Význam měření pupečníkového interleukinu-6, prokalcitoninu a C-reaktivního proteinu v diagnostice systémové zánětlivé odpovědi plodu

Súhrn

Cíl studie: Systémová zánětlivá odpověď plodu (FIRS – fetal inflammatory response syndrome) je závažná komplikace asociovaná se zvýšenou neonatální morbiditou a mortalitou. Včasná dia­gnostika FIRS je zásadní pro detekci rizikových skupin novorozenců. Cílem práce bylo zhodnotit korelaci hladin interleukinu-6 (IL-6), prokalcitoninu (PCT) a C-reaktivního proteinu (CRP) v pupečníkové krvi s histologicky prokázanou funisitidou/ chorioamnionitidou u vysoce rizikové populace novorozenců po předčasném porodu. Metodika: Odběr pupečníkové krve ke stanovení zánětlivých bio­markerů byl proveden okamžitě po porodu placenty a přerušení pupečníku. Zánětlivé změny v pupečníku a placentě byla hodnoceny recentním skórovacím systémem (Amsterdam Placental Workshop Group Consensus). Výsledky: Do studie bylo zařazeno 100 novorozenců (30,5 ± 2,5 týden těhotenství, porodní hmotnost 1 443 ± 566 g) po předčasném porodu a 21 zdravých donošených novorozenců. Histologicky byla chorioamnionitida dia­gnostikována u 19 % a chorioamnionitida s funisitidou u 7 % případů. Kritéria FIRS (funistis a/ nebo umbilikální IL-6 > 11 ng/ l) splnilo 33 novorozenců (33 %). FIRS statisticky signifikantně koreloval s leukocytózou u matky (p < 0,001), předčasným odtokem plodové vody (p < 0,001) a předčasnou děložní aktivitou (p < 0,0001) ve srovnání se skupinou bez FIRS. Hladiny zánětlivých parametrů (IL-6, PCT, CRP) v pupečníkové krvi byly statisticky signifikantně vyšší u skupiny FIRS pozitivní ve srovnání s nedonošenými a donošenými kontrolami (p < 0,0001). Kombinovaná mortalita a morbidita (bronchopulmonální dysplazie, intraventrikulární krvácení, periventrikulární leukomalacie) byla vyšší u novorozenců s FIRS (28,1 %) ve srovnání s novorozenci bez FIRS (22,4 %). Rozdíl však nebyl statisticky významný (p = 0,53). Závěr: Studie potvrdila korelaci mezi hladinami zánětlivých bio­markerů (IL-6, PCT, CRP) v pupečníkové krvi a přítomnost FIRS. Nebyl potvrzen signifikantně negativní vliv FIRS na neonatální morbiditu a mortalitu. Výsledek může být ovlivněn velikostí souboru a designem studie (zařazení pouze případů po porodu císařským řezem).

Klíčová slova:

systémová zánětlivá odpověď plodu – neonatální mortalita – morbidita – interleukin-6 – C-reaktivní protein – prokalcitonin – chorioamnionitida a funisitida

Úvod

Systémová zánětlivá odpověď plodu (FIRS – fetal inflammatory response syndrome) je dominantně reakcí plodu na infekční inzult při mikrobiální invazi do amniální dutiny. Mikrobiální organizmy mohou expandovat z amniové dutiny do orgánů a systémové cirkulace plodu s následným rozvojem FIRS [1].

FIRS je ekvivalentem systémové zánětlivé odpovědi (SIRS – systemic inflam­matory response syndrome), ale na rozdíl od SIRS nelze u FIRS definovat klinické symptomy sepse a multiorgánové dysfunkce. FIRS můžeme dia­gnostikovat prenatálně – odběr krve plodu při kordocentéze a stanovení hladiny interleukinu-6 v krvi plodu (IL-6 > 11 ng/ ml). Postnatální dia­gnostika FIRS může být provedena stanovením koncentrace IL-6 v pupečníkové krvi odebrané po porodu plodu nebo histopatologickým vyšetřením placenty, pupečníku a plodových obalů. Histopatologickým obrazem FIRS je nález zánětu v pupečníku (funisitida) a/ nebo perivaskulární infiltrace na choriové plotně [2].

FIRS je asociován se signifikantně zvýšeným rizikem časné novorozenecké sepse (relativní riziko, RR = 3,1) a závažnými neonatálními komplikacemi: syndrom dechové tísně (RR = 2,4), intraventrikulární krvácení (RR = 4,9), periventrikulární leukomalacie (RR = 3,3), bronchopulmonální dysplazie (RR = 5,9) včetně zvýšeného rizika úmrtí (RR = 7,0). FIRS je spojen i s vyšším rizikem vzniku progresivních forem retinopatie nedonošených a neonatální systémové zánětlivé odpovědi, která se manifestuje klinicky jako neonatální sepse s negativní hemokulturou a negativní kultivací mozkomíšního moku [2,3].

Dia­gnostika FIRS je relativně obtížná (IPD – invazivní prenatální dia­gnostika), ale zásadní pro detekci vysoce rizikových skupin novorozenců k rozlišení FIRS a neonatálního SIRS.

Cílem práce bylo zhodnotit neonatální morbiditu u FIRS a korelaci hladin zánětlivých parametrů (IL-6, prokalcitonin, C-reaktivní protein) v pupečníkové krvi s histologicky prokázanou funisitidou/ chorioamnionitidou u novorozenců po předčasném porodu.

Soubor a metodika

Prospektivní kohortová studie byla realizována v perinatologickém centru Ústavu pro péči o matku a dítě (ÚPMD) v období 1/ 2017–12/ 2019. Kritériem pro zařazení do studie byl plánovaný porod císařským řezem ≤ 34. týden těhotenství. Indikacemi k operativnímu porodu byly maternální, fetální a/ nebo kombinované komplikace. Do studie nebyly zařazeny případy s prenatálně dia­gnostikovanými vrozenými vývojovými vadami, vaginálně vedené předčasné porody, mrtvěrození novorozenci a novorozenci s nutností resuscitace na porodním sále. Informovaný souhlas se zařazením do studie (schválený etickou komisí ÚPMD, no. 2015/ 06-02-4) byl získán před plánovaným porodem u všech hodnocených subjektů. Klinická data byla hodnocena z denních záznamů a klinické databáze perinatologického centra.

Histopatologické hodnocení závažnosti chorioamnionitidy a funisitidy

Placenty byly okamžitě po vybavení fixovány ve fosfátovém formolu (4% for­maldehyd ve fosfátovém pufru) a dále zpracovány standardním způsobem certifikovaným patologem. Při histologickém vyšetření byly akutní zánětlivé změny v placentě, pupečníku a obalech definovány přítomností neutrofilní zánětlivé celulizace.

Pro histopatologické hodnocení závažnosti zánětlivých změn v pupečníku a placentě byla použita recentní klasifikace Amsterdam Placental Workshop Group Consensus Statement [4]. Klasifikační systém je založen na rozdělení zánětlivé odpovědi na maternální a fetální část, podle původu hodnocených neu­trofilních granulocytů. U maternální zánětlivé odpovědi je hodnocen rozsah zánětlivých změn placentárních struktur s mateřskými neutrofilními granulocyty (které jsou původem z vén deciduy a z krve intervilózních prostorů). U fetální zánětlivé odpovědi se jedná o hodnocení přítomnosti a množství fetálních neutrofilních granulocytů (z fetální cirkulace) ve stěně povrchových cév choriové plotny (chorionická vaskulitida), ve stěně jednotlivých cév pupečníku, případně ve Whartonově rosolu. Klasifikační systém ukazuje tab. 1.

Odběr pupečníkové krve

Odběr pupečníkové krve (1 ml) byl proveden venepunkcí umbilikální vény okamžitě po porodu placenty a přerušení pupečníku. Krevní elementy byly měřeny automatickým hematologickým analyzátorem (Nihon Kohden Celltac G, Tokyo, Japan), elementy bílé řady byly detekovány manuálně. Hladina CRP byla měřena immune-turbidometricky (Cobas 6000, c501 module, Roche Dia­gnostics, Mannheim, Germany). Dolní limit pro stanovení CRP byl 0,3 mg/ l. Sérové hladiny IL-6 a PCT (prokalcitonin) byly stanoveny pomocí metody elektrochemiluminiscentního immunoassay (Cobas 6000, e601 module, Roche Dia­gnostics, Mannheim, Germany). Zánětlivé parametry byly u kontrolní skupiny měřeny pouze z pupečníkové krve.

Kritéria systémové zánětlivé odpovědi plodu (FIRS)

Do skupiny FIRS pozitivní byli zařazeni novorozenci s koncentrací IL-6 > 11 ng/ l v pupečníkové krvi odebrané po porodu a novorozenci s prokázaným histopatologickým nálezem zánětu v pupečníku (funisitida).

Dia­gnostika časné novorozenecké sepse (EOS – early onset sepsis)

Časná novorozenecká sepse (v prvních 72 hod života) byla dia­gnostikována na základě vyšetření hemokultury, klinických příznaků a laboratorních bio­markerů sepse. Novorozenci s pozitivní hemokulturou a pozitivními klinickými známkami infekce byli klasifikováni jako skupina „prokázaná sepse“, novorozenci s negativní hemokulturou, ale s přítomností klinických známek infekce a pozitivitou alespoň dvou z následujících laboratorních bio­markerů infekce (leukocytóza > 20 000/ μl, leukopenie < 5 000/ μl, trombocyto­penie < 100/ μl, poměr I/ T > 0,2, CRP ≥ 10 mg/ l) byli klasifikováni jako „klinická sepse“. Skupina „neprokázaná sepse“ zahrnuje pacienty s negativní hemokulturou, bez klinických nebo laboratorních známek infekce, a dále novorozence nesplňující výše uvedená kritéria sepse.

Neonatální morbidita

Neonatální komplikace (syndrom dechové tísně, patent ductus arteriosus, intraventrikulární krvácení, nekrotizující enterokolitida, periventrikulární leukomalacie, retinopatie nedonošených, bronchopulmonální dysplazie) byly definovány podle databáze Vermont Oxford [5].

Statistická analýza

Data byla statisticky analyzována softwarem IBM SPSS Statistics 23.0.0.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Demografické a klinické parametry jsou vyjádřeny deskriptivními statistickými metodami (procenta, medián s minimálními a maximálními hodnotami, průměry se standardní odchylkou). Chí-kvadrát a Mann-Whitneyho U test byly použity při srovnání nerovnoměrně rozložených proměnných. Statistická signifikance byla vyjádřena hladinou významnosti p < 0,05.

Výsledky

V rámci prospektivní observační studie bylo zhodnoceno 100 novorozenců (průměrný týden těhotenství 30,5 ± 2,5, průměrná porodní hmotnost 1 443 ± 566 g). Histologicky byla chorioamnionitida dia­gnostikována u 19 % a chorioamnionitida s funisitidou u 7 % případů. Jedno a/ nebo dvě kritéria FIRS (funisitida + IL-6 pozitivita) splnilo 33 novorozenců (33 %). Histopatologické nálezy v placentě a základní charakteristika souboru jsou uvedeny v tab. 2.

Kontrolní skupinou byla kohorta 21 zdravých donošených novorozenců (gestační stáří 39,0 ± 0,5 týden těhotenství, porodní hmotnost 3 420 ± 370 g, medián ± SD), kteří se narodili elektivním císařským řezem z indikace matky a/ nebo patologické polohy plodu.

FIRS statisticky signifikantně koreloval s leukocytózou u matky (36 vs. 15 %; p < 0,001), předčasným odtokem plodové vody (42 vs. 25 %; p < 0,001) a předčasnou děložní aktivitou (45 vs. 22 %; p < 0,0001) ve srovnání se skupinou non-FIRS. Nebyl nalezen signifikantní rozdíl ve frekvenci fetální růstové restrikce (24 % ve skupině FIRS vs. 32 % ve skupině non-FIRS).

Měřené zánětlivé parametry (IL-6, PCT, CRP) v pupečníkové krvi byly statisticky signifikantně vyšší u skupiny FIRS pozitivní ve srovnání s nedonošenými a donošenými kontrolami. Průměrná hodnota pupečníkového IL-6 byla u kontrolní skupiny 5,5 ± 2,9 ng/ l. Srovnání koncentrace IL-6 v pupečníkové krvi prezentuje graf 1. Nebyl nalezen statisticky významný rozdíl mezi hodnotami pupečníkového IL-6, PCT a CRP u kontrolní skupiny a skupiny nedonošených. Skupina FIRS pozitivní měla signifikantně nižší gestační stáří novorozenců, ale nelišila se statisticky signifikantně v porodní hmotnosti (tab. 3).

Zvýšené hodnoty zánětlivých parametrů (IL-6, PCT, CRP) v pupečníku korelovaly s histologicky prokázanou chorioamnitidou a se zvýšením zánětlivých parametrů u novorozenců při prvním vyšetření po narození (tab. 3).

Celková mortalita (4 %) a incidence závažné neonatální morbidity byly relativně nízké (1 % intraventrikulární krvácení ≥ III. stupně, 0 % periventrikulární leukomalacie, 19 % bronchopulmonální dysplazie, 0 % prokázaná časná novorozenecká sepse). Vzhledem k nízké četnosti jednotlivých komplikací byla hodnocena kombinovaná morbidita.

Kombinovaná mortalita a morbidita (bronchopulmonální dysplazie, intraventrikulární krvácení, periventrikulární leukomalacie) byla vyšší u novorozenců s FIRS (28,1 %) ve srovnání s novorozenci bez FIRS (22,4 %). Rozdíl však nebyl statisticky významný (p = 0,53).

Diskuze

Systémová zánětlivá odpověď plodu (FIRS) je závažná zánětlivá komplikace, která může signifikantně ovlivnit výsledky perinatální péče. Racionální a včasná dia­gnostika FIRS zůstává nadále jednou z nejdůležitějších oblastí fetomaternální medicíny. Histopatologické vyšetření placenty se stanovením stadia a stupně zánětlivého procesu je zásadní dia­gnostická metoda s jednoznačnými klinickými, ale i forenzními konsekvencemi.

Pro histopatologické hodnocení závažnosti akutní chorioamnionitidy existuje několik možných klasifikací. V rámci studie byla zavedena recentní histopatologická klasifikace dle Amsterdam Placental Workshop Group Consensus Statement [4]. Klasifikační systém je založen na rozdělení zánětlivé odpovědi na maternální a na fetální část, dle původu hodnocených neutrofilních granulocytů. Chorioamnionitida byla identifikována v 19 % případů, ale funisitida pouze v 7 %. Prevalence chorioamnionitidy odpovídá publikovaným studiím, ale podíl funisitidy byl v naší skupině relativně nízký [6]. Důvodem nižšího zastoupení funisitidy je pravděpodobně design studie, který byl zaměřen primárně na hodnocení zánětlivých bio­markerů a histopatologické vyšetření bylo pouze komplementární ke stanovení dia­gnózy FIRS.

Z metodických důvodů (minimalizace negativního vlivu vaginálního porodu na hladiny bio­markerů) byly zařazeny pouze případy po porodu per sectionem caesaream, ale s variabilním rizikem infekčních komplikací (preeklampsie, růstová restrikce plodu, předčasný odtok plodové vody). Studie potvrdila korelaci FIRS s leukocytózou matky, předčasným a předtermínovým odtokem plodové vody a nástupem předčasné děložní aktivity [2].

Zásadním problémem histopatologického vyšetření placenty a pupečníku pro klinickou praxi je doba pro zpracování bio­logického materiálu a získání definitivního výsledku. Logickou a racionální možností je stanovení koncentrace validních bio­markerů (bio­logických ukazatelů) zánětu, které jsou dostupné, spolehlivé, minimálně náročné, rychle proveditelné a s příznivým poměrem výkon/ cena.

V oblasti feto-maternální medicíny je nejvíce studovaným bio­markerem IL-6 [7]. IL-6 je typický pleiotropní cytokin produkovaný různými buňkami při infekci a poškození tkání. Indukuje syntézu proteinů akutní fáze (např. CRP, LBP). Při infekci dochází k rychlému vzestupu koncentrace IL-6, který je patrný během 2–4 hod po stimulu (s maximem v 6.–8. hod). Signifikantní vzestup koncentrace IL-6 předchází vzestupu CRP. Kombinace vyšetření IL-6 a CRP může výrazně zpřesnit dia­gnostiku FIRS. Naše studie potvrdila korelaci IL-6 a CRP u pacientů s FIRS. CRP je dostupný a vysoce specifický bio­marker těžkých forem funisitidy. Klinicky použitelná hladina CRP pro dia­gnostiku závažné funisitidy je 200 ng/ ml [8].

Relativně novým bio­markerem v dia­gnostice FIRS je prokalcitonin (PCT), který je produkovaný za fyziologických podmínek C-buňkami štítné žlázy jako prekurzor hormonu kalcitoninu. V případě infekce je PCT produkován v parenchymatózních orgánech a buňkách neuroendokrinního systému, predominantně v hepatocytech (po stimulaci IL-6 a tumor necrosis factor á (TNFá)) a monocytech (po stimulaci lipopolysacharidy (LPS)). Hladina PCT vzrůstá 3–4 hod po expozici bakteriálním endotoxinem s maximem v 8.–12. hod. Po vzestupu hladiny PCT následuje fáze plateau (přibližně do 24. hod po inzultu). Biologický poločas PCT je 25–30 hod. PCT velmi rychle klesá během terapie antibio­tiky, a proto je vhodný k monitorování úspěšnosti léčby. PCT je v kombinaci s IL-6 a CRP vhodným komplementárním bio­markerem FIRS. Naše analýza potvrdila, že hladiny PCT statisticky korelují s hladinami ostatních bio­markerů, ale skutečná hladina významnosti PCT pro klinické použití musí být předmětem dalšího výzkumu [9].

Studie neprokázala signifikantní negativní vliv FIRS na neonatální morbiditu [6,10,11]. Prevalence kraniální morbidity (intraventrikulární krvácení ≥ III. stupně, periventrikulární leukomalacie) a bronchopulmonální dysplazie však byla velmi nízká a pravděpodobně souvisí s designem studie. Kombinovaná morbidita však byla vyšší u novorozenců s FIRS, ale rozdíl nebyl statisticky významný.

Závěr

Hodnoty zánětlivých bio­markerů (IL-6, PCT, CRP) v pupečníkové krvi okamžitě po porodu korelují s histologicky prokázanou chorioamnionitidou a systémovou zánětlivou odpovědí plodu. Stanovení zánětlivých bio­markerů v pupečníku je ve srovnání s histopatologickým vyšetřením placenty rychlé a relativně levné. Včasná dia­gnostika FIRS může zásadně ovlivnit management u rizikových skupin novorozenců (preventivní podávání antibio­tik a plánování kontrolních odběrů zánětlivých bio­markerů).

Doručeno/ Submitted: 8. 3. 2021

Přijato/ Accepted: 11. 3. 2021

prof. MU Dr. Zbyněk Straňák, CSc.

Ústav pro péči o matku a dítě

Podolské nábřeží 157

147 00 Praha 4

zbynek.stranak@upmd.eu

Publikační etika: Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do bio medicínských časopisů.
Publication ethics: The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for bio medical papers.
Konflikt zájmů: Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie/ práce nemají žádný konflikt zájmů.
Confl ict of interests: The authors declare they have no potential confl icts of interest concerning the drugs, products or services used in the study.
Dedikace: Práce vznikla za podpory projektu NV 17-31403A a PROGRES Q34.
Dedication: The work was supported NV 17-31403A and PROGRES Q34.