Dynamika změn sérového visfatinu po abdominálním chirurgickém výkonu: nový proinflamační marker v časné diagnostice?

Súhrn

Východisko.
Visfatin je adipocytokin produkovaný především viscerální tukovou tkání. Vedle účinku na inzulinový receptor je i proinflamačním cytokinem, jehož hladina se může měnit při zánětlivých procesech. Cílem této studie bylo zjistit, jak se mění sérové koncentrace visfatinu v časném údobí po abdominálním chirurgickém výkonu v korelaci s dalšími proinflamačními cytokiny.

Metodika a výsledky.
Do prospektivní průřezové (cross-sectional) studie bylo zařazeno 20 pacientů, kteří podstoupili elektivní laparotomickou resekci části tlustého střeva. Sledovali jsme hladiny visfatinu, leptinu, rezistinu, adiponektinu, TNF-α, IL-6 a CRP a srovnávali dynamiku změn jednotlivých parametrů za +12, +24, +48 a +72 hodin. Sérové koncentrace visfatinu kulminovaly již za 24 hodin po chirurgickém výkonu a po 72 hodinách se vracely k normě. TNF-α a IL-6 měly maximum o 12–24 hodin později a u CRP hodnoty stoupaly s maximem za 72 hodin.

Závěry.
V časném pooperačním údobí po abdominálním chirurgickém výkonu byly zachyceny signifikantně zvýšené hladiny sérového visfatinu, které předcházely zvýšení hodnot jiných proinflamačních markerů TNF-α, IL-6 a CRP. Visfatin by proto svojí dynamikou mohl být časným prediktorem rozvoje zánětlivých změn operovaných nemocných především s viscerální obezitou.

Klíčová slova:
visfatin – abdominální chirurgie – proinflamační cytokiny – viscerální obezita

ÚVOD

Visfatin je nedávno podrobněji popsaný adipocytokin produkovaný především viscerální tukovou tkání (1). K jeho metabolickým účinkům patří ovlivnění účinnosti inzulinu vazbou na inzulinový receptor na odlišném místě než inzulin. Visfatin byl původně popsán jako růstový faktor proliferace B-buněk, tzv. pre-B cell colony enhancing factor (PBEF) v lymfocytech. PBEF byl následně objeven jako ubikviterní cytokin přítomný v řadě buněk a tkání, jako jsou neutrofilní leukocyty, tkáň jater, srdce a svalu (2–5).

Byl zmíněn v roce 2005 Fukuharou et al. (6) jakožto faktor s inzulino-mimetickým efektem. Jeho hladiny korelují s adiponektinem a ovlivňují inzulinovou rezistenci. V experimentálních studiích byl zvýšen při hyperglykémii a naopak snížen při podání inzulinu a somatostatinu. Má přímou vazbu k dostupnosti nutrientu a buněčné bioenergetice. Novější studie přisuzují visfatinu roli enzymu zodpovědného za intra- i extracelulární NAD biosyntézu. Visfatin zasahuje i do glukózové homeostázy a má významný antidiabetický efekt, který moduluje i funkci B-buněk. Zajímavé jsou i nálezy prokazující změny visfatinu po tělesném cvičení: Krátkodobé zvýšení bezprostředně po cvičebním tréninku a dlouhodobé snížení při pravidelném dlouhodobém cvičení nepochybně souvisejí s hladinami glukózy a inzulinu. Hladina visfatinu může být také ovlivněna změnou tělesné hmotnosti, tedy úbytkem tukové tkáně. Visfatin stimuluje také expresi IL-6 a IL-8 a je spojen s parametry oxidativního stresu.

Visfatin je významně obsažen v tukové tkáni, predominantně v tuku viscerálním. Z tohoto aspektu je úzce svázán s viscerální obezitou. Byl prokázán vztah mezi obezitou, hladinou visfatinu v séru a jeho mRNA expresí, podobně jako mezi visfatinem a BMI (7). Zatímco vztah k viscerální obezitě byl v této studii potvrzen, u subkutánního tuku tomu tak nebylo. Zvýšená hladina cirkulujícího visfatinu byla prokázána i u nemocných s metabolickým syndromem.

Tuková tkáň je složena z tukových buněk (zralých adipocytů) a z buněk stromatu zahrnujících makrofágy, lymfocyty, endotelové buňky a preadipocyty. Všechny tyto buňky mají velmi aktivní endokrinní (parakrinní i autokrinní) aktivitu a podílejí se na regulaci energetické homeostázy a na remodelaci tkání (8, 9).

Obezita je spojena se změnami v produkci adipocytokinů. Z tzv. klasických adipocytokinů plazmatická koncentrace leptinu koreluje s BMI a dalšími indikátory tělesného složení (10). Naproti tomu, adiponektin je u obezity snížen. Resistin může zase významně ovlivnit inzulinovou rezistenci (11).

Je tedy zřejmé, že se tuková tkáň může významně podílet na metabolické a imunitní odpovědi organismu na zátěž.

V recentních studiích bylo ukázáno, že visfatin má též významný vztah k imunitním procesům a je významným proinflamačním cytokinem u řady zánětlivých procesů (např. akutní záněty plic či sepse) (12–14). Adiponektin má v tomto směru antagonistické účinky. Zvýšené hladiny visfatinu korelovaly i s dalšími prozánětlivými cytokiny jako je IL-1, IL-6 a TNF-α.

Visfatin byl také sledován u chirurgických nemocných. U pacientů s cholecystolitiázou a následnou cholecystektomii byl v dlouhodobém sledování (1 rok po operačním výkonu) zvýšen (15). U nemocných s poklesem BMI a též množstvím tukové tkáně se hladiny visfatinu snížily. Po restrikčních operacích žaludku byly hodnoty visfatinu závislé na změně tělesné hmotnosti, v časném údobí 4 týdnů po výkonu klesly a následně na konci sledovaného jednoročního sledování se opět zvýšily. Korelovaly s hladinou IL-6 a plazmatickou koncentrací inzulinu (16). Naproti tomu v prospektivní studii 27 morbidně obézních žen (BMI nad 40 kg/m²) sledovaných 1 rok po biliopankreatickém diverzním výkonu nebyla změna visfatinu přes signifikantní pokles BMI (ze 46,1 ± 13,1 na 35,1 ± 5,7 kg/m²) prokázána (17).

Ve studii analyzující 200 000 úmrtí na sepsi v USA bylo ukázáno, že visfatin se signifikantně zvyšuje u pacientů se sepsí a koreluje významně s koeficientem rizika úmrtí (18). Tyto závěry byly potvrzeny i v experimentálních studiích (19) se zjištěním, že IL-6 byl regulátorem genu pro visfatin ve 3T3-L1 adipocytech.

Problematice časné diagnostiky zánětlivých změn v perioperačním údobí je věnována pozornost i v českém písemnictví. Monitorace prozánětlivých cytokinů může zásadním způsobem ovlivnit osud nemocných v časné diagnostice po-operační nitrobřišní sepse (20). Dle dynamiky změn cytokinů můžeme sledovat rovnováhu mezi prozánětlivými cytokiny a dalšími regulačními mechanismy rozhodujícími o vzniku a rozvoji zánětlivého procesu, zvláště pak u rizikových nemocných (21, 22). Z tohoto aspektu je přínosná studie věnující se adipocytokinu leptinu, který se jeví v perioperačním údobí jako velmi časný marker pooperačního stresu (23).

V naší předchozí studii (24) jsme sledovali vybrané proinflamační cytokiny tukové tkáně před a po elektivním chirurgickém výkonu (laparoskopická cholecystektomie) u nemocných s různým stupněm snížení renální funkce a obezitou. Zjistili jsme signifikantní zvýšení hladin proinflamačních adipocytokinů a zvýšenou infiltraci imunokompetentních buněk u nemocných s obezitou (BMI nad30 kg/m²) ve srovnání s nemocnými neobézními.

Snížená hladina visfatinu byla zjištěna i u neobézních nemocných po transplantaci ledviny (25).

V současné studii jsme testovali hypotézu, zda a jak se sérové koncentrace visfatinu mění v časném perioperačním údobí v závislosti na možném rozvoji infekce (proinflamační marker), a to v dynamickém časovém perioperačním monitoringu 0–12–24–48 a 72 hodin, a zda se jeho dynamika liší od dalších již užívaných proinflamačních cytokinů. Současně jsme sledovali, zda se jeho hodnoty liší v závislosti na množství tukové tkáně v předoperačním údobí. Všichni sledovaní nemocní se podrobili elektivními nitrobřišnímu výkonu (resekce části kolon). Abdominální elektivní laparotomický výkon byl vybrán jako model neinfekční zánětlivé stimulace cytokinové kaskády, které dle některých nálezů může hrát významnou roli v aktivaci tvorby visfatinu.

SOUBOR NEMOCNÝCH A POUŽITÉ METODY

Studie byla uskutečněna v souladu s Helsinskou deklarací včetně aktuální verze správné klinické praxe. Zvolené léčebné postupy respektovaly institucionální předpisy. Všichni nemocní byli podrobně informováni a dali písemný informovaný souhlas před zařazením do studie. Studie se uskutečnila na chirurgické klinice 3. LF UK od 1. 1. 2010 do30. 9. 2012 a laboratorní vyšetření proběhla na Klinice nefrologie Transplantacentra IKEM a v Revmatologickém ústavu 1. LF UK a VFN.

Do prospektivní průřezové (cross-sectional) studie bylo zařazeno 20 pacientů, kteří podstoupili elektivní laparotomickou resekci části tlustého střeva. Z tohoto souboru celkem 10 nemocných mělo před operací závažnou obezitu (BMI nad 30 kg/m², skupina I). Dalších 10 pacientů mělo BMI nižší než 30 kg/m², skupina II. Z hlediska přidružených onemocnění čtyři nemocní ve skupině I měli diabetes mellitus (DM) 2. typu, ve skupině II to byli tři nemocní. Léčba DM byla formou standardních perorálních antidiabetik a režimových opatření. V obou skupinách bylo vždy pět nemocných s léčenou kompenzovanou systolicko-diastolickou hypertenzí. Nebyli zařazení pacienti, u kterých byly přítomny chirurgické operační a pooperační komplikace. Všichni pacienti měli provedeno základní antropometrické vyšetření den před operačním výkonem a byla vypočtena hodnota BMI. Krevní vzorky pro biochemickou analýzu byly odebrány v rámci předoperačního vyšetření a následně za 12, 24, 48 a 72 hodin po ukončení operačního výkonu. Sérum bylo získáno centrifugací a vzorky uloženy při teplotě –20°C a následně –70°C pro další analýzu.

Sérový visfatin byl stanoven metodou enzymatické imunoeseje (ELISA) dle protokolu Bio Vision Research Products, Mountain View, CA, USA. Adiponektin v séru, byl měřen komerčním ELISA kitem (Bio Vendor, Brno, Česká republika, Linco Research, St Charles, MI, USA). Sérové koncentrace IL-6 a TNF-α byly určeny s použitím adipokinového LINCOplex kitu pro lidské sérum (Luminex 200 instrument Linco Research) a sérové koncentrace C-reaktivního proteinu (CRP) dle ultrasenzitivní metody CRP ELISA kit (DSL, Oxon, UK). Další standardní biochemické parametry byly stanoveny na přístroji Olympus Diagnostica GbmH, Hamburk, SRN. Sérový inzulin byl měřen pomocí RIA (Cis Bio Int, Lyon, Francie) glykovaný hemoglobin (HbA1c) pomocí kapalinové chromatografie na Tosohi HLC-723 G7 (Shiba, Minato-ku, Tokio, Japonsko).

Statistická analýza

Pro statistickou analýzu byl použit software Sigmastat (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Párový t-test a dvouvýběrový t-test byly použity pro porovnání výsledků u obou skupin pacientů. Výsledky byly považovány za statisticky významné při p < 0,05.

VÝSLEDKY

Základní klinické a laboratorní parametry obou skupin pacientů před břišním chirurgickým výkonem jsou uvedeny v tabulce 1. Skupiny se nelišily v parametrech věku a pohlaví, v hodnotách sérového kreatininu, cholesterolu a diastolického TK. Lehce zvýšené, leč signifikantní rozdíly (p < 0,05) byly zachyceny v hodnotách systolického TK, glykémie na lačno a inzulinu. Významnější signifikantní rozdíly(p < 0,02) byly v hodnotách HbA1c a triglyceridů. Tyto nálezy mohou souviset se signifikantním rozdílem BMI (p < 0,02) v obou skupinách (31,2 ± 4,2 vs. 27,3 ± 3,3 kg/m²).

Sérové hladiny vybraných adipocytokinů (visfatin, leptin, rezistin, adiponektin) a dalších proinflamačních cytokinů (TNF-α ,IL-6 a CRP) v předoperačním údobí jsou v tabulce 2. S výjimkou hodnot adiponektinu (vyšší hodnoty ve skupině II) a IL-6 (vyšší hodnoty ve skupině I), u oboup < 0,05, nebyly zjištěny signifikantní rozdíly v předoperačních hodnotách uvedených cytokinů.

Tabulka 3 uvádí průměrné hodnoty a směrodatné odchylky vybraných adipocytokinů a proinflamačních cytokinů v perioperačním údobí (0 h, +12 h, +24 h, +48 h a +72 hodin po operačním výkonu) v obou sledovaných souborech. Současně hodnotí i dynamiku změn jednotlivých parametrů vzhledem k výchozí hodnotě před operací. Z tabulky je zřejmé, že visfatin dynamicky signifikantně roste již v časném perioperačním údobí (od +12 h), více ve skupině I, a že mezi oběma skupinami jsou signifikantní rozdíly (p < 0,02). Maxima hodnot je dosaženo v obou skupinách v periodách +24 h (p < 0,01), ale opět jsou mezi skupinami rozdíly (p < 0,01). Pozvolný pokles nastává v periodě +48 h (p < 0,01) s dalším snížením v periodě +72 h. Zůstávají však trvale signifikantní rozdíly v hodnotách obou skupin (p < 0,02) při vyšších hodnotách ve skupině I.

Analogický trend perioperačních změn sérových hladin byl zachycen u leptinu (maximum vzestupu v periodách +24 h). I zde byly signifikantní změny obou skupin a vyšší hodnoty ve skupině I. Naproti tomu, dynamika změn hladin adiponektinu měla obrácený trend: Nejvyšší hodnoty byly zachyceny v obou skupinách před operačním výkonem s dynamicky signifikantním poklesem od periody +24 h (p < 0,02). Byly zachyceny signifikantní rozdíly obou skupin s nejnižšími hodnotami ve skupině I. Hladina adiponektinu měla negativní korelaci k proinflamačním cytokinům TNF-α a IL-6. Hladina TNF-α byla nejvyšší v periodách +24 h, zatímco IL-6 v periodě +48 h. Sérová koncentrace CRP stoupala postupně s maximem v periodách +72 hodin. Zatímco u cytokinů TNF-α a IL-6 byly zaznamenány signifikantní rozdíly mezi skupinami I a II, tento rozdíl nebyl patrný při stanovení CRP, jehož hodnoty nebyly rozdílné s ohledem na BMI.

Graf 1 zachycuje dynamiku změn sérové koncentrace visfatinu v obou skupinách s maximem v periodách +24 h. Analogický trend je zachycen v grafu 2, který zachycuje dynamiku změn u leptinu. Také zde je maximum nárůstu v periodách +24 h, i když statistická signifikance rozdílu mezi skupinami je nižší (p < 0,01 vs. p < 0,02). Rozdílná dynamika změn těchto adipocytokinů a tzv. klasických proinflamačních cytokinů TNF-α a IL-6 je zřejmá z grafů 3 a 4. Oba cytokiny, především však IL-6, mají maximum nárůstu posunuto do pozdějších časových period, především +48 h u IL-6. Tyto zvýšené hodnoty déle přetrvávají, a to i v periodách +72 h. Jinou dynamiku změn má typický marker bakteriální infekce CRP. Graf 5 zachycuje s časem narůstající hodnoty a to souběžné v obou skupinách, bez rozdílu v BMI. Maximum hodnoty je dosaženo v poslední měřené period +72 h.

Při srovnání dynamiky změn visfatinu s ostatními sledovanými prozánětlivými cytokiny byl nejvyšší regresní koeficient u leptinu v periodě +24 h (r = 0,45, p < 0,02), zatímco pro další zánětlivé markéry (TNF-α, IL-6) byly korelace méně signifikantní (r = 0,32, resp. r = 0,20, p < 0,05). Vztah k CRP nebyl v naší studii signifikantní stejně jako k adiponektinu.

DISKUZE

Odpověď organismu na operační zátěž je charakterizována celou škálou zánětlivých, hormonálních a metabolických změn, které v souhrnu vytvářejí obraz reakce akutní fáze (5). Stresový podnět operace indukující uvolňování řady hormonů (ACTH, kortizol, ADH atd.) a prozánětlivých cytokinů (např. TNF-α a IL-6) stimuluje systém tvorby proteinů akutní fáze v játrech, svalový katabolismus, termogenezi a další četné metabolické, psychické a imunologické odpovědi (22).

Iniciace, průběh a prognóza systémové zánětlivé odpovědi na chirurgický výkon tak závisí na interakci prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů a dalších solubilních a membránových mediátorů. Tuková tkáň představuje důležitý endokrinní orgán produkující řadu hormonů a cytokinů včetně prozánětlivých (např. i TNF-α a IL-6). Produkce proinflamačních cytokinů je obecně u obézních pacientů vyšší, což může významně zasahovat i do metabolismu inzulinu (inzulinová rezistence). Experimentální i klinické studie prokazují, že tuková tkáň je infiltrována imunokompetentními buňkami, které jsou významnými producenty proinflamačních cytokinů.

Visfatin (24) je relativně novým adipocytokinem, který má kromě vlivu v energetickém metabolismu svoji roli v přirozené imunitě a zánětu. V posledních několika letech byl prokázán jeho prozánětlivý až tkáně destruující účinek (14). Představuje z tohoto aspektu adipocytokin akutní fáze. V naší studii byly současně vyšetřeny i další adipocytokiny (leptin, resistin, adiponektin) a klasické prozánětlivé cytokiny (TNF-α, IL-6 a CRP). Časový horizont sledování (0 h, +12 h, +24 h, +48 h, +72 h) odpovídá dynamice exprese cytokinů v časném pooperačním údobí. Vyšetření zánětlivých klinických a laboratorních parametrů v předoperačním údobí prokázalo pouze marginální rozdíly v obou souborech – vyšší hodnoty glykémie na lačno, hladiny inzulinu, triglyceridů a systolického TK ve skupině I s BMI 31,2 ± 4,2 kg/m², p < 0,05. Tento nález nepochybně souvisí s přítomností většího množství viscerálního tuku a přítomnou inzulinorezistencí. S vyšším zastoupením tukové tkáně zřejmě souvisejí i nevelké, leč signifikantně vyšší hodnoty IL-6, a snížení adiponektinu ve skupině I v předoperačním údobí.

V časném postoperačním údobí se rychle zvyšuje hladina visfatinu, která dosahuje trojnásobného zvýšení za 24 hodin (p < 0,01). Toto zvyšování je zachyceno již za 12 hodin (p < 0,02), naopak postupné snížení nastupuje za 48 hodin (p < 0,02) a je následováno návratem k nesignifikantním hodnotám zvýšení za 72 hodin. Během celého sledování byly zachyceny signifikantní rozdíly mezi oběma soubory s tím, že skupina II s BMI 27,3 ± 3,3 kg/m² měla ve všech časových periodách hodnoty visfatinu nižší, jak zachycuje graf 1. Analogickou dynamiku změn jsme zjistili při monitoraci hladin leptinu, který také dosahoval maxima hodnot již 24 hodin po operačním výkonu (šestinásobné zvýšení v souboru I a čtyřnásobné zvýšení v souboru II) (graf 2). V případě visfatinu zatím nejsou relevantní experimentální a klinická data týkající se bezprostředně operačního výkonu. U leptinu bylo ukázáno (23), že v časném pooperačním údobí chirurgický stres vede k přechodné elevaci leptinu a jeho hladina dále koreluje s hladinami prozánětlivých cytokinů IL-6 a TNF-α, i když s časnějším nástupem změn. Protože v naší studii byla zachycena časově analogická dynamika změn visfatinu a leptinu a mezi oběma veličinami byla zachycena pozitivní signifikantní korelace (r = 0,43, p < 0,02) je možná časově i kvantitativně analogická exprese obou adipocytokinů tukové tkáně v časném perioperačním údobí. Současně jsme potvrdili perioperační zvýšení proinflamačních cytokinů TNF-α a IL-6 s maximem změn v časově pozdějším údobí. Hodnota CRP měla výrazně pozdější dynamiku a relativně vysoké hodnoty přetrvávaly i po ukončení studie. Hladina „ochranného” adiponektinu byla nejvyšší před započetím operačního stresu a následně se snižovala s hraničními signifikantními rozdíly mezi skupinami.

Uvedené nálezy dynamiky dvou sledovaných adipocytokinů (časné zvýšení) jsou velmi významné, neboť u „klasických“ prozánětlivých cytokinů docházelo ke zvýšení hodnot později a nebyly rozdíly v zánětlivé odpovědi související s množstvím tukové tkáně. Monitorace sérového visfatinu by tedy mohla být časným markerem zánětlivých změn v perioperačním údobí indikujícím i zvýšené riziko exprimace zánětlivých cytokinů v souvislosti s přítomnou viscerální tukovou tkání (na rozdíl od leptinu je visfatin exprimován prakticky pouze viscerální tukovou tkání). Při výskytu zánětlivých komplikací by diagnostika pomocí CRP byla až o 48 hodin opožděna oproti možnostem časné diagnostiky s využitím vybraných adipocytokinů, především visfatinu. Dosud však není jasné, jaká je jeho predikční váha v dlouhodobější zánětlivé odpovědi.

Studie má též svoje limity dané především malým počtem pacientů. Také nebylo provedeno přesnější antropometrické vyšetření k predikci množství viscerálního tuku (hodnota BMI je z toho aspektu velmi nepřesná). Určitým limitem může být i před-, eventuálně pooperační léčba diabetu či hyperglykémií, neboť inzulin i visfatin mají stejný receptor, a tedy inzulin může visfatin přímo ovlivnit (maximální krátkodobě podané dávky inzulinu však ve studii nepřekročily 20 jednotek/den).

ZÁVĚR

V časném postoperačním údobí po abdominálním chirurgickém výkonu byly zachyceny signifikantně zvýšené hladiny adipocytokinu visfatinu, které korelovaly s hladinou leptinu a jejichž hladiny byly vyšší v souboru nemocných s vyšším BMI (viscerální obezitou). Postupný pokles následoval po 24 hodinách. Pooperační zvýšení klasických prozánětlivých cytokinů (TNF-α a IL-6) bylo časově o 24–48 hodin opožděno. U hodnoty CRP byla dynamika zvyšování postupná s přetrvávajícím zvýšením i při posledním vyšetření za 72 hodin, a to bez signifikantního rozdílu hodnot v obou souborech.

Visfatin by svojí dynamikou mohl být významným prediktorem časných zánětlivých změn u nemocných po abdominálním chirurgickém výkonu, především s viscerální obezitou.

Zkratky

ACTH adenokortikotropní hormon

ADH antidiuretický hormon

BMI body mass index

CRP C-reaktivní protein

DM diabetes mellitus

HbA1c glykovaný hemoglobin

IL-6 interleukin 6

IL-8 interleukin 8

IL-10 interleukin 10

NAD nikotinamid adenin dinukleotid

PBEF faktor proliferace B-buněk (tzv. pre-B cell colony enhancing factor)

TNF-α tumor nekrotizující faktor alfa

Podpořeno projektem (Ministerstva zdravotnictví) rozvoje výzkumné organizace 00023001 (IKEM) – Institucionální podpora.

ADRESA PRO KORESPONDENCI:

MUDr. Vladimír Teplan

Chirurgická klinika 3. LF UK a FNKV

Šrobárova 50, 100 00 Praha 10

e-mail: vteplan@gmail.com