Endoskopická autofluorescencia v diagnostike nádorov hrtana

Endoscopic Autofluorescence for Diagnosis of Laryngeal Tumors

The success of laryngeal cancer treatment is influenced by many factors. In addition to decreased incidence due to improvement of public education, regimen, and the use of a functional system of patient follow-up examination, early and precise diagnosis represents the medical decisive factor.

The optical examination of larynx by means of autofluorescence has been implicated among the new methods of examination over the last years. In the ENT outpatient practice this new method of examination helps to differentiate benign lesions from the potentially malignant foci. For a surgeon dealing with ORL oncology it is important for a precise localization of the tumorous focus, which enables optimization of surgical treatment and in this way minimizes mutilation.

The endoscopic autofluorescence is a non-invasive, simple and economically undemanding examination, which can significantly improve early diagnosis of laryngeal tumors. In spite of the fact that this method requires special technical equipment, it can be executed in outpatient conditions without general anesthesia with a markedly short time for examination. The sensitivity of the examination reaches almost 100% and specificity in larynx cancer diagnosis is between 60% and 90%. There are no complications in the meaning of photosensitivity or allergic reactions.

Key words:
autofluorescence, endoscopy, diagnostics, carcinoma of larynx

Autori: V. Kavečanský; N. Lukán ¹
Pôsobisko autorov: ORL oddelenie ORL Humenné, s. r. o. primár MUDr. I. Hriseňko IV. interná klinika LF UPJŠ Košice ; prednosta prof. MUDr. I. Tkáč, Ph. D. ¹
Vyšlo v časopise: Otorinolaryngol Foniatr, 59, 2010, No. 4, pp. 225-229.
Kategória: Comprehensive Reports

Súhrn

Úspešnosť liečby rakoviny hrtana ovplyvňuje mnoho faktorov. Okrem zníženia incidencie ochorenia zlepšením osvety, životosprávy obyvateľstva a používaním funkčného systému dispenzarizácie, z profesionálneho pohľadu rozhodujúci faktor predstavuje včasná a presná diagnostika.

V posledných rokoch sa medzi novými vyšetrovacími metódami objavuje optické vyšetrenie hrtana pomocou autofluorescencie. V primárnej ambulantnej praxi pomôže táto nová vyšetrovacia metóda jednoznačne rozlíšiť benígne lézie od potencionálne malígnych ložísk. Pre chirurga zaoberajúceho sa ORL onkológiou má význam v presnom ohraničení nádorového ložiska, čo umožní optimalizáciu chirurgickej liečby, ktorá zníži mutiláciu pacienta a zlepší kvalitu jeho života.

Endoskopická autofluorescencia je neinvazívne, jednoduché a ekonomicky nenáročné vyšetrenie, ktoré môže výrazne zlepšiť včasnú diagnostiku nádorov hrtana. I napriek tomu, že metóda vyžaduje špeciálne technické vybavenie, je možné ju realizovať ambulantnou formou, bez celkovej anestézie s výrazným skrátením vyšetrovacieho času. Senzitivita vyšetrenia dosahuje takmer 100 % a špecificita pri diagnóze karcinómu hrtana sa pohybuje od 60 % do 90 %. Nepopisujú sa žiadne komplikácie v zmysle fotosenzitivity alebo alergickej reakcie.

Kľúčové slová:
autofluorescencia, endoskopia, diagnostika, karcinóm hrtana.

ÚVOD

Rozvoj diagnostických a liečebných metód za posledných päťdesiat rokov výrazne nezmenil prežívanie pacientov s rakovinou hrtana, preto sa v súčasnosti stále hľadajú modernejšie prostriedky, ktoré by túto nepriaznivú situáciu zlepšili.

Technický rozvoj spoločnosti sa postupne premieta do všetkých oblastí medicíny, otorinolaryngológiu nevynímajúc. Na mnohých klinických a výskumných pracoviskách sa zavádzajú a skúmajú nové metódy, ktoré umožnia spresniť, ale aj zjednodušiť diagnostiku zhubných nádorov ORL oblasti. Jednou z možností je aj využitie optických metód, ktoré sú neinvazívne, lacné, nenáročné na čas a minimálne zaťažujú pacienta.

Nefluorescenčné metódy

Prvé pokusy s vizualizáciou malígnych nádorov ORL oblasti pomocou Lugolovho roztoku robil Morgenroth v r. 1957 (14). Jód sfarbuje tkanivá tým, že reaguje s glykogénom. Predpokladalo sa, že v nádorovom tkanive je glykogénu menej, než v zdravom tkanive. V r. 1963 Richart (17) prezentoval prvé pokusy s toluidínovou modrou. Neskôr Sabes (18) zistil vysoké percento falošne negatívnych a falošne pozitívnych výsledkov, ktoré zabránili využitiu tejto metódy v praxi. Obidve tieto metódy sa však v praxi neujali (8, 11).

Fluorescenčné metódy

Luminiscencia je fyzikálny jav, pri ktorom teleso vyžaruje elektromagnetické žiarenie určitej vlnovej dĺžky (svetlo) a je spôsobená prechodmi vybudených elektrónov do základného stavu po excitácii. Ak je zdrojom excitácie svetlo, hovoríme o fotoluminiscencii. Fluorescencia je luminiscencia, ktorá zaniká súčasne s odstránením zdroja excitácie.

Fluorescencia je spôsobená do tkaniva dodanými látkami (napr. protoporfyrín). Leonard a Beck v r. 1971 testovali intravenóznu aplikáciu derivátov hematoporfyrínu pri diagnostikovaní nádorov ústnej dutiny, hltana a hrtana. Negatívom používania hematoporfyrínu bola niekoľkodňová fotosenzibilita a nepresné ohraničenie okraja tumoru (12).

Ďalším použitím fluorescencie v diagnostike zhubných nádorov bolo podávanie fotosenzibilizátora - kyseliny 5-aminolevulínovej (ALA) na indukciu tvorby protoporfyrínu IX (PPIX). Metódu opísal v roku 1990 Kennedy (10). Po inhalačnej aplikácii ALA dochádza v miestach postihnutých zhubným nádorom k selektívnej akumulácii PPIX. Nádorové ložiská sa vizualizujú pomocou fluorescenčnej endoskopie. Nádorom postihnuté tkanivá majú v prevahe červený fluorescenčný signál a zdravé tkanivá zelený fluorescenčný signál. Pomocou metódy je možné presnejšie stanoviť hranice nádoru a optimalizovať operačný výkon. Prínosom je schopnosť metódy identifikovať aj drobné nádorové ložiská, ktoré pri vyšetrení bielym svetlom nie sú viditeľné. Senzitivita dosahuje 99 % a špecificita sa pohybuje na hranici 60 %. Relatívnou nevýhodou tejto diagnostickej metódy je časová a finančná náročnosť, ako aj nutnosť celkovej anestézie (5, 7, 13).

Zavedenie fluorescenčných metód ovplyvnilo aj výskum v oblasti nových liečebných postupov, medzi ktoré patrí aj fotodynamická liečba. Jej podstata spočíva vo využití akumulácie porfyrínu v bunkách zhubného nádoru, kde pri ožiarení svetlom určitej vlnovej dĺžky dochádza k excitácii intracelulárne uloženého porfyrínu. Za prítomnosti kyslíka v tkanivách vznikajú kyslíkové radikály, ktoré deštruujú nádorové bunky. Metóda sa zatiaľ neujala, nakoľko má veľa vedľajších účinkov a v súčasnosti pokračujú ďalšie klinické experimenty (9, 10).

Autofluorescencia

Autofluorescencia (vnútorná tkanivová fluorescencia) je založená na interakcii rôznych fluorescenčných súčastí tkaniva, ktoré nazývame fluorofory. Alfano (1) bol prvý autor, ktorý opísal rozdiely medzi autofluorescenciou zdravého a malígneho tkaniva. Táto práca bola základom pre využitie autofluorescencie na diagnostiku nádorov na sliznici rôznych orgánov človeka.

ZÁKLADNÉ PRINCÍPY INTERAKCIE SVETLA A TKANIVA

Okrem rozloženia fluorofor v tkanive a vlnovej dĺžky excitačného žiarenia, optické vlastnosti tkaniva tvoria tretí kľúčový faktor, ktorý určuje výslednú fluorescenciu tkaniva (6). Rôzne interakcie medzi svetlom a tkanivom, ktoré je opticky zakalené médium, sú znázornené na obrázku 1.

**Obr. 1. Prechod svetla tkanivom (upravené podľa 6).**

Časť svetelného žiarenia sa po dopade na povrch tkaniva odráža zrkadlovým odrazom (asi 2 %). Po preniknutí do tkaniva dochádza k difúznemu odrazu excitačného žiarenia (50 %). Zbytok sa v tkanive absorbuje, alebo ním prechádza (transmisia). Stupeň transmisie závisí od hrúbky tkaniva a jeho optických vlastností. Časť žiarenia je pohltená melanínom, hemoglobínom a inými súčasťami tkaniva. Endogénne fluorofory absorbujú iba malú časť z celkovej absorpcie. Hĺbka prieniku elektromagnetického vlnenia stúpa s jej klesajúcou vlnovou dĺžkou. Autofluorescencia nie je závislá len od koncentrácie fluorofor, ale aj od rozloženia fluorofor v jednotlivých vrstvách tkaniva.

ZÁKLADNÉ PRINCÍPY AUTOFLUORESCENČNEJ DIAGNOSTIKY

Výskum a štúdie rozdielnych autofluorescenčných (AF) signálov z rôznych druhov tkanív nie sú ukončené. Očakáva sa, že v blízkej budúcnosti budú objasnené niektoré zákonitosti optickej spektrometrie a vlastností tkanív s následnou zmenou v interpretácii rozdielnych AF signálov.

Endogénne fluorofory sa v súčasnosti považujú za základ rozdielneho AF signálu z rôznych druhov tkanív. Sú to enzýmy respiračného reťazca (NADH, FAD) a niektoré proteíny (kolagén, elastín, keratín). Medzi endogénne fluorofory patria aj medziprodukty syntézy hemoglobínu (porfyríny), ktoré emitujú žiarenie vlnovej dĺžky zodpovedajúcej oblasti červeného svetla (635 nm). Pri excitácii adekvátnym žiarením endogénne fluorofory emitujú viditeľné fluorescenčné svetelné žiarenie (tab. 1).

**Tab. 1. Exitačné a emisné maximá endogénnych fluoroforov (6).**

Vplyv hrúbky epitelu na autofluorescenčný signál

Podľa posledných štúdií má výrazný vplyv na AF signál hrúbka epitelu. Prevažnú časť AF signálu tvorí signál zo subepitelového tkaniva. Pri výraznejšom zhrubnutí vrstvy sa svetlo pohlcuje v epiteli a nedochádza k transmisii do subepitelovej vrstvy. Pri autoflourescencii sa uvádza prienik svetla do hĺbky 300 μm (4).

Pri morfologických zmenách epitelu nedochádza k fluorescencii subepitelovej vrstvy tkaniva, podstatná časť AF signálu sa tvorí v zhrubnutej epitelovej vrstve. Zistilo sa dvojnásobné zhrubnutie epitelovej vrstvy pri dysplastických zmenách a šesťnásobné zhrubnutie pri mikroinvazívnom karcinóme (tab. 2).

**Tab. 2. Hrúbka epitelu normálnej sliznice, premalígnych a malígnych lézii sliznice horných dýchacích ciest (4).**

Táto teória vysvetľuje rôzny AF signál pri dysplastických a nádorových zmenám povrchovej epiteliovej vrstvy (obr. 2).

**Obr. 2. Vplyv hrúbky epitelu na vznik fluorescenčného emisného svetla (upravené podľa 6).**

Vplyv morfologických a vaskularizačných zmien na AF signál

AF signál ovplyvňujú keratínové povlaky na povrchu sliznice a výraznejšie prekrvenie lézie. Povlak a hyperémia spôsobuje výrazné zníženie transmisie svetla do hlbších vrstiev epitelu a subepitelového tkaniva.

Ložiská s keratínovým povrchom majú biely AF signál. Pri hyperemických ložiskách pôsobí negatívne na transmisiu svetla zvýšená koncentrácia hemoglobínu v tejto lokalite, nakoľko hemoglobín má vysokú schopnosť absorbovať svetlo (obr. 3).

**Obr. 3. Závislosť absorpcie svetla od jej vlnovej dĺžky pre rôzne súčasti tkaniva. Sivý stĺpec znázorňuje vlnovú dĺžku svetla využívanú pri autofluorescencii (upravené podľa 6).**

Endoskopická autofluorescencia a jej technické zabezpečenie

Na základe spomínaných poznatkov sa vyvinula nová diagnostická metóda, ktorá umožňuje skorú a presnú diagnostiku prekanceróz a karcinómov v počiatočnom štádiu choroby. Neodmysliteľnou súčasťou je adekvátne technické vybavenie.

Hlavným predpokladom endoskopickej autofluorescie je zdroj kvalitného svetla. Aby sa dosiahla fluorescencia, skúmané tkanivo musí byť osvietené vlnovou dĺžkou excitačného žiarenia pre dané fluorofory. Kvalitné optické káble sú nevyhnutné pre prenos veľmi slabého fluorescenčného svetla. Na zaznamenávanie emitovaného žiarenia sa využívajú kamery s vysokou citlivosťou, ktoré pomocou filtrov dokážu eliminovať vedľajšie žiarenia (spôsobené odrazom, resp. svetlom vysielaným z vlastného svetelného zdroja). V súčasnosti existujú viacerí výrobcovia, ktorí ponúkajú takéto technicky náročné prístrojové vybavenie.

KLINICKÉ VYUŽITIE ENDOSKOPICKEJ AUTOFLUORESCIE

Endoskopická autofluorescia má svoje miesto v diagnostike a dispenzarizácii prekanceróz a karcinómov v rôznych medicínskych odboroch. Oproti metódam, ktoré využívajú fluorescenciu spôsobenú dodanými látkami (napr. proporfyrínu), má autofluorescencia viacero výhod. Vyšetrenie je možné robiť ambulantnou formou, bez celkovej anestézie, s výrazným skrátením vyšetrovacieho času. Nepopisujú sa žiadne komplikácie v zmysle fotosenzitivity, ani alergickej reakcie na podané látky. Autofluorescenčný signál nie je závislý od rovnomerného rozprášenia aerosolu aplikovaného lokálne na sliznicu.

Podľa výsledkov viacerých autorov (3, 15, 19) má vysokú senzitivitu, ktorá sa blíži k 100 %. Špecificita je nižšia a podľa vyšetrovaných lokalít sa pohybuje v rozmedzí 35 – 90 %. V oblasti hrtana je senzitivita a špecificita relatívne vysoká a pohybuje sa na hornej hranici uvedených údajov.

Autofluorescencia napomáha včasnej diagnostike prekanceróz a zhubných nádorov. Podľa viacerých štúdii upresňuje a uľahčuje diagnostiku najmä mladším lekárom a lekárom, ktorí sa nestretávajú denne so zhubnými nádormi (napr. špecialisti v ambulantnej praxi) (2, 16).

AF endoskopické vyšetrenie výraznejšie farebne odlíši patologicky zmenené tkanivo a jasne určí jeho hranice, prípadne rozsah dysplastických zmien okolo už rozvinutého zhubného nádoru. Tým umožní realizovať optimálny chirurgický zákrok a dosiahnuť úplné odstránenie nádoru. Falošne negatívne výsledky sú veľmi ojedinelé a sú spôsobené keratózou, ktorá prekrýva ložiská nádorom zmeneného tkaniva, čím vytvára optické maskovanie zhubného nádoru. Klinicky sú tieto ložiská ľahko diagnostikovateľné (obr. 4).

A) Obraz zdravej sliznice hrtana (pri endoskopickom vyšetrení bielym svetlom).
B) Obraz zdravej sliznice hrtana (pri vyšetrení pomocou autofluorescencie).
C) Obraz karcinómu pravej hlasivky (pri endoskopickom vyšetrení bielym svetlom).
D) Obraz karcinómu pravej hlasivky (pri vyšetrení pomocou autofluorescencie).
(Foto Kavečanský) — Obr. 4. A) Obraz zdravej sliznice hrtana (pri endoskopickom vyšetrení bielym svetlom). B) Obraz zdravej sliznice hrtana (pri vyšetrení pomocou autofluorescencie). C) Obraz karcinómu pravej hlasivky (pri endoskopickom vyšetrení bielym svetlom). D) Obraz karcinómu pravej hlasivky (pri vyšetrení pomocou autofluorescencie). (Foto Kavečanský)

ZÁVER

Hlavným cieľom zavedenia endoskopickej autofluorescencie je využitie metódy v ambulantnej praxi otorinolaryngológov, čím sa skvalitní včasná diagnostika premaligných a malígnych lézii. Druhým, nie menej významných cieľom, je použitie endoskopickej autofluorescencie pred a počas operácie, kde použitie metódy zabezpečí presné určenie okrajov patologickej lézie a tak aj primeraný chirurgický zákrok.

Poďakovanie:
Ďakujeme vedeniu Kliniky pneumológie a ftizeológie LF UPJŠ a FNLP v Košiciach za umožnenie realizovať vyšetrenia pacientov pomocou prístrojového vybavenia endoskopického pracoviska.

MUDr. Vojtech Kavečanský
Budapeštianska 44
040 13 Košice
Slovenská republika

Zdroje

1. Alfano, R. R., Tata, D. B., Cordero, J., Tomashefsky, P., Longo, F.W., Alfano, M. A.: Laser-induced fluorescence spectroscopy from native cancerous and normal tissue. IEEE J. Quant Electron, 1984, č. 12, s. 1507-1511.

2. Arens, C., Dreyer, T., Glanz, H., Malzahn, K.: Indirect autofluorescence laryngoscopy in the diagnosis of laryngeal cancer and its precursor lesions. Eur Arch. Otorhinolaryngol, roč. 261, 2004, č. 2, s. 71-76.

3. Arens, C., Reussner, D., Woenckhaus, J., Leunig, A., Betz, C. S., Glanz, H.: Indirect fluorescence laryngoscopy in the diagnosis of precancerous and cancerous, laryngeal lesions. Eur Arch. Otorhinolaryngol, roč. 264, 2007, č. 6, s. 621-626.

4. Arens, C., Glanz, H., Woenckhaus, J., Hersemeyer, K., Kraft, M.: Histologic assessment of epithelial thickness in early laryngeal cancer or precursor lesions and its impact on endoscopic imaging. Eur Arch. Otorhinolaryngol, roč. 264, 2007, č. 6, s. 645-649.

5. Arens, C., Reussner, D., Neubacher, H., Woenckhaus, J., Glanz, H.: Spectrometric measurement in laryngeal cancer. Eur Arch. Otorhinolaryngol, roč. 263, 2006, č. 11, s. 1001-1007.

6. Betz, C. S., Arens, C., Leunig A.: Autofluorescence diagnosis of cancers of the upper aerodigestive tract. Tuttlingen, Endo-Press, 2007, 38 s.

7. Csanády, M., Kiss, J. G., Iván, L., Jóri, J., Czigner, J.: ALA (5-aminolevulinic acid)-induced protoporphyrin IX fluorescence in endoscopic diagnostic and control of pharyngo-laryngeal cancer. Eur Arch. Otorhinolaryngol, roč. 261, 2004, č. 5, s. 262-266.

8. Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J.: Toluidine blue and Lugol’s iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. J. Oral Pathol. Med., roč. 21, 1992, č. 4, s. 160-163.

9. Harris, D. M., Hill, J. H., Werkhaven, J. A., Applebaum, E. L., Lobraico, R. V., Waldow, S. M.: Porphyrin fluorescence and photosensitization in head and neck cancer. Arch. Otolaryngol Head Neck Surg., roč. 112, 1986, č. 11, s. 1194-1199.

10. Kennedy, J. C., Pottier, R. H., Pross, D. C.: Photodynamic therapy with endogenous protoporphyrin IX: basic principles and present clinical experience. J. Photochem Photobiol B, roč. 6, 1990, č. 1-2, s. 143-148.

11. Kurita, H., Kurashina, K.: Vital staining with iodine solution in delineating the border of oral dysplastic lesions. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., roč. 81, 1996, č. 3, s. 275-280.

12. Leonard, J., Beck, W.: Hematoporphyrin fluorescence: an aid in diagnosis of malignant neoplasmas. Laryngoscope, roč. 81, 1971, č. 3, s. 365-372.

13. Mehlmann, M., Betz, C. S., Stepp, H., Arbogast, S., Baumgartner, R., Grevers, G., Leunig, A.: Fluorescence staining of laryngeal neoplasms after topical application of 5-aminolevulinic acid: preliminary results. Lasers Surg. Med., roč. 25, 1999, č. 5, s. 414-420.

14. Morgenroth, K.: Neue Untersuchungen mit dem Kolposkop nach Hinselmann und der Vitalfärbung der Mundschleimhaut zur Fruhdiagnose von Tumoren im Kieferbereich. Dtsch Zahnaerztl Z 2, roč. 12, 1957, č. 3, s. 192-201.

15. Mostafa, B. E., Shafik, A. G., Fawaz, S.: The role of flexible autofluorescence laryngoscopy in the diagnosis of malignant lesions of the larynx. Acta Otolaryngol, roč. 127, 2007, č. 2, s. 175-179.

16. Paczona, R., Temam, S., Janot, F., Marandas, P., Luboinski, B.: Autofluorescence videoendoscopy for photodiagnosis of head and neck carcinoma. Eur Arch. Otorhinolaryngol, roč. 260, 2003, č. 10, s. 544-548.

17. Richart, R. M.: A clinical staining test for the in vivo delineation of dysplasia and carcinoma-in-situ. Am. J. Obstet. Gynecol., roč. 86, 1963, č. 1, s. 703-712.

18. Sabes, W. R., Singer, R. E., Kuhn, T.: Effectiveness of toluidine blue as an aid to biopsy in the diagnosis of DMBA-induced hamster pouch dysplasia and carcinoma. Cancer, roč. 29, 1972, č. 6, s. 1584-1589.

19. Zargi, M., Smid, L., Fajdiga, I., Bubnic, B., Lenarcic, J., Oblak, P.: Detection and localization of early laryngeal cancer with laser-induced fluorescence: preliminary report. Eur Arch. Otorhinolaryngol, roč. 254, 1997, Suppl 1, s. 113-116.