Stanovení pentosidinu v moči a tkáních kloubního kompartmentu pacientů s pokročilou osteoartrózou

Súhrn

Úvod:
Neenzymatickou glykací in vivo vznikají konečné produkty pokročilé glykace způsobující nežádoucí ireverzibilní změny pojiva v důsledku zesíťovaní příčnými vazbami. Stanovením jejich zásadního ukazatele – pentosidinu, lze kvantitativně sledovat degradační změny v osteoartrotickém kloubu související se zánětem a zvýšenou glykoxidační zátěží organismu.

Metody:
Pentosidin v moči u pacientů s pokročilou osteoartrózou byl vyšetřen před operací a 6 měsíců po náhradě postiženého kloubu. Chrupavka, synovie a postižená subchondrální kost byly získány při provedení totální endoprotézy kyčle či kolena. Pro stanovení pentosidinu v hydrolyzátech tělních tekutin a extraktech z tkání byla na našem pracovišti vyvinuta citlivá metoda založená na gradientové vysokoúčinné kapalinové chromatografii (HPLC) v reverzní fázi s fluorescenční detekcí.

Výsledky:
Před operací byly vyšší močové hladiny pentosidinu u osteoartrotických pacientů v porovnání s pacienty po výkonu i v porovnání s kontrolní zdravou skupinou. Pozorovali jsme pozitivní korelaci pentosidinu v moči před a po operaci. Těsnější asociace byla zjištěna v koncentraci pentosidinu mezi extrakty ze synovie a postižené subchondrální kosti. Koncentrace pentosidinu v moči a chrupavce významně vzrůstaly s věkem. Z kloubních tkání byly nejvyšší koncentrace pentosidinu (vztažené na hmotnost sušiny) v extraktech ze synoviální membrány (45,00 nmol/g), následované nálezem v chrupavce (36,28 nmol/g), a výrazně nejnižší byly v artroticky změněné subchondrální kosti (2,98 nmol/g).

Závěr:
Pokles močového pentosidinu po totální kloubní náhradě u pacientů s osteoartrózou poukazuje na zlepšení patologického stavu po operaci. Na zvýšenou akumulaci pentosidinu v chrupavce a moči má významný vliv také rostoucí věk. Naše výsledky tedy podporují hypotézu, že pentosidin může hrát roli potenciálního biomarkeru degradačního odbourávání chrupavky a zánětlivého procesu probíhajícího u osteoartrózy. Stanovení pentosidinu tak může přispět k pochopení patologického procesu artroticky postiženého kloubu v souvislosti s lokálně probíhajícím zánětem, glykoxidační zátěží a stárnutím organismu.

Klíčová slova:
pentosidin, osteoartróza, biomarker, pojivová tkáň, vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)

Úvod

Osteoartróza (OA) je nejčastější kloubní onemocnění postihující přibližně 12 % dospělé populace (1). Jedná se o heterogenní onemocnění zahrnující více typů s odlišnou příčinou vzniku. Výsledkem je poškození kloubního aparátu, snížení funkce postiženého kloubu, námahová bolest a krátká ranní ztuhlost. Existuje mnoho rizikových faktorů OA (2, 3), ale základní příčina vzniku choroby není dosud zcela známa. Významnou roli hraje dlouhodobé mechanické přetížení a mikropoškození kloubu, obezita, ženské pohlaví, svalová slabost, sekundárně zánětlivé kloubní onemocnění, kongenitální vývojové vady, některé metabolické, endokrinní či neurologické choroby. Velmi diskutovanou otázkou je genetický vliv, zejména pak u familiární formy OA (4). Z pohledu idiopatické OA představuje důležitou roli věk. Během stárnutí organismu totiž významně vzrůstá prevalence OA. Pravděpodobně kombinace několika z výše uvedených faktorů postupně navozuje úbytek hyalinní chrupavky, sklerotické změny subchondrální kosti, tvorbu osteofytů a sekundární zánět synoviální membrány a měkkých tkání kloubu (5).

V průběhu stárnutí dochází v organismu ke zvýšené akumulaci konečných produktů pokročilé glykace (advanced glycation end-products, AGE) (6, 7). AGE vznikají tzv. Maillardovou reakcí (8) představující sled kondenzačních reakcí, zahájený kovalentní vazbou oxo-skupiny redukujícího sacharidu (zejména pentózy) na volnou ε-amino-skupinu lysinu, která je součástí polypeptidového řetězce síťovaného proteinu. Během několika hodin vznikají časné produkty glykace (nestabilní Schiffova báze), pomalu dochází k přeuspořádání vazeb (Amadoriho přesmyk) a vzniká, stále ještě reverzibilní reakcí, Amadoriho produkt. Oxidační stres během týdnů až měsíců urychluje již ireverzibilní krok vzniku AGE, tj. adičních sloučenin (aduktů) či příčně vazebných elementů (kroslinků). Zvýšená akumulace AGE derivátů může být v průběhu stárnutí potencována hyperglykémií a oxidační zátěží během různých patologických stavů. Jedná se např. o diabetes mellitus (10), renální insuficienci (11), aterosklerózu (12), některé neurologické choroby (13, 14) i revmatoidní artritidu (RA) a OA (15). Hlavním představitelem a nejvíce studovaným příčně vazebným AGE je pentosidin (PEN). Mezi adolescencí a 80. rokem věku vzrůstá v kloubní chrupavce množství PEN více než 30násobně (16). Důvodem je velmi dlouhý biologický poločas kolagenu hyalinní chrupavky (více než 100 let). Neenzymatická modifikace kolagenu negativně ovlivňuje kvalitu, metabolický obrat a reparační kapacitu chrupavky a finálně může přispět ke snížení odolnosti vůči působení mechanických sil, kterým je chrupavka v průběhu života vystavena (17). Zvýšená akumulace AGE v kloubní chrupavce je tak považována za jeden z molekulárních mechanismů, kterým se věk podílí na patogenezi OA. Nedávno jsme zjistili zvýšenou hladinu sérového PEN u pacientů s exacerbací OA kolenních kloubů (16). Zajímavé pak bylo zjištění pozitivní asociace PEN s ukazatelem destrukce chrupavky oligomerním proteinem chrupavkové matrix (COMP) v synoviální tekutině.

Cílem této práce byla analýza pentosidinu v jednotlivých kompartmentech kloubu – chrupavce, synoviální tkáni a subchondrální kosti, a stanovení vlivu totální náhrady postiženého kloubu na koncentrace pentosidinu v moči u pacientů s pokročilou OA.

Pacienti a metody

V této studii byly analyzovány vzorky ranní moče od 106 pacientů s pokročilou OA (> 3. stadium podle Kellgrena-Lawrence) (19), kteří byli indikováni k totální endoprotéze (TEP) kolenních či kyčelních kloubů (tab. 1). Jednalo se o 78 žen a 28 mužů. PEN byl vyšetřen před operací a 6 měsíců po zákroku. K vyšetření moči se za 6 měsíců po operaci dostavilo již jen 76 pacientů průměrného věku 66,1 ± 10,1 let. Dále byly vyšetřeny jednotlivé tkáně kloubního kompartmentu (tab. 2). Vzorky chrupavky (n=83), synoviální membrány (n=70) a postižené subchondrální kosti (n=31) byly odebrány a zamraženy v kapalném dusíku ihned po vyjmutí během operace. Hladiny PEN v moči byly vztaženy na koncentraci močového kreatininu, v případě kloubních tkání byl PEN vztažen na hmotnost sušiny. Pro porovnání hladin močového PEN byla vyšetřena skupina zdravých jedinců přibližně stejného věku (n=26, věk=65 ± 5 let), u nichž byla vyloučena renální insuficience, diabetes mellitus a chronická zánětlivá onemocnění. Z tkáňové databáze ústavu soudního lékařství byly získány 4 vzorky kloubní tkáně nepostižené artrotickým procesem od jedinců ve věku od 30 do 78 let.

Pro stanovení PEN v hydrolyzátech tělních tekutin či extraktech z tkání byla na našem pracovišti vyvinuta citlivá metoda (20) založená na gradientové HPLC v reverzní fázi s fluorescenční detekcí, umožňující jeho stanovení v hydrolyzátech tělních tekutin a kloubního bioptického materiálu. Analytický postup při předběžné úpravě vzorku je sledem následujících kroků: kyselá hydrolýza (16 h /105 °C v alikvotu 12M HCl), purifikace a prekoncentrace pomocí extrakce na pevné fázi (SPE), vakuové odpaření rozpouštědel (SpeedVac), převedení do mobilní fáze a vlastní HPLC analýza. K vysoce citlivé detekci bylo využito přirozené fluorescence analytu (HPLC systém SHIMADZU, typ CLASS VP, verze 5.03). Při stanovení PEN v moči i kloubních tkáních probíhá separace na skleněné koloně typu CGC Separon SGX C18 plněné silikagelem s navázaným oktadecylsilanem. Mobilní fáze se skládá z 0,02 M heptafluoromáselné kyseliny, 0,01 M (NH₄)₂SO₄ a lineární gradient je dán proměnnou koncentrací acetonitrilu (12,5–25,0 %); fluorescenční detekce PEN při nastavení vlnových délek λ_ex/em = 335/385 nm. Ukázky separace PEN v moči a tkáních OA pacientů jsou uvedeny na obrázku 1 a, b.

Hodnoty uvedené v textu a tabulkách jsou vyjádřeny jako aritmetický průměr ± směrodatná odchylka (S.D.). Pro statistickou analýzu byl použit k hodnocení statistické významnosti dvouvýběrový Studentův t-test s oboustranným rozdělením, za signifikantní byl považován výsledek na 5% hladině významnosti. Sledované parametry byly korelovány pomocí Spearmanova korelačního koeficientu za využití statistického programu NCSS 2000 (Kaysville, Utah, USA).

Výsledky

Vliv chirurgické intervence na močové hladiny pentosidinu

Otázkou sledovanou v této práci byla biochemická odezva metabolismu tkání pojiva a akumulace pentosidinu na provedení náhrady ar-troticky postiženého kloubu endoprotézou. Množství PEN v moči u pacientů s OA před a po operaci a u kontrolní zdravé skupiny je uvedeno v tabulce 1.

Koncentrace PEN v moči (U-PEN) byly ve všech případech vztaženy na hodnoty močového kreatininu (nmol PEN/mmol kreat.). Hodnota U-PEN byla statisticky významně vyšší u pacientů s OA před operací oproti jedincům z kontrolní skupiny (7,2 ± 6,5 vs. 5,0 ± 3,3, p<0,05) a pokles PEN v moči, nicméně nesignifikantní, byl pozorován také u jedinců půl roku po náhradě kloubu oproti období krátce před operačním zákrokem (7,2 ± 6,5 vs. 5,6 ± 4,0, p=0,08) (tab. 1). Korelační analýza potvrdila pozitivní asociaci předoperačního (r=0,29, p=0,01) a pooperační U-PEN (r=0,46, p<0,001) s věkem. Hraniční asociace U-PEN s věkem byla pozorována také u kontrolní skupiny (r=0,413, p<0,05).

Stanovení PEN ve tkáních kloubního kompartmentu

Koncentrace PEN v jednotlivých kloubních tkáních OA pacientů byly korigovány na hmotnost sušiny (nmol/g) a jsou uvedeny v tabulce 2. Nejvyšší průměrné koncentrace byly naměřeny v extraktech ze synoviální membrány (45,00 nmol/g) a v hyalinní chrupavce (36,28 nmol/g). Mezi nimi nebyl shledán statisticky významný rozdíl (r=0,09; p=0,47). Naopak, více než 10krát nižší jsou koncentrace v extraktech z postižené subchondrální tkáně (2,98 nmol/g). Koncentrace PEN v extraktu z chrupavky pozitivně korelovala s věkem pacientů s OA (r=0,32, p<<0,01). PEN v synovii i v subchondrální kosti nevykazoval na věku statisticky významnou závislost. Koncentrace PEN v synoviální membráně a subchondrální kosti spolu navzájem významně korelovaly (r=0,67; p=0,001). Z důvodu malého množství vzorků zdravých tkání (n=4) nebylo možné provést statistickou interpretaci porovnání artrotické a kontrolní zdravé tkáně.

Diskuse

V této práci jsme pozorovali asociaci zvýšeného pentosidinu v artrotické hyalinní chrupavce s věkem. U starších jedinců vzrůstaly i koncentrace močového pentosidinu. Hodnoty pentosidinu v moči u jedinců s pokročilou formou OA byly vyšší a jejich pokles provázel náhradu postiženého kloubu.

Z klinického hlediska byl sledován vliv progrese OA a věku na hladiny AGE, resp. na akumulaci PEN v moči a v jednotlivých tkáních kloubního kompartmentu. Je známo, že s věkem roste významně množství PEN v hyalinní chrupavce (21) a tento fenomén je pokládán za jeden z možných molekulárních mechanismů vzniku nebo progrese OA (16, 17). Naše práce potvrdila zvýšenou akumulaci PEN v hyalinní chrupavce a pozitivní asociaci mezi PEN a věkem jedinců. Důvodem zvýšené akumulace PEN v chrupavce je dlouhý biologický poločas kolagenu typu II (více než 100 let), kdy v průběhu fyziologického stárnutí dochází k pokračující neenzymatické modifikaci kolagenních struktur. Tomu navíc mohou přispět molekulární změny na úrovni hyalinní chrupavky, které mají během artrotického procesu lokálně zánětlivý charakter. Nedávno byla zjištěna přítomnost AGE – karboxymethyllysinu také v synoviální membráně u pacientů s revmatoidní artritidou (RA) a v menší míře také u pacientů s OA (22). Naše práce na souboru pacientů s pokročilou OA ukazuje nejvyšší koncentraci PEN v synoviální membráně. Jedná se o místo kloubu s lokálně probíhajícím zánětem, což může podporovat význam zánětu souvisejícího s přítomností oxidačního stresu, který je jedním z klíčových faktorů podílejících se na zvýšené tvorbě AGE produktů. Významně nejnižší koncentrace PEN byly nalezeny v artroticky poškozené subchondrální kosti. Zdůvodněním pro tuto skutečnost může být fakt, že v subchondrální tkáni ne-umožňuje relativně krátký biologický poločas nahromadit tak veliké množství PEN, jak je tomu např. u hyalinní chrupavky.

V moči pacientů s pokročilou formou OA jsme zjistili zvýšenou koncentraci PEN oproti kontrolní skupině jedinců. Významným zjištěním byl pokles koncentrací PEN v moči po provedení náhrady postiženého kloubu. Tento fakt může poukazovat na změnu patologického procesu artrotického kloubu ve smyslu odstranění tkáně, která podléhala degradaci, a potlačení lokálně probíhajícího zánětu. V naší nedávné práci jsme pozorovali zvýšené koncentrace PEN v séru pacientů s OA kolenních kloubů a jeho pozitivní vztah k hladině ukazatele degradace hyalinní chrupavky COMP (18). Další naše práce podporující vztah PEN k OA bylo pozorování asociace vyšších hladin sérového PEN s progresí rentgenového postižení ve smyslu zúžení kloubní štěrbiny během dvouletého sledování pacientů s OA kolenních kloubů (23). Na druhé straně velmi recentní práce (24) nepotvrdila prediktivní význam hladiny močového PEN ve vztahu k úbytku kloubní chrupavky (hodnoceno pomocí MRI). Autoři komentují jejich zjištění tvrzením, že systémové hodnoty PEN neodrážejí postižení jen jednoho kloubu, ale patologický stav celého kloubního aparátu. Na hladině PEN v tělních tekutinách se navíc mohou podílet i jiné patologické stavy, než prostý úbytek kloubní chrupavky.

Tato práce byla zaměřena na stanovení pentosidinu – nejlépe chemicky definovaného fluoreskujícího zástupce skupiny konečných produktů pokročilé glykace. Vzhledem k velmi nízkým koncentracím sledovaným in vivo je tento fakt z analytického hlediska velmi podstatný, neboť umožňuje využít přirozenou fluorescenci analytu k detekci. Závěrem lze shrnout, že se nám podařilo potvrdit věk jako významný rizikový faktor podílející se na akumulaci látek skupiny AGE v kloubní chrupavce. Navíc jsme zjistili efekt chirurgické intervence na pokles pentosidinu v moči, což může provázet normalizaci patologického stavu po náhradě artrotického kloubu. Výsledky našich měření tedy podporují hypotézu, že pentosidin může hrát roli potenciálního biomarkeru degradačního odbourávání chrupavky a lokálního zánětlivého procesu u pacientů s pokročilou osteoartrózou.

Poděkování

Autoři děkují Ing. Pavlu Špačkovi, CSc. za odborné konzultace, Marii Krabcové a Aleně Stáňové za technickou spolupráci.

Tato práce byla podpořena Ministerstvem zdravotnictví ČR (grant IGA, reg. č. NR/7895-3).

Mgr. Martin Braun

Revmatologický ústav

Na Slupi 4

128 50 Praha 2

e-mail: braun@revma.cz