Proteomika a biomarkery karcinomu děložního hrdla

Souhrn

Cíl studie:
Popis nových biomarkerů karcinomu děložního hrdla identifikovaných využitím proteomických technik.

Typ studie:
Přehledový článek.

Název a sídlo pracoviště:
Lékařská fakulta Hradec Králové, Univerzita Karlova Praha. Porodnická a gynekologická klinika FN Hradec Králové.

Metodika:
Shrnutí literárních údajů o nových biomarkerech karcinomu děložního hrdla zjištěných pomocí proteomického přístupu.

Závěr:
Práce sumarizuje výsledky klinických a vědeckých prací zaměřených na biomarkery karcinomu děložního hrdla.

Klíčová slova:
proteomika, karcinom děložního hrdla, biomarker.

ÚVOD

Karcinom děložního hrdla (CAC) patří mezi jednu z hlavních příčin ženské mortality a morbidity. Je zároveň druhou nejčastější malignitou postihující ženy. Nejčastěji se vyskytuje v rozvojových zemích, především důsledkem absence plošného screeningového programu. Zde se nachází až 83 % všech CAC, které v těchto lokalitách tvoří 15 % všech ženských zhoubných nádorů [10]. Skvamózní cervikální karcinom je nejčastějším typem CAC. Tvoří 80-85 % všech karcinomů děložního hrdla. Je známo, že infekce určitými subtypy lidských papilomavirů je spojena s cervikální karcinogenezí. Ta však sama o sobě k maligní transformaci nepostačuje [9]. Důležitou roli v perzistenci HPV infekce a jejím podílu na progresi dysplazie v nádor hrají tzv. environmentální faktory (např. užívání hormonální antikoncepce, kouření, počet sexuálních partnerů a jiné). A to i přesto, že výsledky recentních studií jsou kontroverzní a bez jasných závěrů [7, 12]. Navíc zde jistě hrají významnou roli kofaktory imunitní, mikrobiální a chemické, stejně jako ženské pohlavní hormony a také onkogeny aktivující bodové mutace, chromozomální translokace a delece. To všechno může vést k posunu od HVP infekce do cervikálního karcinomu [2]. Dramatický rozvoj výkonných genomických technologií v posledním desetiletí umožnil identifikovat geny spojené s karcinogenezí CAC [6, 8]. Biomarkery specifické pro CAC, či s ním spjaté, ale zatím dobře charakterizované nebyly. Současná diagnostika CAC je proto stále založena na morfologickém a histopatologickém vyšetření. Proteomické metody umožňují identifikovat komplexní proteinovou expresi, která může obsahovat informace o nádorovém vývoji a jeho progresi. Využití těchto informací může vést k nalezení nových biomarkerů, a také ke sledování terapeutické odpovědi.

BIOMARKER

Podle definice FDA je biomarker objektivně měřitelná charakteristika, použitelná jako indikátor normálního biologického procesu, patologického procesu nebo odpovědi na farmakologickou intervenci. Z biologického hlediska je biomarker molekula (velká část má povahu proteinů), jejíž přítomnost, event. kvantitativní charakteristiky lze stanovit nejčastěji pomocí specifických monoklonálních protilátek automatizovanými systémy ELISA, RIA apod. Ideální biomarker by měl splňovat několik bazálních předpokladů: vysokou specifičnost k danému onemocnění, velkou orgánovou či tkáňovou specifičnost a dostatečnou míru citlivosti. Další důležitý faktor je korelace laboratorního parametru s rozsahem poškození tkáně/orgánu, jeho přijatelná dynamika v čase a stanovení cut off hodnoty. Nelze v žádném případě opomíjet možnost standardizace jeho stanovení a snadnou interpretaci lékařem i pacientem. V neposlední řadě je velmi důležité i ekonomické hledisko [4].

PROTEOMICKÉ TECHNOLOGIE ZATÍM POUŽITÉ K NALEZENÍ NOVÝCH BIOMARKERŮ KARCINOMU HRDLA

Gelová dvourozměrná elektroforéza (2-DE)

Historicky první a stále převládající efektivní proteomickou technologií je dvojrozměrná polyakrylamidová elektroforéza rozdělující směs proteinů v gelové matrici na základě jejich izoelektrických bodů a molekulových hmotností. Vybrané proteinové skvrny, „spoty“, jsou z gelu vyříznuty, štěpeny proteolyticky a chemicky. Výsledné peptidy jsou analyzovány hmotnostní spektrometrií (MS - Mass Spectrometry) s cílem identifikovat původní protein [4].

Proteinové profilování

MALDI –TOF-MS (matrix assisted laser desorption/ionization–time of flight–mass spectrometry)

Hmotnostní spektrometrie je založena na rozdělení nabitých částí podle jejich molekulových hmotností v elektrickém či magnetickém poli. K ionizaci vzorku se využívá laser. Směs matrice a vzorku na vhodném nosiči (např. nerezové destičce) je zasažena pulzem laseru. Matrice energii pulzu absorbuje a její rozklad ionizuje molekuly vzorku. Ionty analyzované látky urychleny silným elektrickým polem vstupují do vakua trubice detektoru letu, kde se pohybují rychlostí danou jejich hmotností a nábojem. Zde je měřena doba letu částice, z níž se vypočte poměr molekulové hmotnosti a náboje částice [4].

SELDI –TOF-MS (surface enhanced laser desorption/ionization – time of flight –mass spetrometry)

Spektra proteinů mohou někdy být příliš komplikovaná a není v nich snadné nalézt proteiny o velmi nízké koncentraci. Tyto obtíže se vyřešily implementací specifické prefrakcionace proteinů. Terčíky pro měření vzorků jsou pokryty specifickými chromatografickými sorbenty, které zachycují pouze cílové spektrum proteinů, přičemž vzorky v hmotnostním spektrometru jsou měřeny přímo z nich. Tato technologie je známa jako SELDI–TOF–MS. Univerzálnost této technologie spočívá v chemické interakci povrchu terčíku s analyzovaným materiálem. Tyto terčíky mohou být vyrobeny podle požadavku zákazníka, tak aby byly schopny vázat specifickou skupinu proteinu z analyzovaného vzorku. Následná analýza probíhá ve shodném principu s MALDI-TOF-MS. Velkou výhodou této technologie je skutečnost, že daný vzorek komplexní směsi proteinů je analyzován současně na několika různých sorbentech, aby se navázaly a analyzovaly veškeré proteiny ve studovaném vzorku [4].

Nové biomarkery karcinomu děložního hrdla byly proteomickými metodami hledány v séru/plazmě pacientek, ale také přímo v tkáni děložního hrdla. Tato cesta na první pohled komplikovanější, je mnohem přímější a přesvědčivější než hledání biomarkerů v séru/plazmě. Alternativou také může být vyšetření cervikálního stěru.

1. Biomarkery ze séra/plazmy pacientky

Lin a kolektiv využil technologie SELDI-TOF-MS ke studiu proteinových profilů plazmy pacientek s invazivním spinocelulární karcinomem a karcinomem in situ děložního hrdla. Nalezl šest proteinových peaků, které odlišovaly invazivní spinocelulární karcinom od karcinomu in situ [5]. Choi a kol. ve své práci prezentoval nález rozdílných proteinových spotů na gelové matrici při použití 2-DE u pacientek s karcinomem hrdla a pozitivitou high risk HPV oproti pacientkám je s pozitivitou HPV 16 nebo HPV 18 a HaCaT buněčnými liniemi (buněčné linie lidských keranocytů), které byly použity jako kontrolní vzorek [3].

2. Biomarkery z tkáňového vzorku děložního hrdla

Použití tkáně k nalezení nových biomarkerů proteomickou cestou je mnohem výhodnější a snazší cesta než jejich přímé hledání v plazmě/séru. Ty totiž obsahují především diagnosticky nezajímavé, abundantní proteiny (např. albumin), jež tvoří až 90 %. Teprve za těmi se skrývají ty, které mohou být kandidátními proteiny. Je zde mimořádně velký koncentrační rozdíl mezi abundantními a diagnosticky zajímavými proteiny. Tkáňová proteomika se nepotýká s tak velkým koncentračním gradientem. Analogicky například koncentrace CA-125 jsou signifikantně vyšší v místě svého původu než v krvi. Pacientky s ovariálním karcinomem mají zřetelně vyšší hladiny CA-125 v nádoru a ascitu než v séru. Navíc některé tzv. nespecifické nádorové markery se mohou stát více specifické pro CAC v případě, že jsou získány přímo z tkáně hrdla. Bae a kol. použil 2–DE a MALDI-TOF-MS k vyšetření vzorku děložního hrdla 17 pacientek s nenádorovým onemocněním a 33 žen s CAC. U pacientek s CAC nalezl 17 proteinů up-regulovaných a 18 down-regulovaných [1]. Wong a kol. vyšetřil 62 proteinových profilů biopsií získaných z děložního hrdla. CAC byl v 35 případech, zbývajících 27 biopsií bylo ze zdravého hrdla. Z 35 vzorků karcinomu hrdla bylo 17krát zastoupeno stadium I, 12krát stadium II a třikrát vzorky stadií III a IV. K analýze byla použita technologie SELDI-TOF-MS. V každém proteinovém profilu bylo nalezeno zhruba 50 různých peaků. Autoři identifikovali sedm peaků korespondujících s hmotnostmi 5454, 5559, 6382, 10869, 11091, 12719 a 13262 Daltonů. Všechny tyto proteiny byly v případě CAC down-regulovány. Na přítomnosti, či nepřítomnosti těchto peaků (1 bod – peak nepřítomen, 0 bodů – peak přítomen) založili jednoduchý skórovací systém se škálou 0-7 bodů. Je-li skóre 4 a více, je vzorek možno považovat za nádorový, zatímco je-li skóre 3 a méně, je vzorek nenádorový. Skóre následně testovali na dalších 27 slepých vzorcích a dosáhli senzitivity 87 % a specificity 100 %. Bohužel výše skóre nemá vypovídací hodnotu vzhledem ke stadiu onemocnění [13]. Tato práce téměř vzorově demonstruje přednosti a negativa SELDI-TOF-MS metody. Na jedné straně relativně jednoduché klinické vyhodnocení podle přítomnosti či nepřítomnosti předem definovaných peaků. Na straně druhé je absence konkrétnějších informací o proteinech s výjimkou údaje o jejich hmotnosti.

Většina autorů srovnává vzorky CAC s kontrolní skupinou zdravých pacientek. Lepší než srovnání různých histopatologických nálezů rozdílných pacientek je porovnat vzorky tkáně hrdla infiltrované nádorem se vzorkem přilehlé zdravé tkáně téhož cervixu. Stav, kdy patologická a zdravá tkáň pocházejí od jedné pacientky zajistí stejný typ HPV infekce, shodný imunitní stav pacienta od nějž vzorky pochází, paritu, anamnézu kouření, shodnou sexuální historii, a další, zatím nedefinované cervix-vaginální mikroenvironmentální faktory, jež se mohou podílet na kancerogenezi. Tento přístup zvolil ve své práci Zhu a kol. Použil gelovou dvourozměrnou elektroforézu následovanou MALDI-TOF–MS ve snaze vyšetřit rozdílnou expresi proteinových profilů v CAC a přilehlé zdravé cervikální tkáně. Identifikované proteiny následně konfirmoval pomocí Western blot techniky. Použil celkem 30 párových vzorků (od každé pacientky vzorek nádorové a přilehlé zdravé tkáně cervixu). Všechny vzorky byly nejprve pečlivě vyšetřeny patologem a vybrány tak, aby vzorek tumoru vždy obsahoval minimálně 80 % nádorových buněk. Naopak vzorek zdravé tkáně musel být zcela bez přítomnosti nádorových buněk. Stadium I (Ia1 bylo zastoupeno třikrát, Ia2 dvakrát, Ib1 šestnáctkrát, Ib2 třikrát) zahrnovalo 24 vzorků a zbývajících šest pocházelo ze stadia IIa. Proteinová směs se extrahovala pomocí TCA-acetonové precipitační metody. Směs proteinů byla následně separována pomocí gelové dvourozměrné elektroforézy. Signifikantně rozdílné 2-DE spoty mezi nádorem a vzorkem zdravé přilehlé tkáně byly vyříznuty, trypsinem štěpeny a analyzovány MALDI-TOF-MS. Za pomoci 2-DE bylo identifikováno kolem 600-700 proteinových spotů. Z toho bylo 55 rozdílných. Tyto spoty byly vyříznuty a po štěpení trypsinem analyzovány.

Autoři úspěšně identifikovali 32 různých proteinů, z nichž např. tyrosinkináza 2 (Tyk2), S100 calcium-binding protein A9 (S100A9), proline – 4 hydroxyláza, ACSS1, keratin 1, zinc finger protein 217 (ZFP 217) a jiné byly up-regulovány, naopak T-cell receptor alpha, mitochondrial ribosomal protein S15, vimentin, endoplazmin reticulum 60 proteáza, lamin A/C byly v nádorové tkání down-regulovány (viz tab. 1). V další fázi se autoři pokusili tři proteiny (Tyk2, S100A9, ZNF 217) identifikované proteomickou analýzou konfirmovat použitím western blot techniky v nových 20 párových vzorcích (16 vzorků stadia I a 4 vzorky stadia IIa). Expresi Tyk2 proteinu zjistili v 18 z 20 nádorových vzorcích, ale jen v dvou případech zdravé cervikální tkáně. Protein S100A9 nalezli ve všech dvaceti vzorcích karcinomu a jen ve čtyřech bioptických vzorcích normální tkáně. ZNF 217 byl potvrzen ve všech nádorových a nenádorových vzorcích. Exprese Tyk2, S100A9 a ZNF 217 byla signifikantně up-regulována v nádorových vzorcích ve srovnání s vzorky normální tkáně děložního hrdla. Korelace s dalšími klinickými parametry, jako je např. histologický grade, klinické stadium a invaze do lymfatického systému, nebyla nalezena [14].

Závěrečnou částí byl pokus odhalit imunohistochemickou analýzou, které buňky jsou zodpovědné za expresi proteinů Tyk2, S100A9 a ZNF 217. Imunohistochemie byla provedena v témže vzorku jako dvourozměrná elektroforéza. Tyk2 a ZNF 217 byly lokalizovány v cytoplazmě epiteliálních buněk. S100A9 byl ve většině případů lokalizován v cytoplazmě epiteliálních nádorových a zdravých buněk a v některých případech byl také nalezen v buněčném jádru. Ve všech testovaných vzorcích nádorové tkáně se potvrdila difuzní a intenzivní přítomnost Tyk2, S100A9, a ZNF 217. Naopak vzorky zdravé tkáně neobsahovaly stopy Tyk2 a lokálně jen slabou pozitivitu pro S100A9 a ZNF 217 [14].

3. Biomarkery z cervikálního stěru

Rader a kol. ve své recentní práci použil k proteomické analýze cervikální stěr odebraný štětičkou (cytobrush) z děložního hrdla obdobnou technikou, jakou se odebírá stěr na onkologickou cytologii. Ze vzorku byly proteiny extrahovány pomocí speciálního tekutého RNA zachovávajícího agens (RNAlater). Následně byla provedena 2 DE, kdy bylo identifikováno 390 proteinových spotů. Ty byly následně štěpeny trypsinem a výsledná peptidová směs analyzována pomocí MS/MS. Dvanáct spotů obsahovalo neidentifikovatelné peptidy. Zbývajících 378 spotů reprezentovalo 153 rozdílných genových produktů. Autoři identifikovali 161 genů zodpovědných za produkci rozdílných proteinů mezi CAC a normálním nálezem na hrdle, či CIN I. Největší skupinu, 26 %, tvořily nukleární geny. Druhá největší skupina byla zastoupena cytoplazmatickými geny. Největší rozdíly v expresi mezi CAC a normálním nálezem, či CIN I vykazovaly proteiny patřící do skupiny keratinů (KRT6A, KRT13, KRT4 a KRT14) a dále proteiny HSPD1a FABP5. Jako potenciální biomarker CAC byl autory označen protein HNRPA2B1. Jeho detekce pomocí 2-DE byla 3,98 násobně vyšší v případě CAC, či CIN III ve srovnání s normálním nálezem na hrdla a 1,48 násobně zvýšena při použití mikroarrayí. Nález byl verifikován i pomocí Western blot techniky [11].

ZÁVĚR

Podstata karcinomu děložního hrdla je multifaktoriální, a proto lze očekávat, že k jeho efektivní detekci a diagnostice bude nutná kombinace několika biomarkerů a ne využití pouze jednoho biomarkeru. Většina zatím publikovaných prací dělí své soubory pacientek jen do dvou skupin – přítomnost nádoru a zdravá kontrola. To logicky vyplývá ze snahy o nalezení biomarkeru pro daný nádorový stav. V pozadí bohužel zůstává věc velmi zásadní. Zjištěné biomarkery či jejich kombinace neumí odlišit jednotlivá stadia nádorového onemocnění a to ani ve zjednodušeném schématu (časné stadium versus pozdní stadium).

MUDr. Marian Kacerovský

Porodnická a gynekologická klinika FN

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové

e-mail: kacermar@fnhk.cz