Screening RHD genotypu plodu u RhD negativních žen

Súhrn

Úvod: V České republice se stanovuje na začátku těhotenství RhD krevní skupina, cílem screeningu je diagnostikovat RhD negativní těhotné ženy, které mohou být ohroženy rozvojem RhD aloimunizace, to nastává pouze v případě, že plod je RhD pozitivní. V současné době se prevence RhD aloimunizace provádí bez ohledu na znalost RHD statutu plodu. Již na začátku těhotenství je možné stanovit RHD genotyp plodu neinvazivně z volné fetální DNA cirkulující v mateřské periferní krvi. Problematika screeningového vyšetření RHD genotypu plodu je celosvětově řešena. V některých evropských zemích je vyšetření již rutinně zavedeno, a přispívá tak k optimalizaci prenatální péče o RhD negativní těhotné, aplikace imunoglobulinu je cílená pouze u těhotenství s RhD pozitivním plodem.

Cílem naší práce je zhodnotit klinickou a laboratorní efektivitu screeningu RHD genotypu plodu u RhD negativních žen metodou TaqMan Real-time PCR.

Typ studie: Prospektivní kohortová studie.

Název a  sídlo pracoviště: Porodnicko-gynekologická klinika LF UP a FN Olomouc; Ústav lékařské genetiky LF UP a FN Olomouc; Transfuzní oddělení FN Olomouc; Ústav lékařské biofyziky LF UP Olomouc.

Materiál a  metodika: V  letech 2011–2015 ve Fakultní nemocnici Olomouc bylo provedeno 337 vyšetření RHD genotypu plodu u těhotných žen v I. a II. trimestru a hodnoceno pomocí TaqMan Real-time PCR. Výsledek byl poté ověřen na RHD genotypu novorozence.

Výsledky: Metodika vyšetření RHD genotypu plodu je přesná, spolehlivá a  využitelná v  klinické praxi. Senzitivita byla 97,8 %, specificita byla 98,7 %. Při hodnocení efektivity zavedení neinvazivního screeningu RHD genotypu plodu u RhD negativních žen je nutné současně hodnotit hledisko medicínské, organizační i ekonomické. Důslednější provádění prevence RhD aloimunizace ve skutečně indikovaných případech může vést ke snížení incidence RhD aloimunizace.

Závěr: Z medicínského hlediska je stanovení RHD genotypu plodu u všech RhD negativních žen na začátku těhotenství jednoznačně efektivní. Umožní diagnostikovat přibližně 40 % RhD negativních plodů, kdy ženě není třeba podat IgG anti-D. Stanovení RHD genotypu plodu pomocí metodiky TaqMan Real-time PCR genotypu plodu je využitelné v klinické praxi.

Klíčová slova:

těhotenství – RhD negativní žena – volná fetální DNA – TaqMan Real-time polymerázová řetězová reakce – RHD genotyp plodu – prevence RhD aloimunizace – imunglobulin (Ig) G anti-D

ÚVOD

V České republice (ČR) se u všech těhotných žen v  I. trimestru provádí stanovení krevní skupiny RhD. Cílem screeningu je diagnostikovat asi 15 % RhD negativních žen (v ČR ročně asi 15 000 žen), které mohou být v průběhu těhotenství a při porodu ohroženy rozvojem RhD aloimunizace [2]. Provádění prevence RhD aloimunizace u RhD negativních žen přehledně zobrazuje schéma 1 [15]. RhD negativní žena je však ohrožena rozvojem RhD aloimunizace pouze v  případě, že plod má na povrchu svých erytrocytů přítomen antigen “D“ (je-li RhD pozitivní), jedná se přibližně o 10 % plodů (10 000 ročně). Přítomnost antigenu “D“ lze vyšetřit neinvazivně stanovením genotypu plodu z  volné fetální DNA cirkulující v  periferní krvi těhotné ženy. Znalost RHD genotypu plodu má klinický význam v prenatální péči o RhD negativní ženy, protože 40 % z nich bude mít RhD negativní plod a  preventivní podání IgG anti-D by u  nich nemělo být indikováno (schéma 2).

Možnosti stanovení RHD genotypu plodu jsou různé. Vyšetření genetického materiálu plodu získaného invazivním odběrem (odběr plodové vody, odběr choriových klků) se ke stanovení RHD genotypu plodu nevyužívají. Podle nově publikovaného systematického přehledu je sice riziko potratu velmi nízké, nicméně přetrvává zvýšené riziko rozvoje aloimunizace [21]. S objevem neinvazivního vyšetření volné fetální DNA v roce 1997 v plazmě těhotné ženy nastává nový trend na poli medicíny [14]. Již na začátku těhotenství je možné u RhD negativní ženy stanovit RHD genotyp plodu z volné fetální DNA cirkulující v mateřské periferní krvi. Procentuální zastoupení volné fetální DNA v plazmě těhotných žen je velmi variabilní a pohybuje se nejčastěji v rozmezí 5–10 % v závislosti na délce těhotenství, velikosti placenty, hmotnosti ženy, rizikovém těhotenství atd. [7]. Díky takto nízké fetální frakci je nutné použít citlivou metodu, kterou je např. Real-time PCR (PCR, polymerase chain reaction, polymerázová řetězová reakce). Problematika neinvazivního stanovení RHD genotypu plodu je řešena celosvětově. Incidence RhD inkompatibility se liší v  závislosti na etnickém původu. Přibližně 15 % bělošské populace je RhD negativní, tato vysoká incidence v populaci souvisí s rozšířením screeningu RHD genotypu plodu zejména v Evropě [5]. Dosud publikované práce v ČR byly jen na malém souboru pacientek [10, 25].

Cílem naší práce bylo zhodnotit klinickou a laboratorní efektivitu screeningu RHD genotypu plodu u  RhD negativních žen metodou TaqMan Real-time PCR na rozsáhlém souboru pacientek.

MATERIÁL A METODIKA

V  letech 2011–2015 ve Fakultní nemocnici Olomouc ve spolupráci Porodnicko-gynekologické kliniky, Ústavu lékařské genetiky a transfúzního oddělení bylo na rozsáhlém souboru RhD negativních žen provedeno neinvazivní stanovení RHD genotypu plodu z periferní krve a dále konfirmační vzorky bukálních stěrů novorozenců. Všechny RhD negativní těhotné byly nealoimunizované, kavkazské rasy, průměrný věk žen byl 29 let (nejmladší měla 18 let, nejstarší 40 let), 80 % vyšetření bylo v I. trimestru, medián 12. týden, 20 % vyšetření bylo ve II. trimestru, medián 15. týden. Charakteristiky sledovaného souboru těhotných žen přehledně zobrazuje tabulka 1.

Celkem bylo vyšetřeno 337 RhD negativních těhotných žen, DNA izolovaná z 1 ml plazmy periferní krve těhotné ženy byla izolována pomocí kitu QiaAmp DNA Mini Kit (Qiagen). RHD genotyp těhotné ženy byl stanoven z leukocytů v periferní žilní krvi a RHD genotyp plodu z  volné fetální DNA v plazmě. RHD genotyp plodu byl následně ověřen stanovením RHD genotypu novorozence z bukálního stěru. Všechny analýzy (RHD genotyp ženy/plodu/novorozence) byly provedeny metodikou TaqMan Real Time PCR s  vnitřní kontrolou amplifikace, která je založena na detekci exonu 7 RHD genu a pro vnitřní kontrolu amplifikace byla použita sekvence β-globinu [1].

Statistická analýza

Prediktivní síla proměnných byla kvantifikována na základě standardního souboru statistik: senzitivity, specificity, falešné pozitivity, falešné negativity a celkové přesnosti. Analýzy byly vypočteny pomocí SPSS 23.0.0.1 (IBM Corporation, 2015).

VÝSLEDKY

Celkem se podařilo získat k vyhodnocení 333 „tripletů” (RHD genotyp ženy/plodu/novorozence). Analýza selhala u dvou plazmatických vzorků, pravděpodobně pro nízkou koncentraci volné fetální DNA zřejmě následkem její degradace, intenzita signálu PCR u plodu nebyla detekovatelná. U  dvou vzorků nebylo možné stanovit RHD genotyp plodu z důvodu opakovaného RHD pozitivního nálezu u maternální DNA. Při izolaci a manipulaci s volnou fetální DNA hrozí riziko její kontaminace RHD pozitivní exogenní DNA. Tato kontaminace by vzhledem k malému množství volné fetální DNA mohla být interpretována jako falešně pozitivní výsledek při stanovení RHD genotypu plodu. Avšak falešná pozitivita nepředstavuje zvýšené riziko rozvoje erytrocytární aloimunizace. Zvýšené riziko chybného klinického managementu představuje jen falešná negativita, která v našich výsledcích byla velmi nízká, pouze čtyři plody byly falešně označeny jako RHD pozitivní. Z  tohoto důvodu je nutné používat sérii kontrol amplifikace a kontaminace.

Ná základě vyhodnocení základních statistických parametrů posuzujících prediktivní sílu lze metodu stanovení RHD genotypu vyhodnotit jako velmi přesnou, spolehlivou a využitelnou v klinické praxi.

Výsledky a  parametry screeningového testu přehledně zobrazuje schéma 3.

DISKUSE

Při hodnocení efektivity zavedení screeningu RHD genotypu plodu u  RhD negativních žen je nutné současně hodnotit hledisko medicínské, organizační i ekonomické.

Z medicínského hlediska je stanovení RHD genotypu plodu u všech RhD negativních žen na začátku těhotenství jednoznačně efektivní. Umožní tak diagnostikovat přibližně 40 % RHD negativních plodů, v  ČR se jedná ročně asi o  5000 RhD negativních těhotných žen, kterým není nutné podávat IgG anti-D. IgG anti-D by mělo být podáno pouze v indikovaných případech, protože se vyrábí z plazmy senzibilizovaných dárců, objem produkce je tudíž limitován a občasné výpadky IgG anti-D na trhu mohou být příčinou, že prevence RhD aloimunizace není prováděna adekvátně, což může zvýšit incidenci aloimunizovaných žen. Důslednější provádění prevence RhD aloimunizace ve skutečně indikovaných případech může vést ke snížení incidence RhD aloimunizace a následně i ke snížení incidence hemolytické nemoci plodu a novorozence [18]. V souvislosti s aplikací tohoto krevního produktu se mohou objevit nežádoucí reakce, a ani přes důsledná opatření není vyloučeno riziko přenosu virových onemocnění. V 80. letech bylo v souvislosti s podáním imunoglobulinu nakaženo 704 žen virem hepatitidy C [12]. V současné době je plazma senzibilizovaných dárců vyšetřována na HBsAg, anti HIV a HCV protilátky, ale možný je i přenos nemocí, na které není dosud žádné testování (priony). Anafylaktická reakce se popisuje na 1:100 000 podání [19].

Rutkowski uvádí tři kazuistiky hypersenzitivity po podání imunoglobulinu a  navrhuje vhodný management v péči o těhotné se známou hypersenzitivitou na imunoglobulin [20]. Podle SmPC (souhrn údajů o léčivém přípravku) registrovaných přípravků v ČR je doporučeno sledovat pacientku nejméně 20 minut po podání, může dojít k alergické reakci na IgG anti-D. Příznaky zahrnují kožní projevy, a  to i  generalizovaný exantém, tlak na hrudníku, dušnost, hypotenzi a  anafylaxi [24]. Přípravky obsahují malé množství IgA. Jedinci s nedostatkem IgA mají potenciál ke vzniku IgA protilátek a anafylaktických reakcí po podání krevních složek obsahujících IgA. Vzácně může aplikace vyvolat pokles krevního tlaku s anafylaktickým šokem i u pacientek, které předchozí léčbu lidským imunoglubulinem snášely. Medicínský význam screeningového vyšetření RHD genotypu plodu je tedy nesporný.

V některých zemích je screeningové neinvazivní vyšetření RHD genotypu zavedeno do klinické praxe. Pouze RhD negativní matky RhD pozitivních plodů dostávají rutinní antenatální anti-D profylaxi. Jedná se o státy v Evropě, což souvisí s  vysokou incidencí RhD negativních žen v  populaci. Přehled zemí a  publikovaných výsledků screeningu RHD genotypu plodu u RhD negativních žen v  rámci strategie provádění prevence RhD aloimunizace zobrazuje tabulka 2.

V Dánsku a Nizozemsku je již screeningové neinvazivní vyšetření RHD genotypu plodu implematováno do klinické praxe. Vyšetření se provádí ve 27. týdnu těhotenství, v případě RhD pozitivního plodu není imunoglobulin G anti-D těhotné ženě podán [4, 8]. V Norsku bylo zavedeno neinvazivní stanovení do rutinního používání od září 2016. Aby se snížil počet RhD aloimunizovaných, odběr se provádí ve 24. týdnu těhotenství, vyšetřuje se exon 7 a 10 [23]. Rutinní užití je i ve Finsku od roku 2014, kdy cílenou profylaxi dostávají pouze ženy nesoucí RhD pozitivní plod [9]. Ve Švédsku se od roku 2016 provádí screening již v prvním trimestru, což umožňuje dále i cílené použití imunoglobulinu G anti-D po invazivních výkonech v časném těhotenství a pozdních potratech [28]. V ostatních zemích Evropy, například Belgii, Irsku, Velké Británii, ČR, Francii a Německu, je dostupné prenatální vyšetření RHD genotypu jen v určitých regionech [3, 6, 16, 22, 27]. V USA je na trhu komerční vyšetření SensiGen RhD od firmy Sequenom [17]. V Kanadě byly v  roce 2017 zahájeny kroky k  implementaci screeningového vyšetření RHD genotypu [11]. V naší práci bylo 80 % vyšetření provedeno právě v I. trimestru. V zemích se zavedeným screeningem je, kromě Švédska, vyšetření prováděno až ve II. trimestru, vhodné je přesunout vyšetření do časného stadia těhotenství (I. trimestr), a využít tak znalost RHD genotypu plodu k optimální péči o RhD negativní těhotné, což potvrzují mnohé studie [9]. Podle mnohých populačních studií stanovení RHD genotypu plodu je spolehlivé, přesné a využitelné v klinické praxi, což je ve shodě s našimi výsledky. Z hlediska organizačního a ekonomického by mělo být vyšetření dostupné pro všechny RhD negativní těhotné ženy [18, 26].

ZÁVĚR

Trend screeningového stanovení RHD genotypu plodu v jednotlivých evropských zemích je zjevný, přispívá k optimalizaci prenatální péče o RhD negativní těhotné, aplikace IgG anti-D je cílená pouze u těhotenství s RhD pozitivním plodem a u 40 % těhotenství (plod RhD negativní) není těhotné ženě třeba podat IgG anti-D. Podle naší práce je stanovení RHD genotypu plodu s využitím exonu 7 pomocí TaqMan Real-time PCR přesné a využitelné v klinické praxi.

Podpořeno grantem IGA MZ ČR NT-12225-4/2011. Podpořeno MZ ČR – RVO (FNOl, 00098892).

MUDr. Tereza Kratochvílová

Porodnicko-gynekologická klinika LF UP a FN

I. P. Pavlova 6

775 20 Olomouc

e-mail: terka.dolezalova@seznam.cz