa buněk (lidské buňky – karcinom děložního čípku), lidské T-lymfoblastoidní linie (CCRF-CEM) a lidské promyelocytické leukémie HL-60.

Pro in vitro studie byla vybrána T-lymfoblastoidní buněčná linie CCRF-CEM, linie buněk karcinomu děložního čípku HeLa S3 a stabilizovaná diploidní linie plicních embryonálních fibroblastů MRC-5. Cytogenetické vyšetření buněk MRC-5, CCRF-CEM a HeLa bylo provedeno po 24 a 48hodinovém působení PMEDAP, PMEG a N⁶-substituovaných derivátů PMEDAP. Koncentrace testovaných látek se pohybovaly v rozmezí 0,0001–0,1 μmol.l^-1. Po barvení Giemsovým barvivem byly v optickém mikroskopu hodnoceny genotoxické a cytostatické účinky testovaných látek, tzn. strukturní změny a numerické odchylky chromozomů, a relativní mitotická aktivita buněk (43). U všech uvedených buněčných linií byl zaznamenán statisticky významný cytostatický účinek. Numerické chromozomální odchylky nebyly nalezeny; genotoxický efekt se projevil pouze jako chromatidové zlomy. Nejvýraznější cytostatický a genotoxický účinek byl zaznamenán po působení cyprPMEDAP a PMEG. Cytostatický a genotoxický účinek PMEDAP, Me₂NEt--PMEDAP, Allyl-PMEDAP a Me₂-PMEDAP byl ve srovnání s účinkem PMEG a cyprPMEDAP průkazně nižší.

Indukce apoptózy po působení PMEDAP, PMEG a N⁶ substituovaných derivátů PMEDAP byla sledována na buněčné linii MRC-5, CCRF-CEM a HeLa. Pro kvantitativní stanovení apoptotických buněk průtokovou cytometrií byl použit kit Annexin-V-FLUOS (Annexin V/PI). Barvení suspenze buněk Annexinem V a PI (propidium iodid) umožňuje hodnocení jak počátečního stadia apoptózy, tak detekci pozdního stadia zániku buněk (apoptóza/nekróza). PMEG indukoval časnou apoptózu u buněk CCRF-CEM a HeLa. Pouze zanedbatelné procento buněk MRC-5 vykazovalo časné stadium apoptózy. Stadium pozdní apoptózy/nekrózy po působení PMEG zaznamenáno nebylo.

Pořadí citlivosti buněčných linií k indukci časné apoptózy po působení PMEDAP bylo CCRF-CEM > HeLa > MRC-5.

N⁶-substituované deriváty PMEDAP indukovaly časnou apoptózu s výjimkou cyprPMEDAP, kde byla detekována pozdní apoptóza/nekróza. Odlišný nález po působení cyprPMEDAP ve srovnání s ostatními sledovanými N⁶-substituovanými ANP (44) souvisí, jak bude ukázáno dále, s intracelulární přeměnou této látky na PMEG.

Obecně z testů vyplynulo, že nádorové buněčné linie jsou vnímavější k indukci apoptózy po působení ANP oproti linii diploidních lidských embryonálních fibroblastů MRC-5. Z testů in vitro je dále zřejmé, že pro experimentální posouzení genotoxických a cytostatických účinků ANP je nezbytné zohlednit typ buněčné kultury, rozsah koncentrací a dobu působení sledované látky. In vitro testy jednoznačně ukázaly, že nejvyšší cytotoxické účinky má PMEG a cyprPMEDAP. V pokusech in vivo byl však jejich protinádorový efekt spojen s nepříznivými nežádoucími účinky (viz dále).

V souběžně probíhajících in vivo testech se naproti tomu látka PMEDAP projevila jako protinádorově perspektivní, díky zanedbatelným vedlejším účinkům. Po dlouhodobém podávání se ale protinádorová účinnost PMEDAP významně snižovala. Proto byla XTT testem (test stanovující buněčnou proliferaci) v závislosti na dávce PMEDAP (0,15; 0,3; 1,5; 3; 15 a 30 mg/ml) sledována proliferační aktivita buněk MRC 5, CCRF-CEM a HeLa S3 po 72hodinovém působení v kultivačním médiu. Cytostatický účinek PMEDAP byl závislý na typu buněčné linie; snižoval se v pořadí CCRF CEM > HeLa > MRC-5. Na základě těchto výsledků jsme pro dlouhodobé působení PMEDAP zvolili buněčnou linii CCFR-CEM pro studium navození rezistence v in vitro podmínkách. V souhlasu s literárními údaji o látce PMEA (45) jsme se zaměřili na kvantitativní hodnocení exprese genů MRP4 a MRP5 (geny asociované s mnohočetnou lékovou rezistencí) metodou RQ-RT-PCR (kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase). Tyto geny patří do rodiny genů, které se podílejí na odstraňování převážně polárních cytotoxických látek z buněk mechanismem ATP pumpy a indukují tak rezistenci. Buňky CCRF-CEM jsme 5 týdnů pasážovali v médiu s přídavkem 1 μM PMEDAP. Vzorky jsme odebírali v týdenním intervalu, kdy část buněčné suspenze byla využita pro další pasáž v médiu opět doplněném 1 μM PMEDAP. Při každé pasáži buněk jsme hodnotili relativní expresi genů MRP4 a MRP5. Po první pasáži za přítomnosti PMEDAP v kultivačním médiu byla stanovena 10× vyšší transkripční aktivita genu MRP4. V následujících pasážích aktivita genu MRP4 klesala. Naproti tomu transkripční účinnost genu MRP5 měla odlišný průběh, maxima dosáhla až po třech týdnech působení PMEDAP. Jak se potvrdilo i v in vivo experimentech (viz dále), oba tyto geny se podílejí při ochraně buněk proti cytostatickému působení látky PMEDAP (45).

Pro testování protinádorových účinků vybraných acyklických nukleosidfosfonátů byla použita hematologická malignita vznikající spontánně u inbredních potkanů Sprague-Dawley (SD/Cub). Inbrední kmen SD/Cub udržovaný křížením bratr × sestra je chován od roku 1993 v Ústavu biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN v Praze. Tato zvířata mají spontánní výskyt T-buněčných lymfomů. Primární, spontánně vzniklé lymfomy jsou transplantovatelné formou buněčné suspenze na syngenní zvířata, což umožňuje sestavení sourodých skupin pro testy. SD-lymfomy byly charakterizovány na základě hematologického, histopatologického, cytogenetického vyšetření, imunofenotypu a imunohistochemie. Byly definovány jako nehodgkinský typ lymfomu (46). Po inokulaci definovaného počtu buněk do podkoží lymfomy rostou jako ohraničené útvary; jejich plocha anebo hmotnost je měřitelná. V konečném stadiu růstu lymfomu se u zvířat objevuje leukemická fáze onemocnění. Suspenze buněk lymfomu je získána mechanickým rozvolněním nádorové tkáně do roztoku PBS. Pro testování protinádorového účinku ANP bylo používáno inokulum 10⁶ buněk v 0,2 ml PBS. Experimenty na laboratorních potkanech byly schváleny Komisí 1. LF UK pro práci s laboratorními zvířaty. 

Aplikace testovaných látek představovala různé protokoly podání. Modifikace protokolu se týkaly: 1. množství podávané látky; 2. zahájení terapie vzhledem k počátku inokulace buněk lymfomu a 3. časového rozpětí terapie. Spolu se sledováním potlačení růstu lymfomu a přežívání experimentálních zvířat byly sledovány vedlejší účinky testovaných látek (hmotnost zvířat, krevní obraz, cytogenetické vyšetření kostní dřeně, histologické vyšetření ledvin).

PMEDAP signifikantně snižoval proliferační schopnost buněk lymfomu, což se opakovaně projevilo při hodnocení velikosti lymfomu rostoucího v podkoží (měření plochy v průběhu terapie), hmotnosti lymfomu po ukončení terapie a doby přežití ve srovnání s neléčenými zvířaty s lymfomem. Snížení nárůstu nádorové tkáně bylo vždy intenzivní na počátku terapie, postupně se reakce na léčbu snižovala. Po podání PMEDAP nebyly s výjimkou reverzibilního poklesu hmotnosti zvířat a mírného snížení počtu bílých krvinek během podání látky zaznamenány jiné nežádoucí účinky.

Pro posouzení mechanismu vzniku rezistence na PMEDAP při dlouhodobém podávání jsme látku aplikovali během 5 pasáží na mladé zdravé syngenní příjemce inokulované 10⁷ buněk SD lymfomu. Interval mezi pasážemi byl vždy 21 dnů. Dávka 5 mg.kg^-1 aplikovaná 1× denně signifikantně potlačovala růst SD lymfomu během první a druhé pasáže. Od 3. do 4. pasáže nebyl v jednotlivých pasážích zaznamenán rozdíl v růstu SD lymfomu u léčených a neléčených zvířat. Při každé pasáži jsme odebírali část buněčné suspenze pro hodnocení relativní exprese genů MRP4 a MRP5. Transkripční aktivita genu MRP4 byla u všech čtyř odběrů statisticky významně zvýšená: tzn. po celou dobu aplikace PMEDAP. Transkripční aktivita genu MRP5 měla odlišný průběh: během 1. pasáže dosáhla maxima a u vzorků 2. pasáže klesla. Vzorky DNA izolované z buněk 3. a 4. pasáže při aplikaci PMEDAP vykazovaly stejnou relativní expresi genu MRP5 jako vzorky odebrané z SD lymfomů bez terapie (45).

V jiné studii byla v buňkách lymfomu sledována indukce apoptózy po aplikaci PMEDAP. Bylo injikováno 5 mg/kg PMEDAP 1× denně po dobu 5 dnů. Ve 4., 8., 11. a 24. hodině po poslední dávce byly nádorové buňky barveny APO-BrDU soupravou, která značí zlomy DNA a průtokovou cytometrií jsme zhodnotili procento buněk v apoptóze. Maximální zastoupení apoptotických buněk (20%) bylo nalezeno v 8. hodině po poslední dávce látky (47, 48).

N⁶-substituované deriváty PMEDAP – Me₂NetPMEDAP, AllylPMEDAP a Me₂PMEDAP nevykazovaly v našem modelovém systému významný protinádorový účinek při stejném režimu dávkování jako u mateřské látky PMEDAP. Naproti tomu podání cyprPMEDAP a PMEG vyvolalo úplnou zástavu růstu lymfomu v místě inokulace nádorových buněk a nedošlo ani k leukemické fázi onemocnění. Avšak na rozdíl od PMEDAP obě látky měly výrazné vedlejší účinky. Terapeutická dávka cyprPMEDAP nebo PMEG byla snížena až na 1 mg/kg a přesto zvířata, kterým byly látky aplikovány, ztrácela hmotnost. Ztráta hmotnosti vedla při vyšších dávkách léčiva ke kachexii a předčasnému úhynu zvířat (49).

Případné embryotoxické (letální) nebo teratogenní účinky byly testovány na F1 generaci inbredních potkanů LEW × BN (Brown Norway), genotyp +/+, a F1 generaci inbredních potkanů LEW × BN s recesivní mutací v genu podmiňujícím syndrom polydaktilie/luxace (genotyp +/l×) (28). Březím samicím s genotypem embryí +/+ anebo +/l× byl jednorázově aplikován PMEDAP, PMEG a cyprPMEDAP v kritický den vývoje končetin embrya (10. den březosti). PMEDAP neměl embryotoxický ani embryoletální účinek. Po aplikaci PMEG anebo cyprPMEDAP se v závislosti na výši dávky zvyšoval počet resorpcí plodu (embryotoxicita); přesto ale určitý počet embryí přežíval. cyprPMEDAP po vysokých dávkách vyvolal u přežívajících plodů defekty různých částí končetin (44).

Biochemické studie

Význam intracelulární hladiny mono– a difosfátů acyklických nukleosidfosfonátů pro jejich biologickou účinnost je dokumentován selekcí rezistentní buněčné linie, která je, díky omezené schopnosti fosforylace PMEA spojené navíc s jejím zvýšeným transportem z buněk, přibližně 250× odolnější vůči cytotoxickým účinkům této látky než původní buňky (50). Ve velmi podrobné strukturně aktivitní studii s AMP-kinázou typu AK2 (mitochondriální AMP-kináza) o vysoké čistotě (51) jsme ukázali, že tento enzym (monomer o relativní molekulové hmotnosti 26 000), který vykazuje pro přirozené nukleotidy absolutní specifitu k AMP a dAMP, katalyzuje in vitro fosforylaci acyklických nukleosidfosfonátů obsahujících adenin a 2,6-diaminopurin. Relativní účinnost fosforylace látky PMEDAP je ve srovnání s AMP pouze 8,5%, protože fosforylace probíhá s extrémně nízkou V_max a vysokou hodnotu K_m (51).

Naproti tomu fosfonometoxyalkyl deriváty guaninu jsou fosforylovány za účasti GMP-kináz (EC 2.7.4.8). V rozsáhlé studii, které předcházela izolace pěti izoenzymů GMP-kinázy (pI 5,95, 5,50, 5,08, 4,83 a 4,51) z buněk L1210 (52), jsme se podrobně zabývali substrátovými a inhibičními vlastnostmi guaninových acyklických nukleosidfosfonátů s různě modifikovaným alifatickým řetězcem (53). Kinetická data ukazují, že jednotlivé izoenzymy GMP-kinázy fosforylují PMEG s nízkou účinností. Strukturně blízký derivát 2,6-diaminopurinu PMEDAP není GMP-kinázou fosforylován, ani není inhibitorem enzymu (53).

Dále jsme zjistili, že vznikající monofosfáty ANP jsou vysoce potentními inhibitory purinnukleosidfosforylázy (PNP; EC 2.4.2.1) (54). Enzym je jedním z klíčových regulačních enzymů katabolismu purinových nukleosidů. Katalyzuje fosforolýzu inosinu a guanosinu na příslušné báze, které jsou potom reutilizovány prostřednictvím tzv. zachraňujících mechanismů (salvage pathway). Zásah do tohoto děje vede k zástavám buněčné proliferace (55). Zejména v T-lymfocytech dochází v průběhu inhibice PNP k intracelulární akumulaci guanosinu, 2’-deoxyguanosinu, GTP a následně dGTP, který je alosterickým inhibitorem ribonukleotidreduktázy (56, 57). Proliferující T-buňky jsou příčinou řady onemocnění (lymfomy, leukémie, autoimunní choroby), a proto jsou inhibitory purinnukleosidfosforylázy perspektivní chemoterapeutika (58).

Fosforylace do druhého stupně za vzniku difosfátů acyklických nukleosidfosfonátů, které jsou analogy přirozených nukleosid-5’-trifosfátů, probíhá za katalytické účasti nukleosid-5’-difosfátkinázy (59), přičemž substrátová aktivita (k_cat/K_m) je o tři až pět řádů nižší než pro přirozené nukleosid- 5’-difosfáty.

Soubor výše uvedených cytostatických a protinádorových účinků, pozorovaný zejména u purinových N–9-(2–fosfonometoxyetyl) derivátů PMEG, PMEA a PMEDAP, nás vedl k podrobnému studiu interakcí difosfátů těchto sloučenin s DNA–polymerázami (pol; EC 2.7.7.7), které spolupracují při syntéze jaderné DNA. Cílem bylo vysvětlit jejich molekulární podstatu. Pro izolaci enzymů byla vybrána tkáň T lymfomu (39) inbredního kmene laboratorních potkanů Sprague-Dawley. Tento model zvířecí hematologické malignity byl vybrán pro ověřování cytostatických účinků acyklických nukleotidových derivátů in vivo (viz výše).

Postupně byl vypracován způsob izolace pol α, δ, ε* (60) a ε (61) z této tkáně; stanovení inhibice fosfonátových analogů nukleotidů na DNA–polymerázy α, δ a ε bylo prováděno na templát–primerech poly dA–oligodT_12–18, poly dT-oligo dA_12–18 a poly dC-oligo dG_12–18 za optimalisovaných reakčních podmínek. Získaná kinetická data (V_max, K_m) pro inkorporaci přirozených nukleotidů a hodnoty inhibičních konstant (K_i) ukázaly, že nejsilnějším inhibitorem z testované skupiny látek je PMEGpp, kompetitivní inhibitor inkorporace dGTP (^{pol α}K_i/K_m = 0,026; ^{pol δ}K_i/K_m = 0,004) (62).

U 2,6-diaminopurinového derivátu PMEDAPpp se naproti tomu ukázala selektivita účinku: PMEDAPpp je silným inhibitorem pol δ (^{pol δ}K_i/K_m = 0,08), výrazně slabším pro pol α (^{pol α}K_i/K_m = 0,26) a nevýznamným inhibitorem pol ε (^pol εK_i/K_m = 1,25), přičemž kompetuje inkorporaci dATP. PMEDAPpp by mohl teoreticky působit též jako kompetitivní inhibitor inkorporace dGTP do poly dC-oligo dG_12–18. Tato možnost však byla pro pol α a pol ε vyloučena (62). Je tudíž velice pravděpodobné, že interakce acyklických fosforylovaných nukleosidfosfonátů s replikativními DNA-polymerázami úzce souvisí s cytostatickým účinkem původních (nefosforylovaných) látek.

PMEGpp, PMEDAPpp a další deriváty tohoto typu jsou současně i substráty studovaných DNA-polymeráz. Působí jako terminátory nascentních řetězců DNA. Produkty reakce, ANP-terminované DNA řetězce rovněž jednotlivé DNA-polymerázy inhibují. K vyštěpení terminujících ANP dochází působením 3’-5’-exonukleáz asociovaných s pol δ, pol ε a pol ε* (63, 64).

Podle našich posledních zjištění je dalším cílovým enzymem cytostatického účinku látek PMEG a PMEDAP telomeráza. Enzym přidáváním telomerických sekvencí vyrovnává ztrátu repeticí na 3’-koncích chromozomové DNA, k níž by jinak docházelo v nepřítomnosti telomerázy při každém buněčném dělení. Proto je telomeráza aktivní ve většině rychle proliferujících buněk, zejména pak u buněk nádorových. Hraje důležitou úlohu v buněčné „nesmrtelnosti“. Telomeráza zůstává navázaná na své DNA produkty, čímž stabilizuje telomery (repetitivní sekvence na terminálním konci chromozomu), a pomáhá tak chránit chromozomy před degradací a rekombinací.

Metodou „TRAP assay” jsme prokázali, že příslušné difosfáty obou acyklických nukleosidfosfonátů, PMEGpp a PMEDAPpp, telomerázu inhibují (65).

Mimořádně zajímavou skupinou sloučenin, jejíž cytostatické účinky bezprostředně souvisí s látkou PMEG jsou N⁶ substituované deriváty látky PMEDAP (66). Intracelulárně jsou tyto sloučeniny deaminovány na PMEG (66), a představují tedy skupinu profarmak tohoto cytostatika. Jako nejvýznamnější z této skupiny acyklických nukleosidfosfonátů se jeví N⁶-cyclopropyl-2,6-diamino-9-[2-(phosphonometoxy)etyl]purin (cyprPMEDAP). Studium mechanismu intracelulární přeměny N⁶-substituovaných derivátů látky PMEDAP vedlo k charakterizaci dosud nepopsané cytosolární N⁶-metyl-AMP/N⁶-metyl-dAMP-aminohydrolázy (67, 68) enzymu, který s nejvyšší pravděpodobností katalyzuje katabolismus přirozených metylovaných nukleotidů.

Enzym má klíčovou úlohu pro intracelulární aktivaci vyvíjeného cytostatika GS-9219 (69, 70), které je lipofilním profarmakem acyklického nukleosidfosfonátu cyprPMEDAP, a tedy i profarmakem účinné látky PMEG. Látka GS-9219 je mimořádně účinná při experimentální léčbě nehodgkinského lymfomu u psů a je ve fázi I klinických zkoušek.

Závěr

Acyklické nukleosidfosfonáty PMEDAP, PMEG a cyprPMEDAP se v intracelulárním metabolismu chovají jako analogy nukleotidů. Jejich cytostatické účinky jsou podmíněny fosforylací za účasti buněčných nukleosid-5’-fosfátkináz, klíčových enzymů nejen biosyntézy nukleotidů de novo, ale i tzv. zachraňujících mechanismů. Účinnými metabolity jsou výhradně difosfáty příslušných acyklických nukleosidfosfonátů, které inhibují replikaci genomové DNA. Na cytostatickém účinku se zřejmě podílí i jejich interakce s telomerázou a purinnukleosidfosforylázou. I v tomto případě jsou aktivními metabolity příslušné fosforylované formy těchto acyklických analogů nukleotidů. Experimenty in vivo na experimentálním lymfomu (model SD/Cub hematologické malignity inbredních potkanů Sprague-Dawley) ukázaly na značný terapeutický potenciál zejména u látek PMEG a cyprPMEDAP, přičemž bylo prokázáno, že látka cyprPMEDAP je profarmakem látky PMEG. Nežádoucí vedlejší účinky obou acyklických nukleosidfosfonátů evidentně eliminuje lipofilní profarmakum látky cyprPMEDAP, látka GS 9219 vyvinutá v laboratořích farmaceutické společnosti Gilead Science (Foster City, CA, USA), se kterou Ústav organické chemie a biochemie, v.v.i. AV ČR těsně spolupracuje.

Zkratky

AIDS – syndrom získané imunodeficiencie

ANP – acyklický nukleosidfosfonát

APO-BrDU – kit pro detekci apoptózy průtokovou cytometrií

CCRF-CEM – T-lymfoblastoidní buněčná linie

HeLa – linie buněk karcinomu děložního čípku

MRC-5 – stabilizovaná diploidní linie plicních embryonálních fibroblastů

gen MRP4 – kóduje protein 4 asociovaný s mnohočetnou lékovou rezistencí

gen MRP5 – kóduje protein 5 asociovaný s mnohočetnou lékovou rezistencí

PMEG – 9-[2-(fosfonometoxy)etyl]guanin

PMEGpp – 9-[2-(fosfonometoxy)etyl]guanindifosfát

PMEDAP – 2,6-diamino-9-[2-(fosfonometoxy)etyl]purin

PMEDAPpp – 2,6-diamino-9-[2-(fosfonometoxy)etyl]purindifosfát

cyprPMEDAP – N⁶-cyklopropyl-2,6-diamino-9-[2-(fosfonometoxy)etyl]purin

Allyl-PMEDAP – N⁶-allyl-2,6-diamino-9-[2-(fosfonometoxy)etyl]purine

Me₂PMEDAP – N⁶-dimetyl-2,6-diamino-9-[2-(fosfonometoxy)etyl]purine

Me₂NEt-PMEDAP – N⁶-(2-dimetylaminoetyl)-2,6-diamino-9-[2--(fosfonometoxy)etyl]purine

PMEA – 9-[2-(fosfonometoxy)etyl]adenin

(S)-HPMPC – 1-[(S)-3-hydroxy-2-(fosfonometoxy)propyl]cytosin

(R)-PMPA – 9-[(R)-2-(fosfonometoxy)propyl]adenin

pol – DNA-polymerázy

PI – propidium iodid

RQ-RT-PCR – kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase

SD/Cub – inbrední kmen potkanů Sprague-Dawley/Karlova Univerzita Biologie

SD-lymfom – lymfom spontánně vzniklý u potkanů Sprague-Dawley

Práce byla částečně financována z prostředků projektu VZ 0021620808 Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy a z projektu Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy 1M0508.

RNDr. Ivan Votruba, DrSc.

Ústav organické chemie a biochemie, v.v.i., AV ČR

Flemingovo náměstí 2, 160 00 Praha 6

fax: +420 220 183 560, e-mail: votruba@uochb.cas.cz