Zvýšení sérových hladin S100–A11 a AIF-1 u pacientek s dysplazií děložního hrdla

Súhrn

Cíl studie: Cílem této experimentální studie bylo porovnat sérové hladiny TFF3, AIF-1, S100–A11 a DKK1 u pacientek s dysplazií hrdla děložního a u zdravých kontrol.

Metodika: Do prvního souboru bylo zařazeno 59 pacientek s histologickou dia­gnózou prekancerózy CIN 1. Do druhého souboru bylo zařazeno 198 pacientek s histologickou dia­gnózou prekancerózy CIN 2 nebo CIN 3. Kontrolní skupinu tvořilo 90 pacientek, které podstoupily jakoukoli hysterektomii pro nemaligní gynekologické onemocnění. Před operačním výkonem byla každé pacientce odebrána venózní krev a odeslána na laboratorní vyšetření sérové hladiny TFF3, S100–A11, AIF-1 a DKK1.

Výsledky: Sérové hladiny S100–A11 (p < 0,0001) a AIF-1 (p < 0,0001) byly statisticky významně vyšší u pacientek s prekancerózou CIN 1 než u kontrolní skupiny. Hladiny TFF3 a DKK1 se u pacientek s CIN 1 a kontrolní skupinou statisticky významně nelišily. Sérové hladiny S100–A11 (p < 0,0001) a AIF-1 (p < 0,0001) byly statisticky významně vyšší u pacientek s prekancerózou CIN 2/3 než u kontrol. Hladiny TFF3 a DKK1 se u pacientek s CIN 2/3 v porovnání s kontrolní skupinou statisticky významně nelišily.

Závěr: S100–A11 a AIF-1 představují potenciální bio­markery u pacientek s dysplazií děložního hrdla.

Klíčová slova:

onkogynekologie – cervikální dysplazie – biomarkery – prekanceróza hrdla děložního – S100–A11 – TFF3 – AIF-1 – DKK1

Úvod

Cervikální intraepiteliální neoplazie (CIN) je přednádorové postižení děložního čípku. Ektocervix je pokryt vrstevnatým dlaždicovým epitelem a endocervix je pokryt žlázovým epitelem. CIN označuje abnormality vrstevnatého dlaždicového epitelu a má tři stupně  závažnosti:

• CIN 1 (LSIL – low-grade squamous intraepithelial lesion);
• CIN 2;
• CIN 3 (HSIL – high-grade squamous intraepithelial lesion) [1].

Léze nízkého stupně je CIN 1, jedná se o atypické buněčné změny v dolní třetině epitelu. CIN 2 je považována za lézi vysokého stupně, jedná se o středně atypické buněčné změny omezené na bazální dvě třetiny epitelu se zachováním epiteliálního zrání. CIN 3 je léze vysokého stupně, kde atypické buněčné změny zahrnují více než dvě třetiny tloušťky epitelu a zahrnují též léze postihující celou tloušťku epitelu [1].

Studované sérové bio­markery

Trefoil faktor 3 (TFF3) je protein, který byl v roce 1991 objeven u krys [2]. Trifoláty jsou skupinou malých polypeptidů bohatých na cystein. Jsou exprimovány ve tkáních, které obsahují buňky produkující hlen, obzvláště v gastrointestinálním traktu a jiných epiteliálních tkáních. V roce 1989 byly pojmenovány Thimem jako „trefoil“ peptidy a dosud byly identifikovány tři: TFF1, TFF2 a TFF3 [3]. Bylo prokázáno, že sérové hladiny TFF3 jsou významně vyšší u pacientek s karcinomem endometria než u pacientek s endometriální hyperplazií a u kontrol [4].

Allograft inflammatory factor 1 (AIF-1)  je protein nacházející se v cytoplazmě buněk a byl objeven roku 1995 u krys [5]. U proteinu AIF-1 byla prokázána zvýšená exprese u karcinomu hrdla děložního, není ovšem známo, jak se na patogenezi tohoto onemocnění podílí [6].

Proteiny rodiny S100 mají poměrně nízkou molekulovou hmotnost a do současnosti jich bylo objeveno již 25. Proteiny S100 jsou asociovány s různými nádorovými onemocněními, ačkoli ve většině případů není funkce S100 proteinů v nádorových buňkách stále známá [7]. U námi studovaného proteinu S100–A11 byla v literatuře publikována asociace s karcinomem prsu, slinivky břišní, žaludku, močového měchýře, prostaty a ledvin. U karcinomu hrdla děložního byla prokázána asociace s hladinou proteinu S100–A9 [8].

Dickkopf-related proteins (DKK) jsou rodina sekrečních proteinů, jsou celkem čtyři: DKK1, DKK2, DKK3 a DKK4. Mají molekulovou hmotnost 24–38 kDa [9]. DKK1 je protein, který je exprimován převážně osteoblasty a stromálními buňkami kostní dřeně a je u lidí kódován genem DKK1 [10]. Zvýšené hladiny DKK1 v kostní dřeni, plazmě a periferní krvi jsou spojeny s přítomností osteolytických kostních lézí u pacientů s mnohočetným myelomem, protože DKK1 zřejmě blokuje diferenciaci osteoblastů. DKK1 se pravděpodobně uplatňuje fyziologicky v lidské kůži v pigmentačních vzorcích končetin, palmární a plantární fibroblasty vylučují DKK1, který inhibuje melanocyty, jejich růst a diferenciaci a to může vysvětlit charakteristicky lehčí pigmentaci na palmě rukou a plantě nohou [11].

V současné době není dostupný žádný způsob, který by umožňoval spolehlivě predikovat individuální riziko progrese cervikální dysplazie LSIL směrem k HSIL, případně ke karcinomu.

Cílem této studie bylo porovnat sérové hladiny TFF3, AIF-1, S100–A11 a DKK1 u pacientek s dysplazií hrdla děložního a u zdravých kontrol.

Metodika

Tato prospektivní experimentální studie probíhala od října 2012 do června 2015 na Porodnicko-gynekologické klinice Fakultní nemocnice v Olomouci a v Centru ambulantní gynekologie a primární péče v Brně. Studie byla schválena lokální etickou komisí a všechny pacientky potvrdily svou účast ve studii podpisem informovaného souhlasu.

Do prvního souboru bylo zařazeno 59 pacientek s histologickou dia­gnózou prekancerózy CIN 1. Tyto pacientky podstoupily konizaci hrdla děložního. Průměrný věk pacientek v tomto souboru byl 37,9 let (SD 11,2), medián 37 let, nejmladší pacientka měla 19 let a nejstarší 69 let.

Do druhého souboru bylo zařazeno 198 pacientek s histologickou dia­gnózou prekancerózy CIN 2 nebo CIN 3. Tyto pacientky podstoupily konizaci hrdla děložního. Průměrný věk pacientek v tomto souboru byl 34,6 let (SD 10,9), medián 32,5 let, nejmladší pacientka měla 18 let a nejstarší 87 let.

Kontrolní skupinu tvořilo 90 pacientek, které podstoupily jakoukoli hysterektomii pro nemaligní gynekologické onemocnění. Průměrný věk pacientek v tomto souboru byl 41,6 let (SD 11,9), medián 41 let, nejmladší pacientka měla 15 let a nejstarší 77 let. Před operačním výkonem byla každé pacientce odebrána venózní krev a odeslána na laboratorní vyšetření sérové hladiny TFF3, S100–A11, AIF-1 a DKK1.

U všech pacientek byly předoperačně odebrány vzorky séra po 12 hod lačnění. Poté byly vzorky centrifugovány (1 600 × g, 10 min, +4 °C) a následně byla provedena separace séra. Dále bylo 200 µl séra rozředěno se 100 µl fosfátového pufru (15 mmol/l, pH 6,5) a dále deproteinizováno pomocí 100 µl chlazeného etanolu (10 min, –25 °C). Po další centrifugaci (14 000 × g, 10 min) byl supernatant filtrován za použití titračních filtrů a vakuován, filtrovaný roztok byl vložen do HPLC (high-performance liquid chromatography) sloupce. Všechna séra byla skladována při teplotě –80 °C až do analýzy hladin TFF3, AIF-1, S100–A11 a DKK1.

Statistické vyhodnocení dat bylo provedeno ve spolupráci s Ústavem lékařské bio­fyziky Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci. Ke statistickému zpracování dat byl použit statistický software IBM SPSS Statistics for Windows, Version 23.0. (Armonk, NY: IBM Corp).

Korelace byly testovány Mann-Whitneyovým U-testem. Vodorovná čára v krabicovém grafu znázorňuje hodnotu mediánu, dolní hrana krabice hodnotu 1. kvartilu (25. percentilu), horní hrana hodnotu 3. kvartilu (75. percentilu). Anténky ukazují maximální a minimální naměřené hodnoty. Pokud byly v souboru nalezeny odlehlé a extrémní hodnoty, jsou zakresleny kroužky a hvězdičkami (graf 1, 2).

Výsledky

Sérové hladiny S100–A11 (p < 0,0001) a AIF-1 (p < 0,0001) byly statisticky významně vyšší u pacientek s prekancerózou CIN 1 v porovnání s kontrolní skupinou, což je znázorněno na grafech 1 a 2. Hladiny TFF3 a DKK1 se u pacientek s CIN 1 a kontrolní skupinou statisticky významně nelišily. Sérové hladiny S100–A11 byly ve skupině s CIN 1 na úrovni (průměr ± směrodatná odchylka) 15,3 ± 16,2 ng/ml (2,9–105,5), ve skupině kontrolní byly 8,5 ± 7,8 ng/ml (1,6–51,4). Sérové hladiny AIF-1 byly ve skupině s CIN 1 na úrovni (průměr ± směrodatná odchylka) 1 056,6 ± 943,2 pg/ml (256,0–5 389,0), ve skupině kontrolní byly 629,3 ± 426,8 pg/ml (155,0–2 595,1). Sérové hladiny TFF3 byly ve skupině s CIN 1 na úrovni (průměr ± směrodatná odchylka) 3,3 ± 3,2 ng/ml (0,7–10,7), ve skupině kontrolní byly 3,7 ± 3,6 ng/ml (0,3–13,7). Sérové hladiny DKK1 byly ve skupině s CIN 1 na úrovni (průměr ± směrodatná odchylka) 2,9 ± 1,0 ng/ml (1,2–7,1), ve skupině kontrolní byly 2,6 ± 1,1 ng/ml (0,6–5,3) (tab. 1).

Sérové hladiny S100–A11 (p < 0,0001) a AIF-1 (p < 0,0001) byly statisticky významně vyšší u pacientek s CIN 2/3 než u kontrol, což je znázorněno na grafech 1 a 2. Hladiny TFF3 a DKK1 se u pacientek s CIN 2/3 a kontrolní skupinou statisticky významně nelišily. Sérové hladiny S100–A11 byly ve skupině s CIN 2/3 na úrovni (průměr ± směrodatná odchylka) 18,0 ± 15,4 ng/ml (0,2–85,5), ve skupině kontrolní byly 8,5 ± 7,8 ng/ml (1,6–51,4). Sérové hladiny AIF-1 byly ve skupině s CIN 2/3 na úrovni (průměr ± směrodatná odchylka) 1 188,2 ± 777,7 pg/ml (83,7–3 887,9), ve skupině kontrolní byly 629,3 ± 426,8 pg/ml (155,0–2 595,1). Sérové hladiny TFF3 byly ve skupině s CIN 2/3 na úrovni (průměr ± směrodatná odchylka) 4,0 ± 3,6 ng/ml (0,5–17,6), ve skupině kontrolní byly 3,7 ± 3,6 ng/ml (0,3–13,7). Sérové hladiny DKK1 byly ve skupině s CIN 2/3 na úrovni (průměr ± směrodatná odchylka) 2,9 ± 0,9 ng/ml (0,1–5,5), ve skupině kontrolní byly 2,6 ± 1,1 ng/ml (0,6–5,3) (tab. 2).

Diskuze

Imunocytochemické bio­markery u cervikálních dysplazií

Biomarker bývá definován jako měřitelný indikátor určitého bio­logického stavu či podmínek. Cílem imunocytochemických a imunohistochemických metod je detekce specifických antigenních determinant s využitím imunologické vazby. U dysplazií děložního hrdla jsou využívány bio­markery z onkologické cytologie, které zpřesňují prediktivní hodnotu cytologického vyšetření. Tyto bio­markery se detekují pomocí imunocytochemických technik, kdy dochází ke zvýraznění abnormálních buněk pomocí barvení. Pomocí bio­markeru Ki-67 je možno detekovat zvýšenou proliferaci buněk, ke které dochází, pokud jsou tyto buňky infikovány HPV (human papilloma virus) infekcí. Dalším bio­markerem, který má vysokou senzitivitu i specificitu pro dysplazii hrdla děložního, je p16, jeho exprese výrazně narůstá při infekci buněk vysoce rizikovými typy HPV. Při screeningu karcinomu děložního hrdla je možno využít i duální imunocytochemický test p16/Ki-67. U LSIL lézí je možno detekovat HPV L1 kapsidový protein, v HSIL lézích mizí. Vysokou senzitivitu i specificitu pro detekci buněk infikovaných HPV má činidlo BD ProEx C, které obsahuje protilátky proti dvěma specifickým jaderným proteinům [12].

Imunohistochemické bio­markery u cervikálních dysplazií

Imunohistochemické metody využívají protilátky k lokalizaci a vizualizaci tkáňových antigenů. LCoR (ligand-dependent corepressor) a RIP140/NRIP1 (receptor-interacting protein 140) hrají důležitou roli v regulaci četných onkogenních signálních drah a v rozvoji nádorového onemocnění. Byla publikována studie, která prokazuje zvýšenou jadernou expresi LCoR u progrese dysplazie do stadia CIN 2, což dokazuje určitou prognostickou hodnotu tohoto bio­markeru u cervikálních prekanceróz. Byla také prokázána signifikantně vyšší exprese RIP140 u stadia CIN 3 v porovnání se stadii CIN 1 a 2, což naznačuje jeho potenciální roli v rozvoji prekanceróz hrdla děložního [13].

Exprese PBK/TOPK (PDZ-binding kinase/T-LAK cell-originated protein kinase) je významně asociována s CIN i s karcinomem hrdla děložního [14]. Dále byla například prokázána zvýšená exprese PD L1 (programmed death ligand 1) v buňkách postižených CIN či karcinomem hrdla děložního. Jedná se o bio­marker probíhající HPV infekce v těchto buňkách [15].

Sérové bio­markery u cervikálních dysplazií

U cervikálních dysplazií byla prokázána zvýšená sérová hladina miR-196a, ORM2 (orosomucoid 2) a proteinu F9. Zvýšená sérová hladina miR-196a je asociována se stadiem CIN i progresí do cervikálního karcinomu [16]. U proteinu ORM2 byla prokázána zvýšená sérová hladina u pacientek s cervikální prekancerózou ve srovnání s kontrolní skupinou. Dále bylo v této studii prokázáno konzistentní zvyšování sérové hladiny proteinu F9 při progresi léze z LSIL na HSIL a cervikální karcinom [14]. Výše uvedené sérové bio­markery mohou společně s proteiny S100–A11 a AIF-1 v budoucnosti sloužit jako dia­gnostické markery či být terapeutickými cíli u pacientek s prekancerózou hrdla děložního.

Závěr

Velmi rychle narůstá množství informací o proteinech TFF3, AIF-1, S100–A11, DKK1 a jejich fyziologickém i patofyziologickém významu. V naší práci jsme prokázali statisticky významné zvýšení sérových hladin S100–A11 a AIF-1 u všech stadií cervikální intraepiteliální neoplazie. K využití těchto bio­markerů v běžné klinické praxi je potřeba dalších randomizovaných prospektivních studií a metaanalýz.

Obdrženo/Submitted: 24. 11. 2020

Přijato/Accepted: 28. 12. 2020

MUDr. Martin Maděrka

Porodnicko-gynekologická klinika

LF UP a FN Olomouc

I. P. Pavlova 6

775 20 Olomouc

maderka. m@gmail.com