Hladiny prostaglandinu E2 , (PGE2) v ovulačním hlenu u spontánně potrácejících pacientek

Súhrn

Cíl studie:
Cílem této studie bylo zjistit, zda se u spontánně potrácejících pacientek objevují v ovulačním hlenu rozdílné hodnoty PGE2 oproti zdravým plodným ženám.

Název a sídlo pracoviště:
Poradna pro imunologii reprodukce a Výzkumné laboratoře pro imunologii reprodukce, Gynekologicko-porodnická klinika LF UK a FN v Plzni

Metodika:
Ke stanovení hladiny PGE2 v ovulačních sekretech jsme použili vysoce citlivou metodu ELISA (PGE2 HS, R&D Systems). Dále jsme provedli podrobná statistická hodnocení pomocí T-testu, ANOVA-testu a Kruskalova-Wallisova testu.

Výsledky:
Celkem jsme provedli měření u 120 pacientek. Výrobce neuvádí fyziologickou hodnotu PGE2 v ovulačním sekretu. Jako základ, ke kterému se vztahují naše další výsledky, jsme tedy použili průměrnou koncentraci 197,356 pg/ml v ovulačním hlenu kontrolní skupiny. U pacientek s 1 potratem jsme získali hodnotu přibližně 6krát vyšší, pacientky s 2 potraty vykazují hodnotu až 13krát vyšší a pacientky s 3 a více potraty dokonce až 21krát vyšší (p<0,0327, α 5 %).

Závěr:
V současné literatuře neexistuje práce týkající se sledování hladin PGE2 v ovulačním hlenu. Prokázali jsme, že u některých pacientek, především opakovaně potrácejících, s doposud nevysvětlenou příčinou, jsou i klidové hladiny PGE2 významně vysoké.

Klíčová slova:
prostaglandin E2, ovulační hlen, potrat

ÚVOD

Prostaglandiny (PG) jsou dobře známy jako látky prozánětlivé, které jsou tvořeny různými tkáněmi lidského organismu. Prostaglandiny jsou produkovány a zároveň rychle metabolizovány v místě svého působení, tj. na buněčných membránách. Vylučovány jsou močí, žlučí a stolicí.V rámci ženského reprodukčního systému zastávají důležité funkce. Byla prokázána jejich účast na dějích. jako je ovulace, oplození a implantace vajíčka a porod. Z chemického hlediska se jedná o 20uhlíkaté nenasycené mastné kyseliny, jejichž primárním prekurzorem, uloženým v buněčných fosfolipidových membránách, je kyselina arachidonová. Ta je prostřednictvím enzymu cyklooxygenázy (COX – vyskytuje se ve dvou izoformách – COX-1 a COX-2 ) převáděna na PGH2, který je následně přeměňován za účasti specifických izomeráz a syntetáz na různé primární prostaglandiny, zahrnující PGE2, PGF2α, PGD2, PGI2 a tromboxan A2. Tyto prostaglandiny uplatňují své funkce prostřednictvím receptorů vázaných s G-proteinem [1, 2, 8, 10, 11, 13].

Prostaglandin E2 (PGE2) působí skrze receptor EP (membránový receptor značený EP), rozlišujeme 4 subtypy – EP1, EP2, EP3 a EP4. EP1 je spojen s fosfolipázou C, jež je zdrojem dvou sekundárních „poslíčků“, messengers), inozitoltrifosfátu, který je zodpovědný za uvolňování intracelulárního kalcia, a diacylglycerolu, aktivároru proteinkinázy C. EP1 je znám jako receptor kontraktilní. EP2 a EP4 jsou spojeny s adenylátcyklázou a generací cAMP aktivujícího proteinkinázu A, jedná se o receptory relaxantní. V případě EP3 se jedná o receptor inhibiční, cesta působení jeho prostřednictvím je komplikovanější [2, 4, 15, 16, 19].

U PGE2 byla prokázána klíčová role při dějích, jako je mitogeneze, angiogeneze a vazodilatace, a jeho antiapoptotické působení [1, 2]. V oblasti ženských reprodukčních orgánů se podílí na regulaci růstu buněk dělohy v závislosti na fázi menstruačního cyklu. Jedná se tedy o látku, která de facto připravuje dělohu na uhnízdění oplozeného vajíčka, nebo naopak na odvržení sliznice, jejíž buňky nedošly svého naplnění [18]. Exprese PGE syntetázy a syntéza PGE2 byly detekovány ve všech fázích menstruačního cyklu se zřejmou redukcí exprese/syntézy během pozdní sekretorické fáze [13]. Velmi dobře je znám také jeho vliv na tonus děložní svaloviny, ve vyšších hladinách indukuje rytmické děložní kontrakce, které v případě dostatečně dlouhého působení mohou vést k vypuzení děložního obsahu. Proto jsou PGE2 a jeho analogy terapeuticky využívány k vyvolání potratu např. z genetické indikace, i k indukci porodu [6].

Cílem naší studie bylo porovnat hladiny PGE2 v ovulačním hlenu u spontánně potrácejících pacientek s hladinami u zdravých plodných žen.

SOUBOR A METODIKA

Do studie bylo po předchozím souhlasu zařazeno 120 pacientek ve věku 25–40 let z Poradny pro imunologii reprodukce při Gynekologicko-porodnické klinice LF UK a FN v Plzni, od kterých byl odebrán v době ovulace z kanálku hrdla děložního ovulační sekret pomocí speciální vakuované stříkačky. Všechny pacientky v den odběru byly zdravé, bez známek zánětu, ani se u nich nevyskytovala žádná patologie pohlavního ústrojí. Pacientky byly na základě jejich anamnézy rozděleny do 7 skupin:

• 1. skupina – pacientky s 1 potratem (1x p);
• 2. skupina – pacientky s 2 potraty (2x p);
• 3. skupina – pacientky s 3 a více potraty (3x p a více);
• 4. skupina – primárně neplodné pacientky (steril I);
• 5. skupina – pacientky, které již jedenkrát porodily, ale v době studie byly léčeny pro sekundární neplodnost (1x porod -P + steril II);
• 6. skupina – pacientky po umělém přerušení gravidity (i) a léčené pro sekundární neplodnost (1x i + steril II);
• 7. skupina – pacientky po mimoděložní graviditě a léčené pro sekundární neplodnost (GEU + steril II).

Kontrolní skupinu vytvořilo 9 zdravých žen, které v minulosti již spontánně porodily a jejichž manžel má normální spermiogram.

Hladiny PGE2 v ovulačních sekretech jsme vyšetřili vysoce citlivou metodu ELISA (PGE2 HS, R&D Systems). V rámci každé skupiny jsme stanovili průměrnou hodnotu PGE2 v ovulačním sekretu a následně ji porovnali s hodnotu sekrečního PGE2 kontrolní skupiny. Dále jsme provedli podrobná statistická hodnocení pomocí těchto testů:

• T-test jednovýběrový, který porovnává průměrnou hodnotu v dané skupině s hodnotou průměru kontrolní skupiny, přitom předpokládáme, že tato hodnota je „normální hodnota“ PGE2.
• T-test pro 2 výběry, který porovnává průměrnou hodnotu v dané skupině s průměrnou hodnotou kontrolní skupiny, test zapracovává též skutečnost, že normální hodnoty PGE2 neznáme, ale odhadujeme je pomocí hodnot kontrolní skupiny; tento přístup je ze statistického pohledu lepší.
• ANOVA-test, kterým jsme porovnali, zda existuje statisticky významný rozdíl mezi jednotlivými skupinami.
• Kruskalův-Wallisův test, který ukazuje, zda existuje rozdíl v hodnotách PGE2 mezi jednotlivými skupinami celkově.

VÝSLEDKY

R&D Systems neuvádí fyziologickou hodnotu PGE2 v ovulačním sekretu metodou ELISA. Jako základ, ke kterému se vztahují naše další výsledky, jsme tedy použili průměrnou koncentraci 197,356 pg/ml PGE2 získanou v ovulačním hlenu v kontrolní skupině (graf 1). U pacientek s 1 potratem je přibližně 6x vyšší koncentrace PGE2, pacientky s 2 potraty vykazují hodnotu až 13krát vyšší a pacientky s 3 a více potraty dokonce až 21krát vyšší (p<0,0327, α 5 %). Pacientky ze skupin 4 (primárně neplodné), 5 (pacientky s jedním dítětem, ale léčí se t.č. pro steril. II) a 6 ( pacientky po umělém přerušení gravidity a léčené jako steril II) vykazují též vyšší hodnoty, ale nejsou již tak výrazné. Pouze u skupiny 7 (pacientky po GEU) byla průměrná hodnota PGE2 dokonce nižší, ale zde je nutno upozornit na tu skutečnost, že skupina obsahovala pouze 3 pacientky. V rámci každé skupiny byla zaznamenána do přehledu výsledků také nejvyšší a nejnižší naměřená hladina PGE2 (tab. 1).

Pomocí T-testu jsme došli k závěru, že pro skupinu 7 (pacientky po GEU) platí, že neexistuje statisticky významný rozdíl v hodnotách, u skupin 1 (pacientky s 1 potratem), 2 (pacientky s 2 potraty), 4 (primárně neplodné) a 5 (pacientky s jedním dítětem, ale léčí se t.č. pro steril. II) vždy existuje statisticky významný rozdíl v hodnotách na hladině významnosti α 5 %, u skupiny 4 (primárně neplodné) též na hladině α 1 %.Vzhledem k dostatečnému rozsahu dat ve skupině 4 (primárně neplodné) je tady průkazný rozdíl mezi touto skupinou a skupinou kontrolní. U ostatních skupin bychom měli být v tvrzení opatrnější vzhledem k menšímu počtu dat. Podle výsledků ANOVA-testu existuje statisticky významný rozdíl mezi kontrolní skupinou a skupinou 3 (pacientky s 3 a více potraty) a dále mezi skupinou 3 (pacientky s 3 a více potraty) a skupinami 4 (primárně neplodné), 5 (pacientky s jedním dítětem, ale léčí se t.č. pro steril. II) a 7 (pacientky po GEU). Pomocí Kruskalova-Wallisova testu (P-hodnota vyšla 0,0327) jsme prokázali statisticky významný rozdíl mezi všemi skupinami (1–7) na hladině α 5 %, na menší hladině α 1 % tento statistický rozdíl neexistuje.

Celkově lze shrnout, že existuje statisticky významný rozdíl mezi kontrolní skupinou a skupinou 4 (primárně neplodné) (potvrzeno T-testem, ANOVA testem a částečně K-W testem) a dále existuje statisticky významný rozdíl mezi kontrolní skupinou a skupinami 1 (pacientky s 1 potratem) a 2 (pacientky s 2 potraty) (T-test, K-W test), u dalších skupin nejsou výsledky statistických testů zcela průkazné a pro malý počet nemocných.

DISKUSE

V současné literatuře neexistuje studie, která by se přímo zabývala sledováním hladin prostaglandinů v ovulačním hlenu. Naše práce se proto opírala o poznatky ze studií [9, 14], které se týkaly sledování obsahu prostaglandinů v placentární tkáni u žen po spontánním potratu a po indukovaném potratu. Jejich výsledky upozorňují na to, že koncentrace PGE2 a PGF2α jsou výrazně vyšší u spontánně potrácejících než u pacientek po indukovaném potratu. Studie získaly údaje, které ukazují, že enormní vzestup hladin prostaglandinů u spontánního potratu není pouze výsledek kontrakcí děložní svaloviny nebo placentární rejekce, ale důležitá součást hormonálně-imunologických reakcí vedoucích k potrácení.

Prostaglandin E2 (PGE2) působí navíc přes receptor EP ( EP1, EP2, EP3 a EP4). EP2 a EP4 receptory byly klonovány u krysy, myši, králíka, psa a člověka a bylo prokázáno, že zprostředkovávají relaxaci děložní svaloviny během těhotenství. U myší byly prováděny tvz. knockout studie, které ukazují, že selhání těhotenství je spojeno s receptory EP2, nikoliv s receptory EP1, EP3 ani EP4 [2]. U myší se také sledovala funkce COX v oblasti samičích reprodukčních orgánů se závěrem, že COX-1 deficientní myši jsou plodné, ale postiženy specifickými porodními defekty, zatímco COX-2 deficientní jsou neplodné pro abnormality při dějích, jako je ovulace, oplození a implantace vajíčka a decidualizace [11, 12]. S výsledky této studie však zcela nesouhlasí obdobná práce jiné výzkumné skupiny, která ukázala, že COX-2 deficientní myši nevykazují žádné abnormality v implantaci embrya kromě redukce počtu oplozených vajíček a zpoždění procesu decidualizace [3, 5]. Co je příčinou tohoto rozdílu zatím není zcela známo. Uvažuje se, že by to mohlo být způsobeno odlišným genetickým pozadím COX-deficientních myší [3].

Sledování hladin PGE2 v ovulačních sekretech u pacientek se sníženou plodností nebylo nikdy v literatuře doposud sledováno. Naše první výsledky ukazují na prostaglandinovou klidovou nerovnováhu především u pacientek opakovaně potrácejících. Upozorňujeme v této naší první studii na tento fenomén i proto, že bude-li se opakovat v dalších našich sledováních, pak by byl velmi snadno terapeuticky ovlivněn. Pomýšlíme pak na možnost podávat těmto pacientkám povinně inhibitory COX, mezi které patří např. nespecifická antiflogistika.

ZÁVĚR

Prokázali jsme, že u pacientek opakovaně potrácejících, jsou i klidové hladiny PGE2 obsažené v ovulačním cervikálním sekretu významně vysoké.

Práce vznikla s podporou grantu VZ LF UK v Plzni MSM 002 162 0812.

Doc. MUDr. Zdenka Ulčová-Gallová, DrSc.

Gynekologicko-porodnická klinika

Alej svobody 80

304 60 Plzeň-Lochotín