Umělá aktivace pohybu spermií in vitro

Súhrn

Cíl studie: Metoda aktivace spermií je moderní metodický přístup, který se v praxi používá stále více. Neustále přibývá nových studií zaměřených na metody umělé aktivace motility lidských spermií. Standardní metody výběru spermií mohou v některých případech selhat mimo jiné i proto, že jsou izolovány spermie velice mladé, které ještě nedokončily svůj vývoj. V těchto případech může mít umělá stimulace jejich pohybu pozitivní efekt a velice usnadnit a urychlit proces výběru vhodných spermií. Jako aktivační činidla se nejčastěji využívají methylxanthiny. Názory na bezpečnost použití těchto látek na spermie však nejsou jednotné. Cílem práce je prezentovat současné poznatky o umělé aktivaci motility spermií na in vitro fertilizaci a následný embryonální vývoj. Metodika: Rešerše relevantní literatury v databázích Web of Science, Scopus, PubMed/Medline. Výsledky a závěr: Z literární analýzy vyplývá, že je tato metoda bezpečná a účinná při výběru nepohyblivých spermií. Byly provedeny vědecké studie zaměřené na ověření bezpečnosti a spolehlivosti této metody. Závěrem těchto studií je pozitivní dopad tohoto způsobu výběru především u případů spermií získávaných z varletní tkáně po metodě TESE (testicular sperm extraction). V těchto případech metoda umělé aktivace spermií usnadnila a zrychlila výběr spermií před intracytoplazmatickou injekcí spermie. Aktivovány byly spermie nepoškozené, které jsou nepohyblivé z důvodu nedokončení své maturace.

Klíčová slova:

spermie – in vitro fertilizace – motilita – teofylin

Úvod

Jednou z metod, která slouží ke zvýšení účinnosti oplození a podpoře dalšího vývoje embryí, je v případě handicapovaných spermií metoda aktivace pohybu spermií v podmínkách in vitro ve spojení s intracytoplazmatickou injekcí spermie (ICSI). Počátky použití aktivace pohybu spermií ve spojení s metodami asistované reprodukce se datují do začátku 90. let minulého století [1–3].

Vztah mezi pohyblivostí spermie a kvalitou oplození

Spermie z jednoho ejakulátu představují značně heterogenní populaci, jen část z nich má schopnost oplodnit oocyt [4,5]. Přirozená selekce spermií je založena na průchodu spermie labyrintem ženských pohlavních cest, tedy na preferenci pohyblivých spermií [6]. Motilita je základní vlastnost spermií, která je často využívaná i při jejich separaci před použitím pro in vitro fertilizaci (IVF). Nicméně bylo prokázáno, že nejen přirozeně pohyblivé spermie mají lepší schopnost oplodnit a zajistit kvalitní vývoj embrya, ale že selekci vhodných spermií umožní i pohyb uměle aktivovaný, dovolující odlišit vitální spermie schopné oplodnit vajíčko a zajistit jeho normální vývoj [7].

Pokud jsou například spermie izolovány přímo z varletní tkáně (při metodě TESE – testicular sperm extraction), jsou izolovány často nezralé spermie, které mají špatný pohyb a většina takto získaných spermií je nepohyblivých [8]. Absence pohybu v tomto případě ale není způsobena poškozením spermie, ale její nedostatečnou maturací.

Fyziologie pohybu spermie

Pohyb bičíku spermií je poháněn fosforylací axonemálních zevních dyneinových ramének spojenou s hydrolýzou adenosintrifostátu (ATP), která dodává energii potřebnou pro posouvání mikrotubulových dubletů v axonemě, jehož výsledkem je ohýbání bičíku [9,10] podmiňující dopředný rotační pohyb spermie.

Centrální úlohu v regulaci této aktivity mají zejména kalciové ionty a na cyklickém adenosinmonofosfátu (cAMP) závislá cesta proteinkinázy A (PKA) (obr. 1). Bylo prokázáno, že cAMP je primárním signálem pro nástup motility spermií [11–14].

Dalšími činiteli jsou kalciový kanál CatSper přítomný na membráně bičíku spermie, který je řízen napětím a pH, které je zase řízeno draslíkovými a sodíkovými kanály a ligandami ze sekretu vejcovodu [15]. Vzestup koncentrace kalcia v cytoplazmě společně se vzrůstem koncentrace hydrogenkarbonátového iontu vede k aktivaci atypické solubilní adenylátcyklázy (sAC), která syntetizuje cAMP. To vede k aktivaci PKA a následné kaskády fosforylace proteinů vyvolané tyrosinkinázami a vyvažované serin/tyrosin fosfatázami, které společně regulují motilitu [16].

Antagonisty sAC syntetizující cAMP jsou fosfodiesterázy, které cAMP odbourávají za vzniku 5’-AMP. V lidských spermiích jsou přítomné jejich izoenzymy PDE1A a PDE3A [17].

Mechanizmus umělé aktivace pohybu

K aktivaci pohybu lidských spermií byla vyzkoušena řada látek [3,18–20].

Nejčastěji užívanými sloučeninami pro podporu pohyblivosti spermií in vitro jsou inhibitory fosfodiesterázy [21]. Principem umělé aktivace pohybu spermií je zvýšení koncentrace cAMP v cytoplazmě spermií inhibicí fosfodiesteráz, které cAMP odbourávají, není tedy ovlivněna syntéza cAMP (obr. 2). Velice často se k těmto účelům používá teofylin (1,3-dimethyl-7H-purin-2,6-dion; 1,3-dimethylxanthin) patřící podobně jako kofein či teobromin do skupiny alkaloidů methylxantinů. Methylxantiny jsou široce rozšířené látky, které se často používají jako léčiva při astmatu a dalších respiračních onemocněních.

Pomocí umělé aktivace dojde k aktivaci pohybu u nezralých spermií, které se po izolaci z varlat nehýbou. Tyto pohyblivé spermie jsou následně použity pro IVF. Aktivace pohybu spermií je výrazně zviditelní a usnadní jejich výběr ze vzorku (a zkrátí tak dobu výběru spermií). Navíc u mnoha vzorků krvavé varletní tkáně s pouze malým počtem spermií byly spermie identifikovány až po aktivaci. Z tohoto důvodu se někdy aktivace spermií používá i v diagnostických vzorcích TESA (testicular sperm aspiration) [22].

Indikace k použití aktivace pohybu

Indikací umělé aktivace pohybu spermií je TESE [23,24]. Ošetření testikulárních spermií získaných TESE teofylinem vedlo ke zvýšení klinické pregnancy rate z 23 % na 53 % [25].

Další indikací použití aktivace pohybu jsou případy těžké asthenozoospermie [26], případně nekrozoospermie [27]. Velice efektivní je také tato metoda při manipulaci s rozmraženými spermiemi po TESE [25].

Potenciální rizika použití metody

Do současné doby nebyl publikován případ vrozené vady v souvislosti s použitím umělé aktivace pohybu spermií. Aydos a Aydos poukázali na potenciální riziko teratogenního účinku dimetylxanthinů [29] s odkazem na publikaci o výskytu vrozených vad u myší vystavených vysokým dávkám (stovky miligramů na kilogram a den) paraxanthinu (1,7-dimethylxantin) v průběhu březosti [29]. Při použití této metody je důležité nevystavovat oocyty těmto látkám a pečlivě odstranit methylxanthin z kultivačního média, ve kterém se časná embrya vyvíjí [27]. Novější publikace zjistila, že paraxanthin není mutagenní ani genotoxickou látkou [30]. Pro bezpečnost aplikace látek ze skupiny dimetylxanthinů svědčí i široké používání léků z této skupiny v humánní medicíně bez teratogenních účinků. Pro umělou aktivaci pohybu spermie se navíc využívají nízké koncentrace aktivní látky a jejich působení na spermie je velmi krátkodobé, využívá se časově omezeného efektu přechodného vzestupu cAMP.

Doporučený postup

V současné době je dostupný preparát GM501 SpermMobil (PLANER LIMITED, GYNEMED Medizinprodukte GmbH & Co. KG), založený na účinku inhibitoru fosfodiesterázy teofylinu [31], který se jinak používá také pro léčbu astmatu [32] a přirozeně se nachází např. v kakaových bobech [33] nebo čajových lístcích [34].

Roztok GM501 SpermMobil je zahřát na 37 °C, naekvilibruje se v atmosféře se zvýšenou koncentrací oxidu uhličitého. Na topnou desku (37 °C) je umístěna Petriho miska s kapkou suspenze spermií v médiu pro přípravu spermií o objemu cca 30–40 µl. Přidá se 3–4 µl zahřátého roztoku GM501 SpermMobil, a to z jedné strany, opačné, než ze které mají být nasávány spermie. Po 10 min je možno nabírat aktivované spermie (aktivační účinek nastoupí po několika minutách a trvá až 1 hod). Nabrané spermie jsou přeneseny s minimem tekutiny do kapky čistého media (obr. 3).

Závěr

Umělá aktivace pohybu spermií představuje účinný a bezpečný postup pro selekci vitálních spermií schopných oplodnit oocyt a umožnit vývoj embrya v případech, kdy není možno získat spontánně pohyblivé spermie.