Biomarkery stárnutí – aktuální stav poznání

Súhrn

Stárnutí je proces postupného snižování funkčních kapacit lidského těla, který vede k významnému vzestupu rizika úmrtí v čase. Ačkoliv se jedná o proces univerzální všem živočichům, není jeho rychlost stejná. Biomarkery stárnutí si kladou za cíl lépe popsat proces stárnutí na úrovni jedince, orgánu, tkáně nebo jednotlivých buněk. Slouží k odhadu rychlosti stárnutí a predikci pravděpodobnosti úmrtí. Měly by dobře vypovídat o aktuálním stavu organismu a zpřesňovat predikci vnímavosti osoby ke vzniku onemocnění, jeho průběhu a pravděpodobnosti výskytu komplikací a smrti.

Jednoduché biomarkery měří jen jeden parametr nebo úzkou skupinu parametrů spolu souvisejících, které mají známou asociaci s věkem, ať jde o změny v průběhu stárnutí člověka nebo u laboratorního modelu. Můžeme je rozdělit na molekulární (vycházející ze znaků stárnutí), funkční (popisující snižující se funkční kapacity v průběhu stárnutí) a antropometrické (popisující strukturální změny).

Složené biomarkery představují nejkomplexnější způsob měření biologického věku. Kombinují v sobě velké množství dat, která pomocí algoritmů, často postavených na umělé inteligenci, vyhodnocují. Do této skupiny patří i aktuálně nejrozšířenější metoda měření biologického věku – epigenetické hodiny (epigenetic clock).

Cílem tohoto článku je přehledně rozdělit množství existujících markerů stárnutí do skupin a popsat jejich vztah ke stárnutí.

Klíčová slova:

biomarkery – stárnutí – ukazatele – rychlost stárnutí – metody

ÚVOD

Stárnutí je proces postupného snižování funkčních kapacit lidského těla na úrovni jedince, systémů, orgánů, tkání, buněk i molekul. Vysoký lidský věk je nejvýznamnějším rizikovým faktorem celé řady onemocnění, neboť úmrtnost na kardiovaskulární, metabolická, onkologická a jiná onemocnění stoupá v průběhu života exponenciálně. I když platí, že stárneme všichni, není pravdou, že stárneme všichni stejně rychle, ba naopak, rychlost stárnutí může být významně odlišná (1).

Oblast výzkumu stárnutí a možností prodloužení lidského života se velmi rychle vyvíjí. Přibývá slibných intervencí, léků nebo doplňků stravy, které prodlužují naději dožití (ve zdraví) nejen na zvířecích modelech. Vzhledem k dlouhému životnímu cyklu člověka není hledání terapií prodlužujících život efektivní bez vhodných ukazatelů stárnutí. Není dost dobře možné čekat v experimentech na pozitivní účinky látek desítky let. Bez markerů biologického věku se dá počítat s prvními výsledky za generaci či ještě později (2, 3).

Cílem tohoto článku je přehledně rozdělit množství existujících markerů stárnutí do skupin a popsat jejich vztah ke stárnutí, případně výhody a nevýhody.

KALENDÁŘNÍ VERSUS BIOLOGICKÝ VĚK

Kalendářní věk, dobře známý každému z nás, měří všem stejně. Je založen na objektivně změřeném období od narození do dnešního data, resp. do smrti. Každý člověk nicméně prožívá svůj život jinak, s jinou genetickou zátěži, v jiném prostředí, jiným životním stylem a s rozdílnou dostupností zdravotní péče. Právě tyto 4 oblasti významně ovlivňují délku života i dobu života strávenou ve zdraví (4).

Není tedy pravda, že člověk má před sebou stejný počet let života jako jeho vrstevníci. Zbývající roky mohou být dokonce významně jiné. Právě tímto problémem se zabývá rozvíjející se vědecká oblast biomarkerů stárnutí, ukazatelů biologického věku. Ty mají lépe vypovídat o aktuálním stavu organismu ve vztahu ke kalendářnímu věku. Jejich účelem je zpřesnit predikci vnímavosti osoby ke vzniku onemocnění, jeho průběhu a pravděpodobnosti výskytu komplikací a smrti (4–6).

Určení biologického věku využitím vhodných biomarkerů stárnutí může současnou medicínu velmi posunout a pomoci při rozhodování o další péči. Mimo jiné zejména v časech, kdy je nutné provádět triáž pacientů, s čímž jsme se setkali v době koronavirové pandemie. Ne každý pacient daného kalendářního věku má stejné vyhlídky na přežití. Průběh nemoci a výsledek léčby z velké části určuje věk biologický (7).

Důležitou změnou paradigmatu lékařského myšlení je přijetí věku jako ovlivnitelného rizikového faktoru vzniku a progrese onemocnění. Chronologický věk je samozřejmě neovlivnitelný, ale právě biologický věk představuje proměnnou, kterou ovlivňovat lze (tab. 1).

Marker biologického věku by přitom měl mít některé charakteristiky, které ho činí co nejlépe použitelným v klinické praxi. Měl by u zdravého člověka („průměrně průměrného“) ukazovat jeho kalendářní věk nebo – v případě jednoduchých markerů – hodnotu odpovídající stejné věkové skupině. Takové pravidlo totiž umožňuje nejsnáze posoudit, zda je na tom pacient lépe nebo hůře než jeho vrstevníci, a významně zjednodušuje komunikaci s pacientem a zvyšuje compliance pacienta při změně životního stylu. Marker by měl být také univerzální, tedy uplatnitelný na širokou populaci, včetně různých věkových kategorií. Biomarkery by měly být dobře replikovatelné a „relativně stabilní“, neboť ve většině případů není žádoucí, aby se biologický věk měnil ze dne na den o několik let. Stanovení biomarkerů by také mělo být levné a co nejméně invazivní (8, 9).

Přehled a rozdělení biomarkerů shrnuje tab. 2.

Tab. 1  Rizikové faktory nemocí

Tab. 2  Rozdělení biomarkerů

JEDNODUCHÉ BIOMARKERY

Jednoduché biomarkery měří jen jeden parametr nebo úzkou skupinu parametrů spolu souvisejících, které mají známou asociaci s věkem, tedy změna v průběhu stárnutí člověka nebo laboratorního modelu.

1. Molekulární

Molekulární biomarkery vycházejí z objektivně měřitelných laboratorních parametrů z krve, slin, či jiných tělních tekutin nebo tkání. Můžeme je rozdělit do skupin podle znaku stárnutí, který popisují. Znaky stárnutí tvoří vzájemně propojenou skupinu, nedá se tak vždy přesně říci, ke kterému ze znaků konkrétní marker zařadit.

Genomová nestabilita

Poškození DNA zvyšuje pravděpodobnost časného úmrtí (10). Působením fyzikálních, chemických a biologických činitelů dochází k hromadění defektů DNA. Se zvyšujícím se počtem defektů buňka stárne a roste riziko její smrti či maligní transformace (1, 12, 13). Stanovení přítomnosti mutací či jiných změn v genetickém kódu je možné pomocí rozličných technik na úrovni chromozomů i jednotlivých nukleotidů. Techniky porovnávající počty mutací mezi jednotlivými buňkami (random mutation capture, transgenic mutation report assay aj.) se pro oblast stárnutí teprve vyvíjejí. Celogenomové sekvenování nelze pro jeho časovou a finanční nákladnost zatím široce využít (13).

Pro stanovení množství dvojitých zlomů DNA, tedy míst s poškozením genetického materiálu (nestabilní DNA), se používá imunofluorescenční měření fosforylovaného histonu H2AX. Studie, kterou provedli Whittemore et al., prokázala mimo souvislosti mezi délkou života a rychlostí akumulace chyb i závislost na chronologickém věku (10). Dalším z mechanismů genomové nestability je oxidace DNA. Mezi její nejvýznamnější produkty patří 8-oxo-2'-deoxyguanosin (8-oxo-dG). Jeho hladiny stoupají s věkem, představuje tedy další způsob nepřímého měření poškození DNA (14).

Vyšetření genetické informace může pomoci odhalit i přítomnost genetických syndromů ovlivňujících rychlost stárnutí, jakým je například progerie. Odhalit rychlost stárnutí u konkrétního jedince však nemůže, pouze vytvoří předpoklad o rychlosti stárnutí během jeho života (15).

Negativní vliv na stabilitu genomu mají i tzv. retrotranspozony. Jejich souhrn v celém genomu se nazývá retrobiom. Retrotranspozony, lidově označované jako „skákající geny“, jsou fragmenty DNA, které mají schopnost kopírovat své sekvence z jednoho místa v genomu na jiné. Indukují tak přestavbu chromozomu, zlomy, alterace normální funkce genů, mutace. Retrotranspozony jsou zodpovědné za vznik somatického mozaicismu. Není tedy pravda, že všechny buňky jedince nesou stejné genetické instrukce a že buněčné rozmanitosti se dosahuje pouze změnou čtení těchto instrukcí (ovlivněno např. prostřednictvím epigenetických modifikací). Pokrok v sekvenování DNA a genetické analýze spolu s bioinformatikou umožnily identifikovat změny genetické informace v jednotlivých buňkách způsobené retrotranspozony. S věkem se kopií retrotranspozonů v somatických buňkách přibývá v důsledku ztráty represe během stárnutí a změn v konstitutivních regionech heterochromatinu (změna prostorového rozložení chromozomu). K nestabilitě může přispívat také s věkem pokračující zhoršování integrace retrotranspozonů (16).

Nejznámější skupinu transpozonů představuje LINE-1 (L1). Je aktivní během embryogeneze díky globální demethylaci, v dospělosti je transkripčně omezena. Její úroveň transkripce však stoupá s věkem, díky čemuž bývá někdy označována jako endogenous clock, „vnitřní hodiny“ organismu. Častěji je detekována u chorob, např. revmatoidní artritidy, karcinomů. Exprese L1 také roste stresem při expozici toxickým látkám, oxidačním stresu, typicky po ischemicko-reperfuzním poškození. Měření aktivity L1 je možné pouze na úrovní transkripce, neboť k translaci nedochází (17, 18).

Zkracování telomer

Při každém mitotickém dělení se telomery zkrátí a po dosažení kritické délky se buňka již dále dělit nemůže. Buňka neschopná dělení se stává senescentní nebo prochází apoptózou (buněčnou smrtí). Délka telomer souvisí nejen s buněčným dělením, ovlivňuje také celkovou strukturu a prostorové rozložení dvoušroubovice DNA. Dlouhé telomery strukturu stabilizují, krátké naopak (19, 20).

Zatímco v minulosti se měřila průměrná délka telomer (například u periferních leukocytů), nyní nabývá na významu zejména měření tzv. nejkratších telomer. Ukazuje se totiž, že právě buňky s nejkratšími telomerami jsou imunologicky nejaktivnější a významně přispívají k prozánětlivému procesu (inflammaging; bližší informace níže). Krátké telomery se pojí s rizikem povšechné mortality (21, 22).

Existuje řada způsobů měření nejkratších telomer (qPCR – quantitative polymerase chain reaction, TRF – terminal restriction fragment, TeSLA – telomere shortest length assay) (23).

S délkou telomer nevyhnutelně souvisí i aktivita enzymu telomerázy, reverzní transkriptázy, která je zodpovědná za prodlužování telomer de novo ve většině tkání dospělých. Některé typy buněk, například kmenové, mají aktivitu telomerázy vysokou po celý život. Exprese telomerázy v kmenových buňkách nicméně není dostatečná pro zabránění postupnému zkracování telomer ve vyšším věku (24).

Iwama et al. popsali na vzorcích periferní krve od dárců ve věku 4–95 let, že aktivita telomerázy u normálních jedinců mladších 40 let s rostoucím věkem postupně klesá a u osob 40letých a starších je velmi nízká, nebo dokonce není detekovatelná (25).

Epigenetické změny

Mezi nejdůležitější epigenetické změny související se stárnutím patří methylace DNA a změny v produkci mikroRNA (miRNA). Methylace bude popsána v části o složených biomarkerech.

MiRNA jsou krátké (~ 22 nukleotidů) nekódující molekuly RNA, které regulují genovou expresi. Hrají důležitou roli nejen při vývoji jedince, ale také v patologických procesech a stárnutí (1). Studie zaměřené na analýzu miRNA z plné krve ukazují, že exprese některých miRNA se s věkem mění. Mezi miRNA reflektující stárnutí patří např. miR-99b-5p, miR-130b-5p, miR-505-5p, miR-425-3p, miR-1275, miR-30-5p, miR-30d-5p nebo miR-206. Kvantifikace mnoha desítek miRNA by mohla sloužit ke stanovení epigenetického věku – „miRNA věk“ (miRNA age), nicméně žádný algoritmus pro výpočet dosud nebyl publikován (26, 27).

Největším úskalím při výběru vhodných miRNA jako markerů stárnutí je učení takových, jejichž koncentrace se mění se stárnutím, ale neovlivňuje je akutní nebo dlouhodobé onemocnění.

Porucha homeostázy proteinů

K narušení homeostázy proteinů může dojít od přepisu DNA do mRNA až po vlastní degradaci proteinů. Během stárnutí dochází k mnoha změnám, které mohou narušit homeostázu proteinů. Mezi zásadní patří narušení translace. To je spojeno se snížením počtu ribozomů a jejich funkcí, exprese translačních a elongačních faktorů. Navíc je snížená kontrola kvality translace (28–32). Narušená je i posttranslační úprava vzniklého polypeptidového řetězce, jeho oprava, popř. degradace poškozené bílkoviny. Opravené a degradační procesy závisejí na chaperonech, endoplazmatickém retikulu (ER), autofagosomálně-lyzosomálním a ubikvitin-proteasomovém systému. Jejich aktivita a efektivita s věkem klesá a zvyšuje se množství a agregace nežádoucích proteinů, tj. známka stárnutí proteomu (33–37). Jako markery stárnutí tak mohou sloužit jednak akumulované proteiny a jednak složky zapojené do regulace proteostázy, např. chaperon Hsp70, LAMP2A (lysosome-associated membrane protein type 2A), jejichž hodnoty negativně korelují s věkem. Autofagii je možné hodnotit pomocí Beclinu-1, proteinů Atg či p62 (multifunkční protein; p62/SQSTM1), které s věkem ubývají (38–40). Redukce exprese p62 je navíc spojená i s nárůstem exprese senescenčních znaků (41).

Proteostáza závisí také na posttranslační modifikaci proteinů, při níž dochází k navázání cukerných složek na protein: glykace, karbamylace, glykosylace. Modifikace mění funkce proteinů a s narůstajícím věkem výrazně přibývá některých posttranslačních modifikací a jejich produkty jsou detekovatelné a kvantifikovatelné v tkáních i krvi.

Glykace je neenzymatický proces, během nějž dochází k vazbě sacharidů na proteiny, nukleosidy, lipidy, změněny jsou tedy i velmi důležité substráty jako DNA, hemoglobin či protilátky (42). Sloučeniny změněné glykací se označují jako produkty pokročilé glykace (AGE – advanced glycation endproducts). S přibývajícím věkem narůstají koncentrace AGE, kumulují se jak intracelulárně (poškozují mitochondrie), tak extracelulárně (glykace bílkovin s dlouhým poločasem, např. kolagen, elastin) (43, 44). Konečná koncentrace AGE v organismu závisí nejen na příjmu (obsahují je mnohé potraviny) a tvorbě, ale také na odbourávání. To je zajišťováno např. glyoxalázovým systémem (glyoxaláza 1, glyoxaláza 2, kofaktor glutathion), ale jeho aktivita s věkem klesá (45, 46). Vyšší koncentrace AGE je ukazatelem stárnutí, nárůstu oxidačního stresu a inflammagingu. Dalšími nežádoucími posttranslačními modifikacemi jsou karbamylace, která je typická tvorbou homocitrulinu, jehož koncentrace koreluje s chronologickým věkem, a glykosylace (47, 48).

Glykosylace je proces závislý na glykotransferázách, které katalyzují kovalentní vazbu monosacharidu a proteinu nebo lipidu. Významná je glykosylace protilátek IgG. Její změny mají typické vzorce odpovídající chronologickému a biologickému věku. Na jejich základě byl vytvořen GlycanAge index, např. v mládí je vyšší koncentrace digalaktosylovaných protizánětlivých IgG a nižší koncentrace prozánětlivých agalaktosylovaných a jejich poměr se s věkem obrací (49, 50).

Narušené vnímání dostupnosti živin

Vnímání dostupnosti živin je zajištěno intracelulárními senzory, které jsou schopné spustit odpovídající reakci. Ta má zajistit přežití buňky i v období nedostatku.

Do vnímání nutrientů je zapojeno několik cest. Mezi nejdůležitější patří:

• IGF-1/inzulin
• AMPK/sirtuiny

Systém inzulinového růstového faktoru (IGF) je napojen na řadu intracelulárních signálních kaskád, včetně signalizace spojené s mTOR (mammalian target of rapamycin), a hraje tak důležitou roli v mnoha buněčných procesech (růst, přežití, metabolismus). Právě cesta mTOR, která významně zasahuje do buněčného metabolismu (např. redukuje autofagie), je dávána do přímé souvislosti se stárnutím (51).

Výsledky preklinických a klinických studií se shodují. Mutace, zablokování či snížení koncentrace složek IGF/inzulinové cesty jsou spojené s delší dobou dožití. Např. století a starší mají nižší hodnoty IGF-1 než mladší osoby, stejně tak jejich potomci. Devadesátníci s nižší koncentrací IGF-1 se ve studiích dožili vyššího věku než osoby s vyšší hladinou (52–55).

Aktivitu AMPK (AMP-activated protein kinase) regulují hormonální a metabolické signály, tvoří přirozený senzor energie v buňce. Je aktivována hlavně poklesem ATP. Aktivovaná AMPK má obrovský funkční dosah, je přímo či nepřímo zapojená do autofagie, katabolismu mastných kyselin a glykolýzy, blokuje mTOR a inhibuje transkripční faktor NF-κB atd. Výzkumy ukazují, že s věkem aktivita AMPK výrazně klesá a udržení její vyšší aktivity je spojené s prodloužením života (56–58).

Za zmínku stojí interakce mezi AMPK a sirtuiny, což jsou NAD⁺ deacetylázy. Aktivita sirtuinů, hlavně SIRT1, je řízena množstvím živin a koncentrací NAD⁺, která s věkem klesá a s ní i exprese SIRT1. Aktivita sirtuinů oddaluje zkracování telomer, podporuje udržení integrity genomu a posiluje reparaci DNA (59).

Krátce zmíníme také možnosti detekce zmíněných faktorů. IGF-1 a další členy této signální cesty a sirtuiny je možné detekovat pomocí ELISA. Sirtuiny, AMPK a mTOR lze detekovat použitím specifických protilátek namířených proti těmto faktorům, a to myších, králičích či lidských. Speciálními ověřovacími metodami je také možné hodnotit aktivitu enzymů.

Mezibuněčná signalizace

Narušení mezibuněčné komunikace lze popsat jako změny v neuronových, endokrinních, neuroendokrinních a imunitních cestách. Je důležitá k udržení homeostázy v organismu, regeneraci, obraně organismu atd. Buňky produkují mnohé působky, které mají potenciál ovlivnit lokálně i systémově fungování buněk a organismu.

Důležitou součást systémové mezibuněčné komunikace tvoří extracelulární vezikuly (EV), které jsou secernovány všemi buňkami a nacházejí se v každé tělní tekutině, včetně krve, jíž mohou být rozneseny po celém organismu. EV obsahují velké množství sloučenin, které modulují aktivitu buňky, jež EV pohltí či s nimi interaguje. Jedná se např. o DNA, mRNA, tRNA, cytokiny, růstové faktory, membránové receptory, mitochondrie, patologické proteiny (např. amyloid alfa) či lipidy. Složení EV závisí na typu buňky, z níž jsou uvolňovány, a funkčním stavu buňky (60–62). Stárnutí mění funkce buněk, a tedy i produkci a složení EV. EV je možné izolovat diferenciační centrifugací, analyzovat jejich „náklad“ a využít specifické změny jako markery stárnutí. S věkem klesá koncentrace EV v krvi, snižují se množství galektinu 3 a mitochondrií a rostou hladiny prozánětlivých působků, např. HMBG1 či IL-1β (63, 64). EV lze z krve separovat ultracentrifugací, jsou však vyvíjeny nové, rychlejší možnosti. Přítomnost EV je možné potvrdit také značením a použitím průtokové cytometrie (např. anti-CD63/CD9). Extrahované EV jsou podrobovány další analýze, která umožní odhalit jejich složení. K tomu lze použít značení hledaných molekul, ELISA, western blot, PCR, chromatografii, hmotností spektrometrii atd.

Lokální mezibuněčná komunikace je z velké části zajišťována imunitním systémem, v němž během stárnutí dochází k mnoha změnám vedoucím k prozánětlivému stavu, tj. inflammagingu. Zvyšují se tedy hodnoty markerů zánětu. Jako nespecifické markery zánětu mohou být využity např. aktivita inflamasomů a NF-κB a exprese cytokinů na nich závislých, např. interleukinů (IL) 1β, 18 a 6 a tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNF-α). Aktivita i koncentrace zmíněných markerů se s věkem zvyšují (65, 66). Obzvlášť zajímavý je IL-6. Jeho koncentrace s věkem roste. Ve studii PolSenior autoři potvrdili korelaci IL-6 s věkem, navíc doložili, že hodnoty IL-6 jsou výrazně nižší u vrstevníků procházejících „zdravým“ stárnutím, tj. těch, kteří netrpí vážnějšími kardiovaskulárními nemocemi, diabetem či nádorovým onemocněním (67, 68).

Senescence

Buněčná senescence je charakterizována zástavou dělení buňky, rezistencí k apoptóze, změnami metabolismu, produkce působků i morfologie. V průběhu stárnutí dochází k zvýšení počtu senescentních buněk, jejichž produkty dále indukují senescenci v okolních buňkách. Přechod do senescence je indukován různými stimuly. Nejčastěji se jedná o oxidační stres, nereparabilní poškození DNA či zkracování telomer (69).

V senescentních buňkách je aktivována odpověď DDR (DNA damage response) (70). Významnou roli v tomto procesu hraje transkripční faktor p53, který reaguje na poškození DNA. Navozená zástava buněčného cyklu má vést k reparaci DNA. Pokud k ní nedojde, může být buňka uvedena do senescence či podléhá apoptóze. Dalším důležitým markerem zástavy dělení a senescence je p16INK4a (p16). Při aktivaci p16 dochází k zástavě progrese buněčného cyklu z fáze G1 do fáze S (71).

Exprese obou zmíněných markerů se mění nejen s věkem, ale je rozdílná také v jednotlivých tkáních. Klinické studie prokázaly, že exprese p16 a p21 v mnoha typech tkání jsou vyšší u osob 66letých a starších v porovnání s osobami mladšími 38 let. Rozdíly exprese byly nejvyšší v epidermis a ledvinách. Změny exprese jsou tedy orgánově specifické. S věkem asociované zvýšení exprese p16 bylo zdokumentováno také v lidských T lymfocytech a slinných žlázách dolního rtu, kde byla navíc zjištěna také korelace s poklesem kognitivních funkcí (71–73).

Výše jsme zmínili aktivaci DDR. V případě, že je dlouhodobě aktivovaná, vede to k nárůstu produkce mnoha působků, které mohou být považovány za biomarkery stárnutí. Jedná se o tzv. SASP (senescence-associated secretory phenotype). Zvýšeně jsou secernovány prozánětlivé cytokiny, některé růstové faktory, proteázy, extracelulární vezikuly, solubilní a z membrány odloučené receptory a ligandy atd. (74, 75).

Za jeden z nejdůležitějších a snadno detekovatelných markerů senescence je považována lysozomální β-galaktosidáza, která katalyzuje hydrolýzu galaktózových reziduí na glykoproteinech, glykolipidech a proteoglykanech. Přestože její exprese ve stáří stoupá, aktivita β-galaktosidázy klesá, což vede ke kumulaci jejich substrátů v lysozomech (76, 77).

Senescenci může signalizovat také přítomnost lipofuscinu. Lipofuscin je nedegradovatelný lipopigment kumulující se s narůstajícím věkem v lysozomech, které poškozuje. Některými autory je považován za senzitivnější marker než beta-galaktosidáza. Jeho koncentrace ve studii zahrnující 67 osob (20–97 let) korelovala s chronologickým věkem (78). Výhoda lipofuscinu coby markeru stárnutí spočívá v možnosti jeho detekování nejen v živých buňkách a tekutinách, ale i zamrazených tkáních (77).

Mitochondrie

Mitochondrie jsou maternálně děděné organely s autonomním genomem a jsou citlivé na změny, ke kterým dochází v průběhu stárnutí (např. zvýšení oxidačního stresu, aktivace zánětu). Během stárnutí se mění morfologicky i funkčně. Nabývají cirkulárního tvaru, probíhají fragmentace, zkracují se a celkově zmenšují. Časté je fúzování mitochondrií a poruchy dělení, tj. biogeneze (79, 80). Ke kumulaci změněných mitochondrií přispívá rovněž redukce jejich odstraňování procesem mitofagie (autofagický proces odstraňující mitochondrie), díky níž je udržována homeostáza těchto organel v buňce (81).

Morfologické změny provází vyšší výskyt mutací v mtDNA. S přibývajícími roky dochází k heteroplazmii mtDNA, při níž se v buňce vyskytují jak normální, tak mutovaná mtDNA, přičemž podíl mutované se postupně zvyšuje, což je dáno poklesem aktivity mitochondriální DNA polymerázy (82, 83).

Mezi funkční změny mitochondrií patří snížení efektivity respiračního řetězce, zvýšení produkce kyslíkových radikálů a snížení produkce ATP (84–86).

Hovoříme-li o mitochondriích, není možné vynechat nikotinamidadenindinukleotid, redoxní koenzym hrající zásadní roli v energetickém metabolismu (glykolýza, Krebsův cyklus, oxidace mastných kyselin). Vyskytuje se ve dvou formách, redukované (NADH) a oxidované (NAD⁺). NAD⁺ a NADH jsou však zapojeny také do dalších biologických procesů (buněčné signalizace, smrt, autofagie, exprese genů, opravy DNA atd.). Výzkumy dokládají, že s věkem jejich hladiny klesají, a to jak v plazmě, tak orgánech, např. pokožce, mozku (87–90).

Důležitým markerem mitochondriální dysfunkce spojené se stárnutím je GDF-15 (growth differentiation factor 15). Jedná se o člena rodiny TGF-β. V dospělosti je jeho exprese nízká, ale stresové události (zánět, oxidační stres, nádorová a jiná chronická onemocnění) ji zvyšují. Zvýšení hodnot GDF-15 se pojí s imunosenescencí, snížením aktivity mitochondrií i mortalitou. Zajímavá je např. švédská studie, jíž se účastnilo 876 osob ve věku 35–80 let a samostatná kohorta stejnopohlavních dvojčat. Sledování probíhalo 14 let. Vyšší hodnoty GDF-15 se vyskytovaly u lidí s kardiovaskulárními a nádorovými nemocemi a korelovaly s celkovou úmrtností. Za mezní prediktivní hodnotu mortality byla určena hladina 1800 pg/ml (91, 92). Měření koncentrace GDF-15 je přitom již možné i pomocí komerčních kitů ELISA.

Vyčerpání kmenových buněk

Kmenové buňky jsou nediferencované, se schopností dělení a diferenciace do zralých buněk podle své diferenciační kapacity (multi-, monopotentní) a stimulace prostředím (93). Mají regenerační, ale také např. imunomodulační potenciál. Jejich počet i funkční kapacita s přibývajícím věkem klesají. I v kmenových buňkách dochází k poškození DNA, zkracování telomer, senescenci, epigenetické alteraci, narušení mitochondriálních funkcí, proteostázy a metabolismu, což se projeví jako omezení dělení, diferenciace, změny v sekretomu atd. Tyto procesy jsou spojeny se zhoršením regenerace organismu, tkáňovými dysfunkcemi a zkrácením délky života. Nejsnadněji se monitorují stav a vyčerpání hematopoetických kmenových buněk, které se projevuje jako snížení krvetvorby. To je také důvod, proč se k odběru kostní dřeně mohou hlásit pouze osoby ne starší než 40leté. U hematopoetických kmenových buněk starších lidí je patrný shift od tvorby lymfoidních buněk k produkci buněk myeloidní linie. Ve stáří se zvyšuje incidence myeloidních leukémií, zatímco děti a mladí dospělí jsou zatíženy lymfocytárními formami leukémií (94, 95).

2. Funkční (fyziologické)

S jednoduchými funkčními biomarkery stárnutí se setkáváme v každodenním životě i klinické praxi, aniž bychom si uvědomovali, že se jedná o ukazatele rychlosti stárnutí. Jedná se o markery, které popisují funkční kapacity lidského těla, resp. jednotlivých orgánů.

Nejjednodušším příkladem může být maximální tepová frekvence (TF), která u jedince v průběhu života klesá. Sofistikovanější metodu představuje zátěžová ergometrie, která hodnotí schopnost kardiovaskulárního systému (KVS) adaptovat se na zátěž. Rychlejší nárůst TF při zátěži znamená nižší odolnost vůči zátěži. Maximální kondice dosahujeme ve druhé až třetí dekádě života, poté se postupně snižuje (96, 97).

Dalším příkladem testu, jehož výsledky významně ovlivňuje věk zkoumané osoby, je spirometrie (funkční vyšetření plic). Testy svalové síly, rychlosti chůze, kognitivních funkcí (MMSE – mini-mental-state examination) a další vlastně rovněž představují způsoby zkoumání biologického věku člověka, protože popisují funkční kapacitu našich systémů (98, 99).

Celá oblast sportovní medicíny vlastně úzce souvisí s oblastí prevence stárnutí. Měření funkčních kapacit, které v průběhu života klesají, je velice blízké měření funkčních kapacit u sportovců, kteří se snaží jejich hodnoty co nejvíce zvýšit a poté dlouhodobě udržet (100). Z rozsahových důvodů není možné zabývat se všemi funkčními testy biologického věku.

3. Antropometrické (anatomické)

Antropometrické biomarkery stárnutí nepopisují funkční stav, ale pouze aktuální podobu organismu. Typickým představitelem je množství a rozložení tělesného tuku. V průběhu života tukové tkáně obvykle přibývá až do jeho závěru, kdy může docházet naopak ke kachektizaci. Tělesná hmotnost, BMI (body mass index) a měření obvodu pasu tak mohou poskytnout další informaci o stavu organismu a orientačním biologickém věku pacienta. K přesnějšímu měření množství tělesného tuku se používá také metoda kaliperace kožních řas. Nejen tuková tkáň, ale i svalová se v průběhu života mění. Jejich množství lze stanovit zobrazovacími metodami, hojně se využívá rovněž bioelektrická impedance. Nejzákladnější forma stanovení stavu svalové hmoty je měření obvodu typických svalových skupin (např. lýtko). Zajímavostí je i výška postavy, která se skutečně v průběhu života snižuje (101, 102). Z rozsahových důvodů není možné věnovat se v rámci této práce všem antropometrickým ukazatelům stárnutí.

Anatomické biomarkery se mohou skládat do větších celků, a tak v kombinaci se zobrazovacím vyšetřením vytvářet složené biomarkery stárnutí.

SLOŽENÉ BIOMARKERY STÁRNUTÍ

Jedná se o nejkomplexnější způsob hodnocení biologického věku. Složené biomarkery stárnutí zahrnují kombinace velkého množství dat, které se vyhodnocují pomocí algoritmů často postavených na umělé inteligenci. Jsou v principu dvojího druhu – hodiny (clocks) a tzv. -omics, jež vycházejí z měření komplexního metabolomu, proteomu, transkriptomu či jiných -omů. Jedná se o soubor všech dějů/látek, které probíhají/existují v čase sledování. jakožto souborů všech dějů/látek v daném čase probíhajících/existujících (103, 104).

1. Hodiny

Nejznámějším a v současné době nejuznávanějším složeným biomarkerem stárnutí je metoda zvaná epigenetické hodiny (epigenetic clock). Jejím základem je měření methylace DNA na tzv. ostrůvcích CpG. Jedná se o oblasti DNA, kde za cytosinovým nukleotidem opakovaně následuje guaninový nukleotid v lineární sekvenci bází. Cytosin v takovém místě může být methylován, čímž vznikne 5-methylcytosin. Methylace mění míru exprese genu v blízkosti ostrůvku (105). O tom, že některé ostrůvky CpG mění množství methylovaných cytosinů s rostoucím věkem, se vědělo již od šedesátých let minulého století. V roce 2013 vydal prof. Horvath publikaci, která popisovala algoritmus počítající biologický věk z celkem 353 ostrůvků CpG. Jeho epigenetické hodiny dokážou odhadnout u zdravých osob kalendářní věk s vysokou přesností, u osob nemocných nebo s rizikovými faktory (životního stylu, prostředí, organismu) poté naměří zpravidla číslo vyšší – udávající biologický věk. Příkladem může být kohorta pacientů s Downovým syndromem nebo obezitou (106, 107).

Odhadovaný biologický věk předpovídá délku života po úpravě na chronologický věk a další rizikové faktory. Kromě toho jsou epigenetické hodiny spojeny s velkým množstvím stavů souvisejících s věkem. Vyšší epigenetický věk značí zvýšené riziko vzniku zhoubných nádorů, Alzheimerovy choroby nebo i snižující se kognitivní schopnosti. Metoda epigenetic clock se stále vyvíjí a zdokonaluje, aby sloužila i jako marker předpokládané naděje dožití (doba do úmrtí z jakýchkoliv příčin) (108–110). Například Zhang et al. jejím zdokonalováním vytvořili skóre celkového rizika úmrtí. Levineová et al. vyvinuli prediktor délky života DNAm PhenoAge, jenž hodnotí nejen úseky DNA, které jsou typicky methylovány ve vyšším věku, ale i změny methylací DNA při rizikovém chování (např. kouření) (111, 112).

Dalším příkladem clocks mohou být biologické hodiny hodnotící hematologické a biochemické parametry. Zatímco epigenetic clock je dlouhodobě velmi stabilní a ovlivňují ho zejména zásadní změny životního stylu, vážné nemoci nebo faktory působící po dlouhou dobu, stanovení biologického „krevního“ věku je citlivé na aktuální změny životního stylu či stresovou zátěž. Mamoshina et al. ve studii využili pro výpočet 19 krevních parametrů, z nichž 14 je biochemických (koncentrace albuminu, glukózy, hemoglobinu, cholesterolu, sodíku, močoviny, LDL a HDL cholesterolu, triglyceridů, celkových proteinů, vápníku, kreatininu, draslíku a celkového bilirubinu) a 5 hematologických (hematokrit, počet erytrocytů a destiček, střední koncentrace hemoglobinu v erytrocytech /MCHC/ a střední objem erytrocytů /MVC/) (113). Tato studie prokázala schopnost predikovat celkové riziko úmrtí ze všech příčin pomocí změřeného „krevního“ věku.

Měření biologického „krevního“ věku ukázalo, že aktivní kuřáci mají signifikantně vyšší biologický věk než chronologický. Kromě hodnocení biologického věku autoři ukázali, že mohou také předpovídat kuřáctví, což by mohlo nahradit často chybné sebehodnocení počtu vykouřených cigaret (114).

Umělá inteligence, respektive strojové učení získává v posledních letech čím dál větší uplatnění ve zpracování záznamů výsledků zobrazovacích metod. Oblast medicíny a stárnutí není výjimkou. Prediktory lidského věku založené na zobrazovacích metodách byly vyvinuty snad pro všechny typy přístrojových technik i období života, včetně odhadu gestačního nebo chronologického věku (např. podle hustoty minerálů stehenní kosti pro forenzní účely) (115–117).

Data z magnetické rezonance (MRI) se používají k trénování neuronových sítí pro predikci věku pacienta (118). Tuto techniku lze využít pro včasnou diagnostiku a stanovení stadia různých neurologických poruch (např. u roztroušené sklerózy). Nejen číselná, ale i vizuální data budou čím dál častěji zasahovat do měření biologického věku pomocí složených biomarkerů stárnutí pokrokem výpočetních kapacit a schopností modelů strojového učení (119).

2. -omics (big data)

S rozvíjející se počítačovou technologií nabývají na významu i markery postavené na velkém množství dat. Tato oblast je často označována jako -omics pro koncovku termínu v anglickém jazyce. Popis všech -omics není vzhledem k rozsahu této publikace možný, přiblížíme proto pouze nejdůležitější z nich.

Genomika

Genomika se zabývá studiem genomu jedince. Dědičnost lidské dlouhověkosti byla odhadována na 15–40 %, ačkoli výsledky nedávné robustní studie hodnotící 5,3 milionu rodokmenů v online genealogické databázi poukázaly na odhadovaný podíl dědičnosti na dlouhověkosti pouze 16 %. Po 70. roce věku nabývá genetická složka stále většího významu a v různé míře ovlivňuje většinu běžných polygenních stavů, které narůstají od středního věku. Ve velmi vysokém věku (> 90 let) vystupují ze stínu specifické geny dlouhověkosti a při určování délky života dominují nad vlivy prostředí (120–122).

Byť genomika tvoří důležitou součást poznávání procesu stárnutí a dokáže zpřesnit odhad naděje dožití jedince, pročež je zmíněna v tomto článku, nelze ji využívat jako jeden z biomarkerů stárnutí, neboť ze své podstaty je neměnná. Výjimkou může být zkoumání retrobiomu, tedy nekódujících retrotranspozonů, kterým jsme se věnovali výše.

Transkriptomika

Transkriptom označuje veškerý materiál RNA, tedy mRNA, tRNA, rRNA a nekódujících RNA, v jedné nebo více buňkách. Transkriptomika tak zahrnuje vše, co se týká RNA, včetně jejich transkripce a úrovně exprese, funkce, lokalizace a degradace. Transkriptomické studie se provádějí na RNA-Seq (umožňuje analyzovat celkovou buněčnou RNA, včetně mRNA, rRNA a tRNA v daný okamžik, a tím také neustálé změny buněčného transkriptomu). Výzkum lidského transkriptomu ukázal, že stárnutí je obecně specifické pro pohlaví a konkrétní tkáně. Existují společné změny exprese vzorců energetického a oxidačního metabolismu, regulace extracelulární matrix a zánětlivých drah. Stárnutí je spojeno s narušením procesu sestřihu (splicing). Na druhé straně existuje dosud nespojovaný přímý vztah několika molekul RNA s nemocemi souvisejícími s věkem, což naznačuje její možné využití jako biomarkeru (123–125).

Jedna z prvních studií navrhujících panel významných diferenciálně exprimovaných genů upozornila na osm genů, které zachycují 71 % transkripční variability související se zdravým stárnutím. Tyto geny regulují buněčnou proliferaci, adhezi, diferenciaci a zánět a korelují s klinickými proměnnými, jako je lidská šedá hmota (126). Jiná celoplošná studie, provedená na 14 983 vzorcích periferní krve různých kohort dárců identifikovala 1497 genů souvisejících s věkem. Využití analýz transkriptomu je tedy slibnou rozvíjející se cestou k tvorbě komplexních biomarkerů stárnutí, vyžaduje však velkou míru specificity vzhledem k odlišné transkripci jednotlivých tkání (127).

Proteomika

Proteomika zahrnuje použití technologií pro identifikaci a kvantifikaci celkového obsahu proteinů v buňce, tkáni nebo organismu. Využívá například hmotnostní spektrometrii, molekulovou vylučovací chromatografii nebo techniky jako ELISA a western blot pro selektivní analýzu proteinů. Proteomika by mohla pomoci vyvinout biomarkery, jež zahrnují komplexní proces stárnutí ve zdraví i nemoci, a také profily proteomu přesně korelující s chronologickým věkem. Například studie provedená v roce 2020 analyzující proteom plazmatických bílkovin 100letých lidí s významnou stařeckou křehkostí upozornila na 10 nejvýznamnějších proteinů spojených s úspěšným i neúspěšným stárnutím. To naznačuje, že tyto proteiny jsou cílovými kandidátskými biomarkery pro hodnocení klinických intervencí, které by mohly pomoci dosáhnout zdravého stárnutí (128).

Studie využívající plazmu novorozenců, dětí a dospělých ukazují, že s rostoucím věkem se významně zvyšuje také obsah proteinů zapojených do transportu železa, homeostázy, imunitní odpovědi nebo apoptózy. Proteomika je tedy slibnou oblastí pro hledání nových biomarkerů stárnutí. Pro svou komplexnost je stále ještě málo probádaná (103, 129).

Metabolomika

V porovnání s ostatními je metabolomika nový a mohutně rozvíjející se obor, definovaný jako komplexní měření všech metabolitů v biologickém vzorku. Umožňuje dosáhnout sofistikované úrovně informací o biologických systémech a otevírá nové perspektivy v mnoha oblastech medicíny (130).

Přední techniky v této oblasti jsou založeny především na hmotnostní a nukleární magnetické rezonanční spektrometrii. Jedním z nejoblíbenějších cílů metabolomických studií je objevování biomarkerů. Celkově se metabolické biomarkery zdají slibné, protože metabolomika představuje výsledek komplexní sítě molekulárních procesů zahrnující genomické, epigenetické, transkriptomické a proteomické události, což znamená, že metabolom může odrážet komplexní fenotyp celosystémového stárnutí. Největším problémem tohoto přístupu je však zpracování dat, protože mezi metabolity patří řada malých molekul obsažených v různých biologických matricích, mezibuněčném prostoru, tkáních nebo buňkách, které jsou běžně podhodnoceny kvůli málo účinným izolačním protokolům včetně nejednotných protokolů pro zpracování a analýzu dat nebo aktuální nastavení organismu (lačnění, spánek, jiné) (130–133).

ZÁVĚR

Oblast biomarkerů stárnutí je slibně rozvíjející se vědní disciplínou, která nám umožňuje blíže popsat rychlost stárnutí jednotlivce. S tím se pojí i schopnost zhodnotit riziko úmrtí, riziko rozvoje závažného zdravotního onemocnění nebo riziko těžkého průběhu (infekčního) onemocnění. Jednoduché biomarkery stárnutí popisují část procesu stárnutí, zatímco složené se snaží o komplexnější charakterizaci. V příštích letech můžeme očekávat rychlý rozvoj zejména v oblasti složených biomarkerů stárnutí, neboť motivací této vědní disciplíny je vytvořit dostupný komplexní biomarker stárnutí, který by umožnil co nejpřesnější stanovení biologického věku, a tím i charakterizaci zmíněného rizika jednotlivce.

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Pavel Borský, Ph.D.
Ústav preventivního lékařství LF UK
Šimkova 870, 500 38  Hradec Králové
Tel.: 495 816 386
e-mail: borskyp@lfhk.cuni.cz