Problematika personalizované medicíny v hematoonkologii – pohled patologa

Súhrn

Pojem personalizovaná medicína nesplývá pouze s individualizovaným terapeutickým přístupem k pacientovi, jeho nutným předpokladem je i individualizovaný přístup k diagnóze. Většina onkologických diagnóz a řada nepostradatelných prognostických znaků je stanovena patology. Patolog má kromě základních histologických metod k dispozici i přístupy morfoproteomické a morfogenomické. Nedílnou součástí soudobé onkologické diagnózy je molekulární vyšetření nádoru, které může prokázat přítomnost molekuly vhodné k cílené terapii a vést k tvorbě molekulárního “pacient-specifického” znaku sloužícího ke sledování minimální reziduální nemoci.

Klíčová slova:
personalizovaná medicína, hematopatologie, diagnostika, minimální reziduální nemoc.

Moderní pojmy jako personalizovaná medicína, terapie šitá na míru, cílená terapie, prediktivní onkologie, morfoproteomika, morfogenomika a další naznačují směr vývoje medicíny v blízké budoucnosti. Dovolte, abych se na ně podíval pohledem klinického patologa („surgical pathologist“), a to patologa se zaměřením na diagnostiku hematologických malignit, zejména lymfomů, a porovnal je s možnostmi, které využívá patologie a které může svým klinickým partnerům nabídnout již dnes.

Základem racionální onkologické terapie jsou tři atributy nádorů: typing, grading a staging. Typing – stanovení typu nádoru provádí (až na zcela ojedinělé výjimky) patolog z bioptického vzorku nebo resekátu. Vychází při tom z přehledu obecně konsenzuálně přijatých typů nádorů nejčastějších v jednotlivých lokalizacích, jak jsou uvedeny v odpovídajících „Modrých knihách“ klasifikace WHO včetně jednoznačného morfologického kódu. Prostým srovnáním starších a recentních vydání je dobře patrný vývoj v posledních letech směřující k postupnému zjemňování a zpřesňování klasifikace ilustrovaný například na agresivních B-lymfomech. Ještě v klasifikaci REAL (1) z roku 1994 byl uveden difuzní velkobuněčný lymfom (DLBCL), Burkittův lymfom a jako provizorní jednotka primární mediastinální velkobuněčný B-lymfom (PMBL). Na základě nových poznatků včetně dat získaných metodou genové expresní profilace (GEP) (2, 3) zavedené na přelomu tisíciletí a v korelaci s klinickými daty je v současně platné klasifikaci WHO vydané roku 2008 (4) uvedena řada morfologicky, molekulárně i imunohistologicky definovaných variant DLBCL, ne méně než 10 samostatných typů velkobuněčného B-lymfomu, a byla potvrzena oprávněnost vyčlenění PMBL z rámce DLBCL (5). Prokázána byla existence přechodných variant, „šedé zóny“ mezi DLBCL a Burkittovým lymfomem a mezi DLBCL a Hodgkinovým lymfomem. Obdobný vývoj směřující ke zjemnění a zpřesnění diagnostiky lze pozorovat i v rámci prekurzorových B-lymfoblastických leukémií a lymfomů (B-ALL/LBL), kde se nově uvádí šest variant s totožnou morfologií a tyto jednotky jsou definované pouze na základě genetického vyšetření.

Grading vyjadřuje stupeň diferenciace nádorových buněk. Stanovuje jej opět patolog. Vychází zejména z podoby nádoru s předpokládanou výchozí tkání tumoru, ze stupně atypie nádorových buněk a z jejich proliferační aktivity posuzované obvykle počtem mitóz, ale i apoptotickou aktivitou a v některých případech na základě přítomnosti nekrotizace.

Staging odpovídá klinickému rozsahu onemocnění v době diagnózy. K údajům, které může získat patolog z resekátu případně z dalších odběrů (trepanobiopsie, gastrobiopsie a jiné), se doplňují údaje získané zobrazovacími metodami, z endoskopických vyšetření, z biochemických a dalších vyšetření. Stadium onemocnění je formalizovaně vyjádřeno u epitelových nádorů v intencích TNM stagingu (6), lymfomy se řídí modifikovanou, tzv. Ann Arbor klasifikací (7) původně vytvořenou pouze pro Hodgkinův lymfom, speciální systémy stážování jsou vytvořeny i pro další skupiny nádorů, jako jsou sarkomy apod. V případě lymfomů hraje při určení terapeutické strategie rozhodující roli tzv. Mezinárodní prognostický index (IPI) (8), případně vztažený na věk pacienta (aaIPI) korelující údaje klinické a laboratorní. Týmová spolupráce řady medicínských odborností je při stagingu nádorového onemocnění nezbytná, nicméně klíčová a nezastupitelná role patologa v onkologické diagnostice obecně je evidentní.

Patolog při své diagnostické činnosti dávno není omezen na základní histologické metody. Nejvýznamnějším pomocníkem, nepostradatelným zejména v hematoonkologické praxi, je imunohistologické vyšetření. Metoda umožňuje elegantní a relativně levnou možnost průkazu různých proteinů a jejich lokalizaci na hrubé subcelulární úrovni (pozitivita membránová, cytoplazmatická, jaderná apod.). Od zavedení metody do rutinní praxe v posledních dvou dekádách 20. století s postupným rozšířením spektra protilátek použitelných na nejdostupnějším materiálu fixovaném ve formolu a zalitém do parafinu imunohistologie prakticky zcela vytlačila elektronovou mikroskopii z běžné onkologické diagnostiky.

Průkaz jednotlivých proteinů (proteomika) v korelaci s jejich lokalizací na tkáňové i buněčné úrovni (morfoproteomika) umožňuje odhadovat s různou přesností i přítomnost změn na molekulární úrovni. Příkladem je anaplastický velkobuněčný lymfom (ALCL) ALK-pozitivní. Nejčastější molekulární změnou je reciproká translokace t(2;5) se vznikem fúzního proteinu NPM-ALK a imunohistologická pozitivita ALK se prokazuje nukleárně i cytoplazmaticky. V případě variantních změn, jako jsou t(1;2), t(2;3), inv(2), t(2;22) aj. je pozitivita ALK buď pouze cytoplazmatická, někdy granulární, pouze jaderná, anebo membránová (9).

Význam imunohistologického průkazu jednotlivých proteinů není pouze v diagnostice – typingu nádorů (např. koexprese CD20, CD5 a cyklinu D1 u lymfomu z buněk pláště apod.), ale spadá i do kategorie tzv. prediktivní onkologie (což je chybný název, jedná se samozřejmě o prediktivní patologii!). Nejznámější využití je u solidních nádorů, zejména karcinomu prsu (exprese estrogenových a progesteronových receptorů jako předpoklad léčby Tamoxifenem ad.), ale své uplatnění nachází i v hematopatologii. Revolucí v léčbě B-lymfomů bylo zavedení monoklonální protilátky rituximabu proti molekule CD20 (10). Cílená terapie existuje proti řadě dalších molekul ve formě rutinního užití (alemtuzumab proti molekule CD52) nebo ve fázi experimentů (MDX-060 proti CD30, epratuzumab proti CD22, lumiliximab proti CD23 a další) (11). Společným předpokladem jejich aplikace je znalost exprese cílové molekuly, což nejsnáze a nejlevněji prokáže právě zmíněné imunohistologické vyšetření.

Dalším příkladem prediktivní „patologie“ v hematoonkologii je rozlišení difuzních velkobuněčných B-lymfomů na subtyp z buněk charakteru zárodečných center (germinal centre, GC-like) a subtyp charakteru postgerminálních aktivovaných buněk (activated B-cell, ABC-like). Prognostický význam rozlišení byl prokázán již v prvních pracech na limitovaných sériích případů ještě v „éře před rituximabem“ (2), ale byl potvrzen i při použití kombinované imunochemoterapie (12). Problémem je, že subtypizace se provádí velmi drahou a pro rutinní použití nedostupnou metodou genové expresní profilace na tzv. mikročipech (DNA-array). Při snaze tyto nedostatky obejít bylo popsáno několik algoritmů odlišení subtypů DLBCL na základě imunohistologického vyšetření. Nejrozšířenějším je postup podle Hansové et al. (13) založený na expresi tří proteinů (CD10, BCL6 a MUM1/IRF4), který umožňuje dělit DLBCL na typ GC-like a nonGC-like s prognostickým významem srovnatelným se subtypizací získanou pomocí GEP.

Analogií imunohistologického vyšetření na tkáních je průtoková cytometrie na buněčných suspenzích buď přirozených (periferní krev, aspirát kostní dřeně, výpotek, likvor atd.), nebo získaných homogenizací nativní tkáně ze solidních nádorů (14). Obě metody mají své výhody a nevýhody, jejich současné použití přináší ve vzájemné korelaci významné posílení diagnostické jistoty, větší výtěžnost a zrychlení bioptické diagnostiky.

Nověji je diagnostické armamentárium patologie rozšířeno i o molekulární přístup. Maligní nádory obecně jsou monoklonální procesy. Průkaz klonality metodou polymerázové řetězové reakce (PCR) se využívá zejména v diferenciální diagnostice hematologických nádorů proti reaktivním procesům. B-lymfomy mají unikátní přestavbu genů pro těžké a lehké řetězce imunoglobulinů (IgH, IgK, IgL), u T-lymfomů lze prokázat přestavby genů pro řetězce T-buněčného receptoru (TCR). Detekce přestaveb genů pro imunoglobuliny a TCR je standardizovaná protokolem označovaným jako BIOMED-2 (15) s použitím sad definovaných primerů pokrývajících většinu běžně se vyskytujících přestaveb.

Kromě toho je známo, že řada tumorů je spojena s konstantní přítomností chromozomálních aberací (reciproké translokace, delece, amplifikace apod.), které jsou pro daný typ nádoru víceméně specifické: folikulární lymfom (FL) s translokací t(14;18) vedoucí k expresi antiapoptotického proteinu BCL2 (16), lymfom z buněk pláště (MCL) s t(11;14) a pozitivitou cyklinu D1 (17), anaplastický velkobuněčný lymfom s t(2;5) a jejími variantami spojenými s různě lokalizovanou expresí anaplastické lymfomové kinázy (ALK) (9) a další. K jejich průkazu lze s různým stupněm výtěžnosti použít PCR na izolovaných nukleových kyselinách anebo histologům bližší metodu in situ hybridizace (zejména fluorescenční – FISH, nebo novější modifikace nevyžadující fluorescenční mikroskop CISH a SISH) umožňující korelaci molekulárního vyšetření s morfologickým obrazem – morfogenomika.

Práce patologa s maligním nádorem ve velkém počtu případů zdaleka nekončí typizací, gradingem a stagingem vyjádřeným slovně i kódy (morfologický kód, TNM staging apod.) v diagnostickém nálezu.

Řada nádorů, a lymfomy obzvlášť, mohou po terapii přetrvávat například v kostní dřeni ve formě minimální reziduální nemoci (MRN). Podle stupně postižení a možnosti průkazu lze rozeznat různé úrovně, např. hematologickou MRN nebo molekulární MRN. Ta je vázána na průkaz molekulárními metodami, které jsou řádově citlivější než běžné metody morfologické či imunofenotypizační. Sledování přítomnosti molekulární MRN ve dřeni a její dynamiky je vynikající možností pro predikci nastupujícího relapsu onemocnění a teoreticky umožňuje časnější nasazení terapie, která eventuálně může být i méně intenzivní. Tento přístup zatím není součástí obecně přijatých terapeutických doporučení, nicméně je výzkumně ověřován, např. u MCL (18).

Ke sledování molekulární MRN je k dispozici několik přístupů. Všechny vycházejí z molekulárního vyšetření primárního nádoru, které průkazem klonální přestavby imunoreceptorových genů či specifické chromozomální přestavby určí jednoznačný marker onemocnění vhodný ke sledování a kvantifikaci MRN. Ukazuje se tak nezbytnost molekulárního vyšetření všech nově diagnostikovaných lymfomů, přestože k relevantní diagnóze lze ve více než 95 % případů dojít základním histologickým, resp. imunohistologickým vyšetřením.

Sledování MRN založené na analýze DNA se opírá zejména o přestavbu imunoreceptorových genů. Citlivost záchytu lze významně zvýšit. Metodou PCR prokázaný produkt z primárního tumoru je sekvenován a podle výsledku je navržen „pacient-specifický“ primer, který je využit pro kvantitativní sledování počtu kopií přestavěného genu ve vzorku od daného pacienta metodou RT-PCR. Vyšetřením opakovaných odběrů lze sledovat dynamiku onemocnění ve dřeni či v periferní krvi a případně včas předpovědět nastupující relaps. V případě limitovaného postižení primárního odběru či při vzácné kolizi dvou lymfomů obdobné morfologie, ale odlišné prognózy i terapeutického přístupu – např. MCL a B-CLL – lze výtěžnost izolace DNA ze vzorku zvýšit pomocí laserové mikrodisekce.

Další možností, jak sledovat MRN, je využití mRNA odpovídající tumor-specifické přestavbě genů (např. fúzní produkt NPM-ALK u ALCL) (19) nebo proteinu výlučně produkovaného tumorem. Tento přístup je velmi slibný u MCL, který v průběhu onemocnění běžně postihuje kostní dřeň a na rozdíl od ostatních dřeňových elementů i většiny hematologických nádorů silně exprimuje cyklin D1 (20, 21). Nezbytným předpokladem je opět podrobné molekulární vyšetření primárního nádoru, které najde znak vhodný ke sledování. 

Závěr

Pojem personalizovaná medicína může být pociťován jako něco nového, moderního, jako významný přelom v pojetí medicíny. Pokud chápeme personalizaci medicíny jako snahu o nalezení nejmenšího společného jmenovatele a zjemnění přístupu k pacientům až na úroveň individuální, tak se jedná o věc již dlouhodobě probíhající (jak ukázaly příklady DLBCL či B-ALL/LBL). Pokud může pojem personalizace medicíny povrchnímu pozorovateli splývat s pojmy individualizované či na míru šité terapie, také se jedná o pravdu jen zčásti. Nelze v žádném případě zapomenout na individualizovanou či na míru šitou diagnostiku a její využití zejména při sledování minimální reziduální nemoci.

Role patologa v personalizaci medicíny je nezastupitelná. Patolog je rozhodující v diagnostickém procesu, kde patologie i nadále zůstává „zlatým standardem“. Patolog jediný ovládá korelaci mezi „staršími“ čistě morfologickými metodami a „novými“ přístupy morfoproteomickými a morfogenomickými. Predikce terapeutické odpovědi molekulárním vyšetřením je logické a přirozené pokračování práce klinického patologa. Jako nezbytnost se ukazuje budování společných pracovních týmů z lékařů – patologů a přírodovědců. Diagnostický personalizovaný přístup k pacientům je tak proces vysoce náročný personálně i technicky – jinými slovy finančně. Klade na současnou patologii vysoké nároky. Bez přehánění lze současný stav označit jako největší výzvu patologii od dob Virchowa, nebo abychom zůstali v našich luzích a hájích, od dob založení Šiklovy Bioptické stanice při Spolku pro potírání zhoubných chorob, který u nás do praxe zavedl rutinní bioptickou diagnostiku nádorů. Zůstane molekulární vyšetření v rukou patologa, nebo se stane doménou subspecializovaných laboratoří? Je jen na české patologii, zda tuto výzvu přijme, nebo zda se nechá odstrčit na periferii vzrušujícího a rychle postupujícího trendu v medicíně. Současný stav a směřování patologie zejména v univerzitních centrech mne snad opravňuje k opatrnému optimismu. 

Zkratky

aaIPI          – mezinárodní prognostický index vztažený na věk pacienta

ABC           – aktivovaná B-buňka

ALCL         – anaplastický velkobuněčný lymfom

ALK           – anaplastická lymfomová kináza

B-ALL/LBL            – B-lymfoblastická leukémie a lymfom

CISH           – chromogenní in situ hybridizace

DLBCL       – difuzní velkobuněčný B-lymfom

FISH           – fluorescenční in situ hybridizace

FL              – folikulární lymfom

GC              – zárodečné centrum

GEP            – genová expresní profilace

IPI              – mezinárodní prognostický index

MCL           – lymfom z buněk pláště

MRN          – minimální reziduální nemoc

NPM          – nukleofosmin

PCR            – polymerázová řetězová reakce

PMBL        – primární mediastinální velkobuněčný B-lymfom

REAL         – revidovaná evropsko-americká klasifikace lymfomů

SISH           – in situ hybridizace se značením solemi stříbra

TCR           – T-buněčný receptor

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Vít Campr

Ústav patologie a molekulární medicíny 2. LF UK a FN Motol

V Úvalu 84, 150 06 Praha 5

fax: +420 224 435 620, e-mail: vcampr@yahoo.com