Oxidační stres v diagnostice a léčbě idiopatické mužské neplodnosti

Súhrn

Cíl práce:
Shrnutí současných znalostí o oxidačním stresu v diagnostice mužského faktoru neplodnosti.

Typ studie:
Přehledový článek.

Název a sídlo pracoviště:
Gynekologicko-porodnická klinika LF UP a FN Olomouc.

Metodika:
Zpracování údajů z literatury.

Závěr:
Článek popisuje význam kyslíkových radikálů v reprodukčním zdraví mužů.

Klíčová slova:
oxidační stres, reaktivní kyslíkové molekuly, idiopatický mužský faktor neplodnosti, antioxidanty.

ÚVOD

Oxidoredukční rovnováha je považována za důležitý parametr homeostázy organismů, jejichž energetický metabolismus je závislý na kyslíku. Oxidační stres (OS) je definován jako porušení rovnováhy mezi vznikem a odstraňováním reaktivních forem kyslíku a dusíku (reactive oxygen and nitrogen species, RONS) antioxidačním systémem organismu. RONS jsou nazývány sloučeniny obsahující nepárový elektron hydroxylový (OH^•) a superoxidový (O₂^•-) radikál, oxid dusnatý, ale řadíme mezi ně i molekuly (peroxid vodíku a kyselina chlorná), které mohou tvorbu volných radikálů vyvolat.

RONS mají v organismu duální roli. Jsou cíleně tvořeny jako obranná odpověď na stresové podněty,zasahují jako signální molekuly cestou modulace v autokrinním i parakrinním systému do řady fyziologických funkcí. Vznikají rovněž působením zevních faktorů, jako je sluneční záření a radiace, xenobiotika (léčiva, drogy), ale i vlivem kouření.

Nadměrná, nekontrolovaná produkce RONS vyvolává OS, který je v současné době spojován s celou řadou patologických stavů, včetně poruch reprodukce. Organismy jsou proto fyziologicky vybaveny řadou ochranných mechanismů k udržování oxido-redukční homeostázy. Jde o antioxidační systémy enzymatické i neenzymatické povahy, které za fyziologických podmínek udržují optimální stav v buňkách i tkáních [32].

V mužském reprodukčním systému RONS fyziologicky zasahují do maturace spermií, umožňují také jejich kapacitaci, spouštějí akrozomální reakci a jsou nezbytné i pro samotnou interakci mezi spermií a oocytem [11]. Na druhé straně nerovnováha mezi produkcí RONS a účinností antioxidačních systémů v lidském semeni se v současnosti považuje za významný etiologický faktor mužské neplodnosti, zasahující i do léčby technikami asistované reprodukce [2].

Diagnostika mužské neplodnosti není u mnoha jedinců snadná. Ejakulát je jednou z nejvíce variabilních biologických tekutin. Kvalita semene je ovlivněna demografickými parametry, životním stylem, zevním prostředím, ročním obdobím, psychosociálními faktory a v neposlední řadě i genetickou výbavou jednotlivce. Vyšetření ejakulátu je do jisté míry subjektivní a je také známo, že patologický spermiogram může být zjištěn i u fertilních mužů. Některé funkční defekty spermií vyvolané OS nelze identifikovat rutinním vyšetřením semene podle WHO, a proto bývá většina těchto případů zahrnuta do diagnózy idiopatické mužské neplodnosti [1].

Článek shrnuje nám dostupné literární údaje i vlastní zkušenosti o významu OS u mužské neplodnosti.

ZDROJE A FUNKCE RONS V MUŽSKÉM REPRODUKČNÍM SYSTÉMU

Hlavním zdrojem produkce RONS v mužském reprodukčním systému mohou být jednak nezralé či morfologicky abnormální spermie včetně tzv. kulatých buněk („round cells“) a stejně tak i leukocyty, především aktivované polymorfonukleární neutrofily (PMN) nebo makrofágy. Během spermatogeneze vykazují vývojová stadia spermií odlišnou vnímavost k OS. Haploidní spermatozoa vznikají v semenotvorných tubulech varlat v úzkém kontaktu se Sertoliho buňkami. Primární spermatocyty vzniklé meiotickým dělením jsou vzájemně spojeny cytoplazmatickými můstky, které napomáhají jejich synchronizovanému vývoji a přetrvávají až do vzniku spermatid. Nezralé spermie jsou potom uvolněny do lumen tubulů. Při fyziologickém dozrávání v nadvarleti spermie spontánně tvoří fyziologicky potřebné, malé množství H₂O₂ [11]. Nezralé spermie produkují především superoxidový radikál, který reaguje s oxidem dusnatým a tvoří peroxynitrit, předpokládaný mediátor oxidačního poškození buněk.

Aktivované leukocyty vytvářejí relativně stabilní molekulu peroxidu vodíku, která může penetrovat přes plazmatickou membránu. Fentonovou reakcí z něj vzniká velmi agresivní hydroxylový radikál. Proto podíl leukocytů na tvorbě RONS pokládá většina autorů za významnější [8], i když je jich v semeni v porovnání se spermiemi výrazně méně.

Při dozrávání ztrácí spermie fyziologicky svou cytoplazmu. Ztráta ochranných antioxidačních systémů obsažených v cytoplazmě činí spermii mnohem vnímavější k OS [2]. Proto je seminální plazma za fyziologických podmínek bohatě zásobena řadou enzymatických i neenzymatických antioxidantů, které chrání funkční schopnosti spermií.

ANTIOXIDAČNÍ SYSTÉMY V EJAKULÁTU

Antioxidanty (AO) jsou obecně substance, které brání vzniku oxidačního poškození nebo ho snižují či eliminují. Děje se tak zpravidla přeměnou RONS na méně reaktivní a méně toxické produkty schopné exkrece nebo dalšího metabolismu.

Enzymové antioxidační systémy jsou vývojově velmi staré struktury. Fylogeneticky nejstarší je superoxiddismutáza (SOD) zahrnující několik izoenzymů. V mitochondriích spermie inaktivuje superoxidový radikál vznikající v dýchacím řetězci přeměnou na peroxid vodíku. Aktivita SOD byla prokázána i v seminální plazmě, kde chrání motilitu spermií a brání peroxidaci lipidů [29]. Obdobnou funkci má další antioxidační systém glutathionperoxidázy, glutathiontransferázy a glutathionreduktázy, který je přítomen ve spermiích i v seminální plazmě. Nezbytnou součástí těchto enzymů je důležitý nízkomolekulární antioxidant, redukovaný glutathion. Dalším významným enzymem je kataláza, která rozkládá peroxid vodíku, a brání tak možnému vzniku hydroxylového radikálu tzv. Fentonovou reakcí.

Mezi neenzymatické vysokomolekulární antioxidanty patří proteiny, jako je albumin, transferin a ceruloplazmin, které mohou vázat tranzitní kovy a inhibovat Fentonovu reakci. Účinnými nízkomolekulárními antioxidanty jsou i vitaminy. Askorbát redukuje radikály za vzniku dehydroaskorbátu. Vitamin E brání peroxidaci lipidů v membránách. Karotenoidy, z nich nejúčinnější je lykopen, zhášejí singletový kyslík [19]. V neposlední řadě hrají roli i nízkomolekulární sloučeniny, jako je bilirubin, thioly a kyselina močová [3].

Účinnost takto složitého systému je prakticky nemožné kompletně zhodnotit. V literatuře jsou popisovány četné metodiky pro hodnocení aktivity jednotlivých antioxidačních enzymů nebo hladiny neenzymatických AO. Jinou možností je hodnocení tzv. celkové antioxidační kapacity (TAC), ale žádná z dosavadních metod není v současnosti schopna podat zcela přesnou informaci o účinnosti antioxidační ochrany [13, 22].

NEGATIVNÍ PŮSOBENÍ OS NA MUŽSKOU PLODNOST

Mužský faktor je podle WHO [30] příčinou neplodnosti až u 50 % infertilních párů. Současné metody analýzy semene podle doporučení WHO hodnotí jen některé parametry ejakulátu, jako například objem, viskozitu, počet leukocytů, celkový počet spermií, jejich koncentraci na 1 ml ejakulátu, jejich pohyblivost i morfologii, ale nedávají suficientní informaci o jejich funkci. Téměř polovina případů mužské neplodnosti tak zůstává neobjasněna a označuje se jako idiopatická neplodnost [14]. Za jednu z hlavních příčin idiopatické mužské neplodnosti je považován OS, který vzniká jako důsledek nadměrné produkce RONS nebo narušení obranných antioxidačních mechanismů [2].

Fosfolipidy plazmatické membrány spermie obsahují vysoký podíl nenasycených mastných kyselin (PUFA), které zajišťují fluiditu membrán, a podmiňují tak motilitu spermií. RONS, jež nestačí eliminovat antioxidační systémy, způsobují peroxidaci lipidů buněčných membrán, a vedou tak k produkci toxických metabolitů [5]. Konečnými stabilními produkty lipidové peroxidace jsou malonyldialdehyd (MDA) a 4-hydroxynonenal (4-HNE). Oba metabolity pak společně s RONS mohou dále reagovat s proteiny i DNA, a vést tak k jejich strukturálnímu poškození, jako DNA fragmentaci, deleci chromozomů a výměně sesterských chromatid [6, 31]. Poškození DNA vyvolané volnými radikály, vznikajícími endogenně nebo působením xenobiotik, se nyní pokládá za klíčový molekulární mechanismus spojený s poruchami spermatogeneze [20]. Integrita DNA spermií je velmi důležitá pro přenos paternální genetické informace. I spermie s poškozenou DNA mají schopnost fertilizovat oocyt, ale následný embryonální vývoj bývá alterován nebo může mít negativní dopad na fetální vývoj a další život takto počatého jedince [4, 5]. Zvýšené RONS také snižují koncentraci intracelulární ATP, čímž dochází k redukci fosforylace axonemálních proteinů a poklesu motility spermií.

MOŽNOSTI HODNOCENÍ ÚROVNĚ OS V EJAKULÁTU

OS je nerovnováhou meziprodukcí RONS a antioxidační kapacitou v ejakulátu. Hodnocení úrovně OS v semeni by mělo ideálně zahrnovat oba systémy, jak měření produkce RONS, tak antioxidační kapacitu. RONS jsou částice s extrémně krátkou životností, proto je jejich přímé měření velmi obtížné a vyžaduje sofistikované přístrojové vybavení (např. elektronovou spinovou rezonanci), zatím nepoužitelné v každodenní klinické praxi.

První použitá metoda hodnotící produkci ROS v izolovaných spermiích resuspendovaných ve fosfátovém pufru využila chemiluminiscenční stanovení, které využívalo světelné emise luminolu [18, 24]. Při přípravě spermií k měření produkce ROS se seminální plazma s AO odstraňuje podobně jako při přípravě spermií k technikám asistované reprodukce. Tato metoda se nedoporučuje u těžkých oligospermií, protože vyšetření je zatíženo významnou chybou.

Metodicky i ekonomicky náročnější je metoda využívající průtokové cytometrie, která poskytuje informace ohledně charakteru a buněčného původu RONS. K odlišení jednotlivých RONS se používají specifické fluorescenční sondy, například karboxydichlorodihydrofluorescein diacetát specifický především pro H₂O₂ či dihydrorhodamin 123 specifický pro peroxynitrit. Průtoková cytometrie umožňuje specifikovat podíl jednotlivých populací buněk přítomných v ejakulátu, tedy spermií, leukocytů i dalších buněčných elementů na produkci RONS. Tuto metodu je možné použít ke stanovení RONS i u vzorků s velmi nízkou koncentrací spermií.

Pro hodnocení úrovně OS je vhodné doplnit vyšetření suspenze spermií na produkci ROS o paralelní měření TAC seminální plazmy a vypočítat ROS/TAC skóre [25]. Ke stanovení TAC se používají i sety se spektrofotometrickou, fluorescenční nebo chemiluminiscenční koncovkou, některé i ve formě firemních kitů, jako např. TAS Randox^®.

Teprve nedávno bylo provedeno měření RONS v nativním ejakulátu, včetně uvedení referenčních hodnot [7]. Měření RONS v nativním ejakulátu by mělo přímo odrážet aktuální OS díky přítomnosti ochranných faktorů ze seminální plazmy.

Další možností hodnocení OS je měření stabilních biomarkerů, které jsou většinou konečným metabolickým produktem oxidačních reakcí (např. 8-hydroxyguanosin). Ty se měří v biologických tekutinách pomocí klasických analytických metod, zpravidla metodou vysoce účinné kapalinové chromatografie nebo plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií, což je spojeno s náročnou přípravou vzorku a vybavením laboratoře drahou přístrojovou technikou. V současné době jsou k dispozici i specifické protilátky pro řadu biomarkerů OS, což umožnilo vypracovat podstatně méně pracné a poměrně rychlé ELISA metody, které lépe vyhovují potřebám klinického výzkumu i léčebné praxe. Zcela ideální by ovšem bylo současné měření celého panelu biomarkerů, který reflektuje komplexitu vzájemných interakcí v oxidoredukčním systému organismu [10].

Pro hodnocení integrity jaderné DNA se používají především techniky fluorescenční mikroskopie, průtokové cytometrie i vysoce účinné kapalinové chromatografie. K nejpoužívanějším technikám patří metoda jednobuněčné elektroforézy (Comet assay), značení DNA zlomů terminální nukleotidtransferázou (TUNEL assay) nebo metoda zjišťující přítomnost zlomů v chromatinu (sperm chromatin structure assay, SCSA). Tyto metody jsou založeny na principu detekce zvýšené fragmentace DNA, které vznikají její nestabilitou či poruchou kompaktace chromatinu [12]. Zvýšený index fragmentace (DFI) negativně koreluje s pohyblivostí, morfologií i celkovým počtem spermií [23].

Další možností je využití metabolomického profilování klíčových biomarkerů OS v ejakulátu. Čtyři skupiny infertilních mužů měly charakteristické metabolomické profily v seminální tekutině, které byly navzájem a vůči kontrolní skupině plodných mužů statisticky významně odlišné. Tento přístup by potenciálně mohl být základem rychlého a neinvazivního diagnostického screeningového testu u mužského faktoru neplodnosti [10].

SOUČASNÉ MOŽNOSTI LÉČBY

V literatuře se objevují první práce, které zdůrazňují význam jednotlivých antioxidantů v léčbě andrologického faktoru. Dosud však neexistuje konsenzus v doporučených postupech.

Je známo, že některé antioxidanty chrání spermie proti OS, a to jak in vivo, tak i in vitro. Toho se využívá i v asistované reprodukci, kdy některá kultivační média jsou  obohacena o různé antioxidanty, s cílem ochránit gamety i vzniklá embrya před oxidačním poškozením. In vitro testy s izoflavony prokázaly jejich ochranný efekt na DNA spermií při působícím OS [27]. Také léčba N-acetyl cysteinem, vitaminem A a E a esenciálními mastnými kyselinami signifikantně snížila produkci RONS ve spermiích [9]. Například kyselina askorbová je významným antioxidantem v seminální plazmě. Pokud však byla podávána současně s tokoferolem, dochází naopak ke zhoršení parametrů OS [17]. V případě OS způsobeného přítomností infekce je především nutné přeléčení obou partnerů antibiotiky [20]. Agarwal et al. [1] popsali pozitivní vliv karnitinu na motilitu spermií po přeléčení genitální infekce.

Intenzivně zkoumaným antioxidantem je karotenoid lykopen. Předpokládá se, že jeho fyziologická akumulace v mužském reprodukčním ústrojí působí protektivně proti onemocněním, na jejichž vzniku se významně podílí oxidační stres. Palan et al. [21] popsali signifikantně nižší hladiny lykopenu v seminální plazmě u mužů s poruchami plodnosti v porovnání s fertilními muži. Tyto nálezy potvrzují i další autoři a doporučují podávání lykopenu. Po perorální substituci byl prokázán jeho významný nárůst, a to jak v krevní, tak i v seminální plazmě, i zlepšení motility, morfologie a počtu spermií u mužů s neobstrukční oligo-asteno-teratospermií [15, 16].

Je nutné si uvědomit, že účinnost léčby AO může být ovlivňována také životním stylem, a to jak pozitivně, tak i negativně. Příjem potravy s vysokým obsahem přirozených antioxidantů má jistě příznivý vliv, na druhé straně jejich vysoké dávky v potravinových doplňcích mohou působit i negativně. Například u kuřáků podávání beta-karotenu zvyšuje riziko karcinomu plic [28]. Léčba antioxidanty u mužského faktoru neplodnosti by tedy měla být vyhrazena jen pro pacienty, u kterých je oxidační stres potvrzen.

ZÁVĚR

Výzkum volných radikálů v posledních letech přinesl dostatečné množství důkazů, že OS je významným kauzativním faktorem v mužské neplodnosti. Nyní je důležité, aby se metodiky objektivního hodnocení OS v mužském reprodukčním ústrojí, zavedené v dosud ojedinělých specializovaných laboratořích rozptýlených po celém světě, postupně aplikovaly, standardizovaly a popřípadě zjednodušovaly pro potřeby rutinního diagnostického procesu. Dosavadní konvenční vyšetření semene totiž není schopné odhalit možné funkční poškození fertilizačního potenciálu spermií na molekulární úrovni. Teprve implementace těchto testů zpřesní diagnostiku a umožní výběr optimální léčby mužského faktoru, který se nyní stále častěji podílí na neplodnosti párů žádajících o léčbu metodami asistované reprodukce.

Podpořeno grantem IGA č. 1A8621-5.

Doc. MUDr. Ivana Oborná, Ph.D.

Gynekologicko-porodnická klinika

LF UP a FNO

I. P. Pavlova 6

775 20 Olomouc

e-mail: obornai@fnol.cz