Zvýšení hladin TFF3 u žen s karcinomem endometria

Souhrn

Cíl:
Trefoil peptidy patří do skupiny malých peptidů, jejichž exprese je místně i tkáňově specifická. Tyto peptidy by mohly být využity jako markery nádorového onemocnění dělohy.

Typ studie:
Experimentální studie.

Název a sídlo pracoviště:
Porodnicko-gynekologická klinika FN a LF UP, Olomouc; Oddělení klinické biochemie, Středomoravská nemocniční a.s., Nemocnice Prostějov.

Metodika:
V období od 2012 do 2015 podstoupilo osmdesát devět žen hysteroskopii a biopsii endometria pro krvácení v postmenopauze. U padesáti tří pacientek ve věku (průměr ± standardní odchylka) 63,4 ± 9,5 (33–80) let byl diagnostikován karcinom endometria, u šesti pacientek ve věku 62,9 ± 6,4 (55–74) let byla diagnostikována hyperplazie endometria a třicet pacientek ve věku 63,3 ± 9,3 (48–62) let s histologicky verifikovanou atrofií endometria tvořilo kontrolní soubor. V den výkonu byl každé pacientce odebrán vzorek venózní krve, který byl následně vyšetřen a byly stanoveny hladiny TFF1, TFF2 a TFF3.

Výsledky:
Hladiny TFF3 byly významně vyšší u pacientek s karcinomem endometria, ale ne ve skupině žen s endometriální hyperplazií. Hladiny TFF1 a TFF2 se v jednotlivých histopatologických skupinách významně nelišily.

Závěr:
Prokázali jsme zvýšené hladiny TFF3, ale ne TFF1 a TFF2 u pacientek s karcinomem endometria. U žen s endometriální hyperplazií nebyly hladiny TFF1, TFF2 a TFF3 zvýšeny.

Klíčová slova:
TFF, karcinom, endometriální, trefoil faktor, sérový

ÚVOD

Endometriální karcinom je nejčastějším gynekologickým nádorem a jeho incidence se v České republice (ČR) pohybuje v posledním desetiletí mezi 33–37/100 000 žen/rok. Incidence tohoto nádoru patří v ČR k nejvyšším na světě a v absolutním vyjádření odpovídá 1740 až 1890 nově diagnostikovaných onemocnění za rok [20]. Hlavní diagnosticko terapeutickou modalitou při managementu tohoto onemocnění je chirurgický staging s vyšetřením pánevních a paraaortálních lymfatických uzlin, neboť žádná z dostupných obrazových metod není natolik přesná, aby s jistotou vyloučila jejich metastatické postižení [32]. Takto radikální chirurgický management s sebou nese významnou operační zátěž a nemalé riziko peroperačních a pooperačních komplikací [37]. Ke snížení tohoto rizika by mohla přispět stratifikace pacientek do low-risk a high-risk skupin na podkladě klinických parametrů a molekulárních markerů [19].

Trefoil peptidy (trifoláty) patří do skupiny malých peptidů bohatých na cystein. Byly pojmenovány „trefoil“ peptidy Thimem v roce 1989 [34]. Dosud byly identifikovány tři savčí trefoil peptidy. TFF1 byl objeven v roce 1982 při pátrání po estrogeny indukované mRNA v buněčných liniích karcinomu prsu a ve stejném roce byl objeven spazmolytický peptid (TFF2) při izolaci prasečího inzulinu [13, 15]. Střevní trifolát TFF3 byl původně objeven v roce 1991 u krys [33]. Ve snaze o standardizaci nomenklatury jsou tyto trefoil faktory dnes souhrnně nazývány rodina trifolátových peptidů (TFF). Jednotlivé trifolátové peptidy se tkáňově specificky vyskytují v epiteliálních buňkách lidského gastrointestinálního ústrojí: TFF1 v epiteliálních povrchových foveolárních buňkách celého žaludku, TFF2 v distální části žaludku a v dolních částech Brunnerových žlázek duodena a TFF3 v průběhu celé délky tenkého i tlustého střeva [7, 8, 25, 29, 35]. Jedná se o velmi stabilní molekuly, rezistentní k účinkům kyselin, proteáz i tepelné degradaci [13, 24].

Jejich fyziologický výskyt byl již dokumentován i v dalších tkáních – hypofýze, hypotalamu, slinných žlázách, v děloze a prsní tkáni [9, 23, 27, 28]. U mladých žen se vzorec exprese mění v závislosti na menstruačním cyklu. Produkce TFF3 byla kromě jiných epiteliálních povrchů prokázána i v děložním endometriu [3, 14].

TFF1 byl původně izolován z buněk karcinomu prsu. Od té doby několik studií dokumentovalo vztah mezi TFF peptidy a vznikem neoplazií. Exprese TFF1 byla prokázána u mnoha známých epiteliálních karcinomů, včetně karcinomu prsu, žaludku, slinivky, plic, endometria, vaječníku (zejména mucinózní typ), prostaty a dále některé nádory močového měchýře a děložního čípku [2, 10]. U karcinomu prsu, kde je exprese TFF1 přítomna až u 50 % nádorů, je pozitivita na TFF1 spojena se stavem estrogenových receptorů, odpovědí na hormonální léčbu a příznivou prognózu [4, 5]. U všech ostatních tumorů se zdá být přítomnost TFF1 nezávislá na stavu estrogenových receptorů. V nedávných studiích byly prokázány vyšší sérové hladiny TFF3 u pacientek s endometriálním karcinomem G3 ve srovnání se zdravými kontrolami [21]. Podobně imunohistochemické analýzy ukázaly zvýšenou expresi TFF3 u špatně diferencovaných endometriálních karcinomů [18]. Tyto výsledky ukazují, že trifoláty by v budoucnu mohly sloužit jako sérové markery nádorových a inflamatorních onemocnění. V naší práci jsme se zaměřili na hodnoty sérových hladin TFF1 a TFF2 u pacientek s karcinomem endometria ve srovnání se zdravými kontrolami a pacientkami s hyperplastickým endometriem, které v dostupné literatuře nebyly dosud publikovány.

METODIKA

Soubor pacientek

Tato prospektivní studie byla provedena na Porodnicko-gynekologické klinice Fakultní nemocnice v Olomouci v období říjen 2012 až červen 2015. Studie byla schválena etickou komisí a všechny pacientky potvrdily svou účast ve studii podpisem informovaného souhlasu. Do studované skupiny bylo zařazeno konsekutivně osmdesát devět pacientek, které podstoupily hysteroskopii a izolovanou kyretáž pro postmenopauzální krvácení. U padesáti tří pacientek ve věku (průměr ± standardní odchylka) 63,4 ± 9,5 (33–80) let byl histopatologicky z materiálu získaného při kyretáži diagnostikován karcinom endometria, u šesti pacientek ve věku 62,9 ± 6,4 (55–74) let byla diagnostikována hyperplazie endometria a třicet pacientek ve věku 63,3 ± 9,3 (48–62) let s histologicky verifikovanou atrofií endometria tvořilo kontrolní soubor. Před operačním výkonem byla každé pacientce odebrána venózní krev a odeslána byla na laboratorní vyšetření TFF1, TFF2 a TFF3.

Příprava vzorku

Protokol byl schválen etickou komisí. Vzorky venózní krve byly získány po 12 hodinách na lačno a byly poté centrifugovány (1600 × g, 10 min, +4 ^oC) s následnou separací séra. Poté bylo 200 µl séra rozředěno se 100 µl fosfátového pufru (15 mmol/L, pH 6.5) a deproteinizováno pomocí 100 µL chlazeného etanolu (10 min, -25 °C). Po centrifugaci (14 000 × g, 10 min), byl supernatant filtrován za použití 0,2 µm mikro titračních filtrů a vakuován. Filtrovaný roztok byl poté vložen do HPLC sloupce.

Vyšetření TFF1, TFF2 a TFF3

Způsoby vyšetření TFF1, TFF2 a TFF3 byly vyvinuty firmou Biovendor (Czech Republic, Brno). Všechny parametry byly měřeny při dostatečných analytických charakteristikách; CV < 5 %, CV mezi jednotlivými sériemi < 8 %; a měření analytických charakteristik bylo dokonalejší, než bylo uvedeno v laboratorním manuálu. Všechna měření byla provedena ve stejném časovém období, na biorobotickém analyzátoru DS2 (Dynex, USA), po centrifugaci (alikvotní sérum, chlazená centrifuga, 4 C, 3500/4 min, zmraženy).

VÝSLEDKY

Z hlediska věku se nelišily pacientky ve skupině s karcinomem, s endometriální hyperplazií a v kontrolní skupině. Sérové hladiny TFF1 byly ve skupině s karcinomem endometria na úrovni (průměr ± standardní odchylka) 3,04 ± 3,55 ng/ml (0,48–20,97), ve skupině s hyperplazií endometria byly 2,15 ± 1,14 ng/ml (0,96–4,14) a ve skupině kontrolní 2,47 ± 2,23 ng/ml (0,51–9,52). V sérových hodnotách TFF1 nebyl mezi skupinami statisticky významný rozdíl. Sérové hladiny TFF2 byly ve skupině s karcinomem endometria na úrovni 5,22 ± 4,74 ng/ml (1,06–25,94), ve skupině s hyperplazií endometria byly zjištěny hodnoty 3,19 ± 1,19 ng/ml (1,93–5,14) a ve skupině kontrolní se hodnoty pohybovaly na úrovních 4,2 ± 2,19 ng/ml (0,89–11,33). V sérových hodnotách TFF2 nebyl mezi jednotlivými skupinami zjištěn statisticky významný rozdíl (graf 1, tab. 1). Sérové hladiny TFF3 byly ve skupině s karcinomem endometria na úrovni 1,72 ± 1,52 ng/ml (0,27–11,41), ve skupině s hyperplazií endometria byly hladiny na úrovni 1,27 ± 0,58 ng/ml (0,49–2,93) a ve skupině kontrolní byly zjištěny hodnoty 1,54 ± 2,04 ng/ml (0,26–14,56). Hodnoty TFF3 byly ve skupině pacientek s karcinomem endometria významně vyšší než u pacientek s endometriální hyperplazií a ve skupině kontrolní (graf 2, tab. 1).

DISKUSE

Nové molekulární přístupy ve výzkumu nádorů umožnily v poslední době identifikovat nové onkogeny/tumor supresorové geny, které by mohly hrát roli při rozvoji a progresi endometriálního karcinomu. Fyziologicky jsou trifoláty exprimovány v epitelu gastrointestinálního traktu, a to orgánově specificky. TFF1 je přítomen rovnoměrně ve sliznici žaludku, TFF2 ve sliznici distálního žaludku a duodena a TFF3 ve sliznici tenkého a tlustého střeva [7, 8, 29, 33, 35]. Tato orgánově specifická exprese bývá narušena při ulcerativních a inflamatorních onemocněních, kdy dochází ke zvýšené expresi TFF3 v místě žaludečního vředu [9]. Do současné doby bylo publikováno velmi málo údajů týkajících se významu a funkce trifolátů u karcinomu endometria.

Zvýšená exprese TFF1 byla nalezena u karcinomu prsu, žaludku, pankreatu, plic, endometria, ovaria, prostaty a děložního hrdla [2, 10]. U karcinomu prsu byla exprese TFF1 přítomna v 50 % tumorů a je signifikantně asociována se stavem estrogenových receptorů, citlivostí na hormonální léčbu a s příznivou prognózou [4, 5, 22]. Ve všech ostatních nádorech byla však exprese TFF1 nezávislá na stavu estrogenních receptorů. Zvýšené sérové hladiny TFF1 korelovaly s pokročilostí bronchiálního adenokarcinomu, a zejména specificky gobletového podtypu bronchoalveolárního karcinomu. Současně byly TFF1 pozitivní adenokarcinomy asociovány s horší prognózou než tumory negativní [11]. V naší práci jsme neprokázali zvýšené sérové hladiny TFF1 u pacientek s karcinomem endometria ve srovnání s pacientkami s endometriální hyperplazií nebo normálním endometriem.

TFF2 má velmi krátký biologický poločas a je volně vylučován ledvinami [26]. Jeho koncentrace v žaludeční šťávě vykazují velmi silnou diurnální variabilitu a dosahují nejvyšších hodnot v noci, zatímco v průběhu digesce se jeho hladina silně snižuje [31]. Vymizení TFF2 u geneticky programovaného myšího modelu karcinomu žaludku má za následek zvýšenou proliferaci a větší nádory [6]. TFF2 vykazuje tumor-supresorovou aktivitu v myším pankreatu a brání formaci mucinózních nádorů [38]. Ishibashi et al. nalezli recentně zvýšené sérové hladiny TFF1 a TFF3 u pacientek s karcinomem prsu, zatímco hladiny TFF2 byly vyšší u zdravých kontrol. Autoři tento rozdíl vysvětlují možným vlivem hladin TFF1 a TFF3 na hladinu TFF2 [12]. V naší práci jsme nalezli dvakrát vyšší sérové hladiny TFF2 ve všech sledovaných skupinách, než byly hladiny TFF1 a TFF3. Rozdíly mezi hladinami TFF2 u pacientek s endometriál­ním karcinomem, endometriální hyperplazií a normálním endometriem nebyly statisticky signifikantní.

Z dostupných publikací byla zvýšená exprese TFF3 na úrovni genu a RNA prokázána u endometriálního karcinomu ve srovnání s karcinomem serózním a stejně tak u nízce diferencovaného endometriálního karcinomu ve srovnání s normálním endometriem [16, 18, 30]. Bignotti et al. nalezli zvýšenou imunoexpresi proteinu TFF3 u 79 % nízce diferencovaných karcinomů endometria a u 18 % vzorků normální děložní sliznice [1]. Původ cirkulujících hladin TFF3 není zcela zřejmý, i když TFF3 je exprimováno ve tkáních ženského genitálu a in vitro studie prokázaly, že stejně jako u TFF1 i exprese TFF3 je regulována estrogenem [17]. Chybění fluktuací sérových hladin TFF3 v průběhu menstruačního cyklu však ukazuje, že cirkulující TFF3 pochází převážně z tkání, které nejsou pod vlivem estrogenu [36].

V naší práci jsme nalezli významně zvýšené sérové hladiny TFF3 ve srovnání s hladinami u pacientek s endometriální hyperplazií a benigním histopatologickým nálezem.

ZÁVĚR

Prokázali jsme zvýšené hladiny TFF3, ale ne TFF1 a TFF2 u pacientek s onemocněním karcinomu endometria. Z výsledků naší studie je zřejmé, že TFF3 by mohl hrát roli jako marker onemocnění u pacientek s karcinomem endometria. Další studie jsou nutné pro detailnější objasnění jeho biologické role při rozvoji tohoto onemocnění.

Korespondující autor

Prof. MUDr. Radovan Pilka, Ph.D.

Porodnicko-gynekologická klinika

FN a LF UP

I. P. Pavlova 6

775 20 Olomouc

e-mail: radovan.pilka@fnol.cz