Vyhledávání genetických variant u trombofilních stavů

Súhrn

Trombofilní stavy představují vrozenou nebo získanou predispozici vzniku trombózy v cévním řečišti. Mezi rutinně vyšetřované vrozené trombofilie patří v populaci vysoce frekventní leidenská mutace a mutace v genu protrombinu G20210A. Vrozený deficit antikoagulačních proteinů (proteinu S, proteinu C a antitrombinu III) patří mezi vzácné trombofilie s nižší populační frekvencí, ale vyšším relativním rizikem tromboembolické příhody a je způsobený mutacemi v genech kódujících tyto proteiny.

Postup molekulárně genetické analýzy závisí na skutečnosti, zda se jedná o vyhledávání známé, nebo neznámé, případně vzácné varianty. U známých kauzálních variant FV Leiden a protrombinu G20210A využíváme k jejich zachycení běžně metody PCR-RFLP, reverzní Strip Assay^®, alelově-specifickou PCR, TaqMan real-time PCR a SNaPshot^®. Genetickému testování vzácných variant v antikoagulačních proteinech předchází precizní selekce pacientů. Vhodné je využití metodiky masivního paralelního sekvenování doplněné vyhledáváním větších genových přestaveb metodou MLPA. Tento postup je úspěšně aplikován na našem pracovišti a ve srovnání s běžně užívanou Sangerovou sekvenační metodou nabízí rychlejší odezvu a větší analytickou kapacitu.

Klíčová slova:

trombofilie – FV Leiden – protrombin G20210A – deficit proteinu S – deficit proteinu C – deficit antitrombinu III – molekulárně genetické vyšetření

ÚVOD

Podstatou tromboembolického onemocnění je nežádoucí tvorba trombu (krevní sraženiny) v cévním řečišti, kde vzniká obstrukce. Výskyt trombózy je obvykle lokalizován do oblasti hlubokých žil dolních končetin. Závažný problém může nastat, když se uvolněná krevní sraženina – embolus – dostane do arteria pulmonaris nebo jedné z jejích větví, kde obstrukcí způsobí plicní embolii, jež může mít pro pacienta fatální následky.

Trombóza je běžným patologickým stavem, který je základem ischemické choroby srdeční, ischemické cévní mozkové příhody a žilního tromboembolismu. Na následky této skupiny onemocnění zemřelo v roce 2010 na světě 12,9 milionu lidí, což odpovídá každému čtvrtému úmrtí (1).

Nástup tromboembolického stavu má multifaktoriální podstatu, přičemž dědičná komponenta je stanovena až na 60 % (u selektovaných pacientů do 45 let a manifestací tromboembolické nemoci) (2). Trombózu mohou indukovat vnější faktory, mezi něž řadíme operační zákroky, imobilizace, těhotenství, užívání orálních kontraceptiv, věk a nádorová onemocnění.

Vrozené trombofilie jsou hyperkoagulační stavy, které jsou geneticky podmíněným sklonem k trombóze. Mezi genetické faktory zvyšující riziko nástupu trombózy jsou řazeny jednonukleotidové polymorfismy (SNP) faktoru V (FV) Leiden a FII protrombin G20210A, které v populaci vykazují vysokou incidenci.

Mezi vrozené trombofilie řadíme také klinicky závažné deficity proteinu S (PSD), proteinu C (PCD) a antitrombinu III (ATD). Tyto deficience mohou mít vrozenou příčinu ve formě vzácných mutací příslušných genů PROS1, PROC a SERPINC1, které tyto proteiny kódují (3–7). Mutace v těchto genech nevykazují takovou prevalenci v populaci jako varianty FV Leiden a FII protrombin, ale predisponují svého nositele ke stejnému či vyššímu riziku vzniku tromboembolické události.

Pro vyhledávání trombofilních mutací se používají techniky určené k vyhledávání známých polymorfismů nebo vzácné varianty s neznámým místem výskytu uvnitř suspektního genu.

Celá problematika je klinicky významná z důvodu včasné profylaxe nositelů trombofilních mutací zejména v rizikových situacích (8, 9). Objasnění molekulárně genetické příčiny onemocnění u probanda může vést ke stanovení vhodné prevence žilní trombózy (VTE) v rodině s výskytem vrozené trombofilie.

ETIOLOGIE A RIZIKOVÉ FAKTORY VROZENÝCH TROMBOFILIÍ

Faktor V Leiden

Rezistence FV proti inaktivaci aktivovaným proteinem C (APC) je hlavní vrozenou příčinou trombózy. Je způsobená bodovou mutací FV Leiden v genu pro FV, která vede k záměně aminokyseliny arginin v pozici 506 za aminokyselinu glutamin (3). Tato změna vede ke ztrátě místa štěpení a snížení citlivosti na APC. Polymorfismus FV Leiden způsobuje nárůst rizika VTE v důsledku zvýšení tvorby trombinu (3, 10).

V případě heterozygozity pro FV Leiden je riziko trombózy 2–8× vyšší oproti běžné populaci. Mutace v homozygotním stavu představuji 80× vyšší riziko vzniku VTE (11, 12). U bílé populace se frekvence varianty FV Leiden pohybuje mezi 2 a 15 % (13, 14).

Protrombin G20210A

Druhou nejčastější příčinou tromboembolické nemoci je mutace genu protrombinu G20210A. Její podstatou je nukleotidová tranzice guanin za adenin na pozici 20210, která se nachází ve 3´ nepřepisované oblasti genu F2, který kóduje protrombin. Mutace nevede ke změně struktury molekuly, ale ke zvýšení hladiny protrombinu v krevní plazmě (3).

Přítomnost varianty protrombinu G20210A znamená pro pacienta až 3,8× vyšší celoživotní riziko nástupu VTE oproti v obecné populaci (12, 15, 16). Prevalence této varianty se u bělošské populace pohybuje mezi 2 a 3 % (14, 17).

Protein S (PS)

Jedná se o vitamin K-dependentní plazmatický protein, který je kódovaný genem PROS1 a nejčastěji je exprimován v játrech a srdci. Nachází se v chromosomové oblasti 3q11.1.

V lidském těle se vyskytuje ze 40 % jako volný (schopný vytvořit aktivní komplex s proteinem C) a ze 60 % vázaný na β-řetězec C4b vazebného proteinu (18). Jeho hlavní biologická funkce je kofaktorová, nejedná se o serinovou proteázu. Působí jako enhancer pro APC při štěpení FV. Protein S má také na APC nezávislou antikoagulační úlohu, kdy přímo inhibuje protrombinázový a pravděpodobně také Xázové komplexy. PS pravděpodobně neváže pouze fosfolipidy s vysokou afinitou, ale také prokoagulační faktory Va, Xa a VIIIa. Limitace těchto vazebných míst na fosfolipidové membráně v úvodu koagulace naznačují, že tyto vazby s PS představují jeho APC nezávislou antikoagulační aktivitu (5).

Vrozený PSD je považován za autosomálně dominantní onemocnění s redukovanou penetrancí a variabilními expresivitou. PSD vykazuje v evropské populaci frekvenci 0,5 % (5). Riziko tromboembolické příhody pro pacienty s PSD je dle různých autorů 5,4–10× vyšší než u běžné populace (5, 12, 19). V současné době je známo 420 kauzálních mutací u vrozeného PSD (viz www.hgmd.cf.ac.uk).

Pro molekulárně genetickou analýzu je značnou komplikací přítomnost pseudogenu PROS2, který je netranskribovaným homologem genu PROS1 (4).

Protein C

Tento vitamin K-dependentní plazmatický protein je kódován genem PROC, jeho syntéza probíhá především v játrech a minoritně také v ledvinách. Nalézá se v chromosomové oblasti 2q14.3.

V plazmě se vyskytuje jako inaktivní serinová proteáza, která je aktivována na svém endotelovém receptoru na APC jako odpověď na zvýšenou koncentraci trombinu. Primární úlohou APC je inaktivace koagulačních faktorů Va a VIIIa. Jeho antikoagulační aktivita je zvýšena PS a FV. APC působí prostřednictvím štěpení – inaktivací aktivovaných prokoagulačních faktorů V a VIII (20, 21).

Incidence klinicky významného PCD v populaci je odhadována na 1 : 20 000 (20). Vrozený PCD je považován za autosomálně dominantní onemocnění, které může být doprovázeno závažnými stavy v novorozeneckém období v případě homozygozity či složené heterozygozity (21). Riziko tromboembolické příhody pro pacienty s PCD je dle různých autorů 7–10× vyšší než u běžné populace (12, 19). V současné době je známo 391 kauzálních mutací u vrozeného PCD (viz www.hgmd.cf.ac.uk).

Antitrombin III

Plazmatický protein je kódován genem SERPINC1, který se nachází v chromosomové oblasti 1q25.1. K syntéze proteinu dochází v játrech.

Antitrombin je hlavní inhibitor serinových proteáz, jeho primární úlohou je lýza trombinu a faktoru Xa. Blokuje také další serinové proteázy koagulační kaskády – XIIa, XIa, IXa. Inhibiční schopnost antitrombinu může být značně zvýšená jeho interakcí s heparinem (22).

Vrozené ATD je autosomálně dominantní onemocnění, které predisponuje své nositele kE zvýšenému riziku nástupu VTE. Frekvence ATD v evropské populaci se pohybuje od 0,02 % do 0,2 % (23). Údaje stanovené na základě metaanalytické studie uvádí riziko nástupu VTE u pacientů s vrozeným ATD průměrně 16× vyšší oproti běžné populaci (19). Další autoři uvádí riziko nižší, pouze 10× vyšší oproti běžné populaci (3, 12). V současné době je známo 416 kauzálních mutací u vrozeného ATD (viz www.hgmd.cf.ac.uk).

DETEKCE POLYMORFISMŮ FV LEIDEN A G20210A PROTROMBINU

Genetické vyšetření je indikované u pacientů s epizodou VTE neznámé etiologie, trombózou na neobvyklém místě, výskytem VTE ve věku do 45–50 let, rekurentní VTE, první VTE s pozitivní rodinnou anamnézou či rozvojem VTE během těhotenství, s komplikacemi v průběhu těhotenství (např. opakovaným potratem) nebo při VTE při užívání hormonální antikoncepce (4, 24).

Metody vyšetření známých mutací vycházejí z předpokladu, že hledáme již známé SNP; z toho vyplývají požadavky na molekulární diagnostiku v klinické praxi. Metody by měly být rychlé s nízkými finančními náklady.

Úvodním krokem genetických analýz je zpravidla izolace DNA z primárního biologického materiálu, nejčastěji periferní krve. Pomocí primerů můžeme definované úseky DNA amplifikovat polymerázovou řetězovou reakcí (PCR); z tohoto principu vychází běžně aplikované analýzy: polymorfismus délky restrikčních fragmentů (PCR-RFLP), reverzní hybridizace na stripech (Strip Assay^®), alelově-specifická PCR, TaqMan real-time PCR, SNaPshot^® (25–30). V dnešní době jsou k dispozici metodiky, které umožňují stanovení prezence těchto SNP z plné krve bez potřeby izolačních kroků. Možná je také aplikace kitu pro přímou genotypizaci z periferní krve a analýza TaqMan real-time PCR (31).

PCR-RFLP

Metodou analýzy RFLP poprvé detekovali Leidenskou mutaci Bertina et al. (25). Tato analýza ve své multiplexové verzi umožňuje vyšetření jak varianty FV Leiden, tak genu protrombinu G20210A v jedné zkumavce (32).

Principem analýzy je amplifikace vybraných úseků DNA pomocí PCR a poté štěpení tohoto specifického produktu příslušnou restrikční endonukleázou. Každá endonukleáza má specifická místa, ve kterých štěpí řetězec DNA na základě cílové sekvence nukleotidů, jež se může změnit v přítomnosti mutace. Změnu pak můžeme zaznamenat separací na agarózovém gelu jako změnu délky a počtu fragmentů DNA.

Alelově specifická PCR

Na výhody využití této metody pro detekci leidenské mutace poukazují již Blasczyk et al. (27). Hlavními výhodami jsou rychlejší odezva a snížené náklady oproti RFLP a případnému přímému sekvenování.

Testování je určeno pro detekci SNP na základě precizního designu primerů. Pokud vyšetřujeme prezenci pouze jednoho SNP, můžeme využít základní variantu této metody, při níž jsou použity dva páry primerů. V každém páru primerů je jeden společný pro obě alely (wild type / mutovanou), ale druhý je pro jednu z alel specifický. Variabilní nukleotid je umístěn v terminální pozici na konci 3´ alelově specifického primeru. Pokud se matrice DNA a variabilní primer liší právě tímto nukleotidem, dojde k neúplnému nasednutí primeru a produkt se nevytvoří.

Pro tuto metodiku je důležité nastavení podmínek PCR tak, aby se maximalizoval rozdíl v úspěšnosti PCR pro správně a nesprávně navázané primery. Reakce probíhá ve dvou zkumavkách pro každý pár primerů zvlášť. Detekce prezence fragmentů pak probíhá na agarózovém gelu. Metoda má četné varianty a může být využita také ve formě multiplexu (33).

Strip Assay

Strip Assay je v dnešní době zřejmě nejpoužívanější metodou; je aplikovatelná také na detekci trombofilních polymorfismů (29). Na trhu je k dispozici velké množství komerčních kitů pro laboratorní diagnostiku.

Metoda je založena na principu reverzní hybridizace. V úvodním kroku je DNA pacienta amplifikována pomocí PCR s využitím primerů značených biotinem pro SNP, které chceme detekovat. Vzniklý produkt DNA je aplikován na strip a poté dochází k hybridizaci za použití oligonukleotidových sond (wild type / mutované), jež jsou imobilizované na stripu ve formě proužků. Takto navázané biotinylované sekvence můžeme detekovat po přidání streptavidin-alkalické fosfatázy a barevných substrátů.

TaqMan real-time PCR

Technika real-time PCR má mnoho aplikací a bývá využívána také na detekci FV Leiden a genu protrombinu G20210A (30). Její hlavní výhodou je rychlost odezvy pro absenci restrikčních kroků v případě RFLP a také absence potřeby elektroforeticky detekovat fragmenty. K dispozici je velké množství komerčních kitů.

Pro analýzu se využívají TaqMan sondy, oligonukleotidy, které nesou na svém konci 5´ kovalentně navázaný fluorofor a na konci 3´ zhášeč. Dokud jsou tyto molekuly vedle sebe, zhášeč potlačuje fluorescenci emitovanou fluoroforem. Sondy jsou specifické pro sekvenci DNA, pro které jsou navrženy primery. Polymeráza při syntéze nového vlákna svou exonukleázovou aktivitou hydrolyzuje sondu, čímž dojde k uvolnění molekuly fluoroforu z blízkosti zhášeče a emisi fluorescence. Detekce probíhá na základě speciálního termocykleru, který zaznamenává množství emitované fluorescence ve vztahu k templátu DNA přítomného ve zkumavce (34).

SNaPshot

V případě SNaPshot se jedná o rychlou metodu, pomocí které v závislosti na užitém kitu můžeme vyšetřit až 10 SNP v jedné reakci. V dnešní době je užívána především jako možnost relativně jednoduchého vyšetření většího množství SNP během jedné analýzy (14).

Funguje na základě extenze nově vznikajícího vlákna DNA, pokud je přítomný vybraný nukleotid. Prvním krokem analýzy je PCR reakce, kde díky adekvátně zvoleným primerům vymezíme fragment s možným výskytem SNP. Po purifikaci vzniklého amplikonu následuje jednonukleotidová extenzní PCR reakce. Detekční sondy jsou opatřeny poly(dT) rozdílné délky a připraveny tak, že nasednou přesně vedle pozice pro SNP. Po přidání směsi fluorescenčních dideoxyribonukleotidů (ddNTP) se sonda prodlouží o jeden příslušný dideoxynukleotid. Po následné purifikaci provedeme detekci na kapilární elektroforéze podle délky a barvy PCR produktů (14).

Vyšetření neznámých a vzácných variant asociovaných s trombofilními stavy

Pro molekulárně genetické testování jsou indikovaní pouze pacienti s důvodným podezřením na hereditární formu trombofilie za současného vyloučení exogenních příčin. Genetické vyšetření je doporučeno těm pacientům, u kterých došlo k epizodě VTE neznámé etiologie, výskytu trombózy na neobvyklém místě, výskytu VTE ve věku do 45–50 let, výskytu rekurentní VTE, výskytu první manifestace VTE s pozitivní rodinnou anamnézou nebo rozvoji VTE během těhotenství, komplikaci během těhotenství (např. opakovanému potratu), případně výskytu VTE při užívání hormonální antikoncepce (4, 24).

Pro indikaci genetického testování genů zodpovědných za deficienci antikoagulačních proteinů je důležitá detekce opakovaně nízkých hodnot funkčních testů stanovujících aktivitu těchto proteinů za předpokladu, že jsou vyloučeny exogenní vlivy. Korelací mezi aktivitou proteinu a nalezenými variantami lze empiricky odhadnout vhodné cut-off hladiny proteinů pro molekulárně genetické testování (7).

Sangerovo sekvenování

Sangerovo sekvenování je v dnešní době stále nejčastěji využívanou metodou pro detekci neznámých genetických variant v genech PROS1, PROC a SERPINC1 (4, 5, 7, 24). Jeho pomocí můžeme číst pořadí jednotlivých nukleotidů v řetězci DNA. Metoda je velmi časově náročná, jak po stránce vlastní přípravy reakcí pro jednotlivé fragmenty, tak pro samotné hodnocení takto nalezených variant.

Sangerova sekvenační metoda sestává z templátu DNA, specifických primerů, stavebních deoxyribonukleotidů (dNTP), fluorescenčně značených ddNTP a polymerázy. Prvním krokem je amplifikace úseku, který chceme sekvenovat pomocí specifických primerů metodou PCR. Klíčovým krokem pro detekci pořadí nukleotidů v polynukleotidovém řetězci je sekvenační PCR. Jeho podstatou je přidání 4 odlišně fluorescenčně značených ddNTP do reakční směsi, které v důsledku absence hydroxylové skupiny vždy po svém zařazení do nově vznikajícího řetězce celou syntézu ukončí. Do reakční směsi jich přidáváme pouze malé množství, protože dNTP „soutěží“ s ddNTP o pozici k začlenění do nově vznikajícího řetězce. Pořadí nukleotidů v takto vzniklém řetězci můžeme díky fluorescenci určovat kapilární elektroforézou v genetickém analyzátoru.

Vlastní hodnocení odhalených genových variant probíhá srovnáním získané a referenční sekvence pomoci programů BLAST^®, prohlížením variant na genomových prohlížečích a jejich hodnocení dle dostupných databází variant.

Masivní paralelní sekvenování

Vhodné využití technik masivního paralelního testování (MPS) je cestou jak zefektivnit vyhledávání vzácných a neznámých variant, které se mohou v genech vyskytovat. Mohou pomoci zvýšit testovací kapacitu a vyšetřit větší množství pacientů s deficiencemi antikoagulačních proteinů, protože prevalence PSD, PSC a ATD je nízká a zřejmě podhodnocená z důvodu nedostatečné testovací kapacity (35). Tato metodika se již využívá pro detekci velkých panelů trombofilních mutací (36, 37).

MPS, také označované jako sekvenování nové generace (NGS), umožňuje přečíst velké úseky DNA zahrnující geny, celé exomy a také genomy. Podstatou MPS je čtení velkého množství sekvencí DNA. Analýza vyžaduje přípravu genových knihoven pomocí fragmentace DNA, ligace adapterů, hybridizace s lokusově specifickými sondami, amplifikace fragmentů nebo přímé multiplexové amplifikace cílových sekvencí. Na vlastní sekvenaci takto připravených knihoven se dá využít více sekvenačních platforem, které se liší především využívaným detekčním systémem.

V současné době se nejčastěji využívá metoda MPS založená na snímání fluorescenčního signálu, který vzniká při syntéze komplementárního řetězce DNA k matrici, která je vázána na povrch sekvenační destičky pomocí adaptéru. Metody detekce využívají například platformy Illumina^®. Druhým nejčastějším systémem je metoda MPS využívající detekci změny pH při uvolnění vodíkového kationtu v průběhu zařazení nukleotidu během syntézy nového vlákna DNA. Této metody detekce využívají platformy Ion Torrent^®.

Velmi komplikovanou fází MPS je vlastní zpracování dat. Data je potřeba softwarově zpracovat, odstranit nekvalitní signály, dále sekvence seřadit a přiřadit k referenčním sekvencím vyšetřovaných oblastí. Posledním krokem je vyhodnocování a anotace nalezených variant na základě databází a predikčních programů (38).

MLPA

U některých pacientů, u nichž sekvenační metody neodhalily genetickou příčinu proteinového deficitu, byla odhalena variabilita v počtu DNA kopií. Aplikace metody MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification neboli mnohonásobné amplifikace závislé na ligaci sond) je vhodná pro pacienty, u nichž není popsána bodová patogenní mutace (39–41). Umožňuje detekovat velké delece či duplikace exonů, případně celého genu, které bychom sekvenací neodhalili. Principem metody je hybridizace speciální MLPA sondy s cílovou sekvencí ve vyšetřovaném genu, při využití pouze jednoho páru univerzálních primerů. Srovnání amplifikátu referenčních sond a signálu u sond targetových nám umožní stanovit počet kopií vyšetřovaných oblastí genu (nejčastěji exonů).

MLPA sonda se skládá ze dvou částí, rozdílných oligonukleotidových sekvencí, na jejichž konci je sekvence komplementární k primerům, které budou přidány do reakce. Jedna část této sondy je opatřena tzv. stufferem, což je pro různé sondy určující sekvence nukleotidů rozdílné délky. Právě stuffer, který je pro každou sondu charakteristický, umožní rozpoznat jednotlivé sondy na kapilární elektroforéze dle jejich definované délky. Abychom mohli sondu detekovat, musejí obě oligonukleotidové součásti sondy hybridizovat na cílovou genovou sekvenci vedle sebe. Jedná se o nezbytnou podmínku pro jejich spojení enzymem ligázou. Pro úspěšnou amplifikaci vyšetřované sondy je nezbytné navázání obou oligonukleotidových součástí na cílovou sekvenci a jejich spojení ligázou. Pouze tak může proběhnout polymerázová reakce, při níž nasedají univerzální primery na specifické sekvence navázané na obou částech zligovaných sond. Takto dochází k vytvoření fragmentu DNA, který detekujeme na kapilární elektroforéze.

ZÁVĚR

Cílem práce bylo podat odborné veřejnosti souhrnný přehled běžně využívaných molekulárně genetických vyšetření pro vyhledávání trombofilních mutací. Kromě běžně vyšetřovaných fenotypově významných SNP je třeba vyvinout efektivní metodiku pro stanovení vzácných variant s nízkou frekvencí, ale závažným fenotypovým efektem.

Na našem pracovišti se od roku 2016 zabýváme vyhledáváním vzácných genetických variant u trombofilních stavů pomocí MPS na platformě Ion Torrent PGM, pro možnost rychlé analýzy flexibilního počtu pacientů. K dispozici máme panel genů kódujících protein C, S a antitrombin. Výsledky naznačují, že díky vhodně zvoleným indikačním kritériím a MPS s plným pokrytím exonů a možných sestřihových míst vybraných genů lze tyto varianty efektivně vyhledávat. Tato metodika může výrazně zkrátit odezvu genetického testování probandů.

Odhalení kauzální genetické příčiny může mít příznivý vliv jak na probanda samotného, tak na preventivní režim pro rodinné příslušníky s potvrzenou trombofilní variantou.

Čestné prohlášení

Autor práce prohlašuje, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku není ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou. Toto prohlášení se týká i všech spoluautorů.

Poděkování

Podpořeno MZ ČR – RVO (FNOL, 00098892).

Seznam použitých zkratek

APC       aktivovaný protein C

ATD      deficit antitrombinu

dNTP     deoxyribonukleotid

ddNTP   dideoxyribonukleotid

FV         faktor V

MLPA   multiplex ligation-dependent probe amplification

NGS      sekvenování nové generace

PCR       polymerázová řetězová reakce

PCD       deficit proteinu C

PSD       deficit proteinu S

PS          protein S

SNP       jednonukleotidový polymorfismus

VTE       žilní trombóza

Adresa pro korespondenci:

doc. Mgr. Radek Vodička, Ph.D.

Ústav lékařské genetiky LF UP a FN Olomouc

I. P. Pavlova 6, 779 00  Olomouc

Tel.: 588 444 636

e-mail: vodickar@fnol.cz