Súčasný pohľad na genetiku alkaptonúrie

Souhrn

Alkaptonúria (AKU) je monogénne, autozomálne recesívne dedičné ochorenie spôsobené defektom enzýmu oxidáza kyseliny homogentizovej, v dôsledku čoho sa kyselina homogentizová hromadí v organizme a vylučuje močom. Jej polymér, modro-čierny ochronotický pigment, sa ukladá v chrupavke a spojivovom tkanive a spôsobuje ich pigmentáciu (ochronózu). Z klinického hľadiska je najzávažnejšie postihnutie chrbtice a veľkých kĺbov. Biochemickou podstatou AKU je chýbanie biologickej aktivity enzýmu homogentizát 1,2-dioxygenáza (HGD) v pečeni. HGD sa podieľa na katabolizme fenylalanínu a tyrozínu. Gén, ktorý kóduje enzým HGD sa skladá zo 14 exónov, 13 intrónov a nachádza sa na dlhom remienku chromozómu 3 (3q21-23). Kompletná dĺžka nukleotidovej sekvencie je 54 363 bp, pričom kódujúca časť génu má len 1 715 bp. Gén HGD sa exprimuje tkanivovo špecificky najmä v pečeni a obličkách. Defekt enzýmu HGD nie je spôsobený jedinou mutáciou, ako sa pôvodne predpokladalo. V súčasnosti ich poznáme najmenej 67, pričom väčšina mutácií je zriedkavá a sú charakteristické pre určitú lokalitu, resp. rodinu. Všetky vedú ku kompletnej strate enzymatickej aktivity HGD. V slovenskej populácii sa zistilo 10 rôznych mutácií v géne HGD. Šesť z nich (G270R, G161R, G152fs, P370fs, S47L, IVS5+1G→A) pravdepodobne vzniklo na Slovensku v oblasti Kysúc. Vyvolali ich niektoré faktory prostredia, resp. výživy. Následný genetický drift a izolácia zapríčinili zvýšenú frekvenciu týchto mutácií, čo viedlo k častejšiemu výskytu AKU. Pre Slovensko je charakteristický celosvetovo najvyšší výskyt AKU (incidencia v novorodeneckej populácii Slovenska – 1 : 19 000). Poznatky z molekulovej genetiky AKU sa využívajú pri DNA diagnostike, pri odhaľovaní zdravých prenášačov (heterozygotov) a sú veľkým prísľubom pre rozvoj génovej terapie AKU.

Klíčová slova:
alkaptonúria (AKU), genetika AKU, homogentizát 1,2-dioxygenáza (HGD), gén HGD, mutácie

Alkaptonúria (AKU) je dedičné ochorenie spôsobené defektom enzýmu oxidáza kyseliny homogentizovej, v dôsledku čoho sa kyselina homogentizová hromadí v organizme a vylučuje močom. Jej polymér, modro-čierny ochronotický pigment, sa ukladá v chrupke a spojivovom tkanive, najmä v koži, vnútorných orgánoch, očiach, ušiach a spôsobuje ich pigmentáciu (ochronózu). Z klinického hľadiska je najzávažnejšie postihnutie kĺbov, ochronotická artropatia, ktorá spravidla vedie k invalidite. Je to degeneratívny proces, ktorý primárne postihuje chrbticu (kalcifikácia platničiek), ale aj veľké kĺby (1).

AKU má v katalógu dedičných chorôb „Mendelian Inheritance in Man“ (MIM) pridelený kód MIM 203 500 (www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/). Z historického hľadiska je to prvá dedičná choroba človeka, pri ktorej už v roku 1902 predpokladal sir Archibald Garrod mendelistickú dedičnosť determinovanú jednoduchým recesívnym faktorom (2). Zaradil ju medzi vrodené poruchy metabolizmu, ktoré spôsobuje defekt špecifického enzýmu, aj keď v tom čase ešte nepoznal jej molekulovú podstatu. AKU je monogénna choroba autozomálne recesívne dedičná, čo znamená, že je determinovaná jedným génom, ktorý sa nachádza na niektorom z homologických chromozómov človeka - autozómoch, medzi ktoré patria chromozómy číslo 1–22. V klasickom prípade sú pri tomto type dedičnosti spravidla obidvaja rodičia zdraví, ale sú nositeľmi patologickej alely (zdraví prenášači - heterozygoti), pričom riziko postihnutia ich detí, ktoré sú recesívnymi homozygotmi, je 25 %. 50 % detí je zdravých, ale sú prenášači patologickej alely a 25 % detí je zdravých a nie sú prenášači. V prípade manželstva chorého s AKU a zdravého prenášača sa riziko postihnutia detí zvýši až na 50 %. Prvý matematicko-štatistický dôkaz autozomálne recesívnej dedičnosti AKU priniesli v roku 1932 Hogben a spol. (3).

V roku 1958 La Du so spolupracovníkmi (4) zistili, že biochemickou podstatou AKU je chýbanie biologickej aktivity enzýmu homogentizát 1,2-dioxygenáza (HGD) v pečeni, čím potvrdili pôvodný predpoklad Garroda, že ide o metabolickú poruchu. HGD (MIM 607 474, staršie označenie HGO) je enzým, ktorý sa podieľa na katabolizme fenylalanínu a tyrozínu (EC 1.13.11.5). Má molekulovú hmotnosť 50 kDa a skladá sa zo 445 aminokyselín. Je špecifický pre kyselinu homogentizovú a neoxiduje príbuzné látky, ako kyselina gentizová, kyselina fenyloctová (5). Gén, ktorý kóduje proteín – enzým HGD, bol klonovaný v roku 1996 (6), čím sa začala éra štúdia molekulovej genetiky AKU. Dnes vieme (6, 7), že gén pre HGD sa skladá zo 14 exónov (kódujúce časti génu) a 13 intrónov (nekódujúce časti génu). Kompletná dĺžka nukleotidovej sekvencie je 54 363 bp (bázových párov), pričom kódujúca časť génu predstavuje len 3 % z jeho celkovej dĺžky (1 715 bp). Veľkosť exónov sa pohybuje v rozmedzí 35–650 bp (Genbank sequence NM 000187.2). Gén HGD sa exprimuje tkanivovo špecificky najmä v pečeni, obličkách, tenkom a hrubom čreve, v prostate a mozgu (7). Zvýšená aktivita v pečeni a obličkách sa pripisuje metabolickej aktivite týchto orgánov. V mozgu sa HGD pravdepodobne podieľa na degradácii aminokyselín derivovaných z neurotransmiterov, ktoré často obsahujú aromatické aminokyseliny. V ďalších študovaných tkanivách ako krv, zárodočný epitel, svaly, slinné žľazy sa nezistila významnejšia aktivita enzýmu (8). V roku 1994 (9) sa gén HGD lokalizoval na dlhé ramienko chromozómu číslo 3 u človeka (3q). V ďalších rokoch bola jeho lokalizácia na 3. chromozóme ďalej spresnená do oblasti 3q21–23 pomocou techniky polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) a fluorescenčnej in situ hybridizácie – FISH (7).

Molekulovogenetické štúdie pri AKU priniesli prekvapivé zistenie, že defekt enzýmu HGD nie je spôsobený len jedinou mutáciou, ako sa pôvodne predpokladalo, ale viacerými mutáciami, ktoré sa nachádzajú v kódujúcich aj nekódujúcich úsekoch génu HGD. Do roku 2000 sa v súbore vyše 100 pacientov pochádzajúcich z viacerých krajín sveta identifikovalo viac ako 40 rôznych mutácií, ktoré spôsobujú AKU (10, 11, 12). V súčasnosti je ich najmenej 67 (27, 28, 29, 30). Väčšina mutácií patrí medzi mutácie meniace zmysel (missense), pri ktorých dochádza k zámene jedného nukleotidu v molekule DNA. Najčastejšia mutácia, v Európe, ktorá tvorí asi 20 % všetkých mutácií je Met368Val (zámena metionínu za valín v pozícii 368), v Dominikánskej republike Cys120Trp, na Slovensku IVS5+1G→A. V USA sa nezistil žiadny typický nález. Treba povedať, že väčšina mutácií je skôr zriedkavá a je charakteristická pre určitú lokalitu, resp. rodinu (www.cib.csic.es/akudb/index.htm). Všetky mutácie vedú ku kompletnej strate enzymatickej aktivity HGD. Doteraz sa nezistila žiadna zrejmá korelácia medzi typom mutácie a exkréciou kyseliny homogentizovej v moči, ani so závažnosťou choroby (13, 14, 15, 16). Vzhľadom na veľký počet mutácií môže mať pacient s AKU na danom lokuse 2 rozdielne mutácie. Je teda heterozygot. Keďže má obe alely nefunkčné, používa sa na označenie takéhoto stavu termín zložený heterozygot (compound heterozygous). Teda chorý s AKU nemusí byť vždy len recesívny homozygot, ako je to v pôvodnom klasickom chápaní genetickej determinácie tejto choroby.

Molekulovogenetická analýza v slovenskej populácii sa realizovala v súbore 25 pacientov, v ktorom sa študovalo spolu 46 AKU-chromozómov (12, 17, 18, 19). Metódou SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism – jednovláknový konformačný polymorfizmus) a následným sekvenovaním, resp. štiepením restrikčnými endonukleázami, sa zistila prítomnosť 10 rôznych mutácií v géne HGD zodpovedných za vznik AKU. Päť mutácií je spôsobených jednonukleotidovými subsitúciami, ktoré vedú k zámene jednej aminokyseliny v reťazci proteínu HGD (mutácie meniace zmysel), a tým k zmene jeho štruktúry, ktorá môže spôsobiť zníženie alebo úplnú stratu enzymatickej aktivity (S47L – frekvencia 2,2 %, G161R – 24 %, P230S – 4,4 %, G270R – 13 %, V300G – 2,2 %). Tri mutácie predstavujú zmeny spôsobené deléciou alebo inzerciou jedného nukleotidu, ktoré vedú k posunu čítacieho rámca pri prepise mRNA a následnému skráteniu proteínu v dôsledku predčasného stop kodónu (posunové mutácie). Takto vzniká nefunkčný proteín HGD (R58fs – 2,2 %, G152fs – 26 %, P370fs – 13 %). Dve mutácie sú zostrihové, spôsobené substitúciou nukleotidov akceptorového a donorového miesta intrónu. Takéto zmeny ovplyvňujú správny zostrih primárneho mRNA transkriptu, čo vedie k vzniku nefunkčného proteínu (IVS1-1G→A – 6,5%, IVS5+1G→A – 6,5%). Na tomto mieste treba poznamenať, že v súčasnosti boli v slovenskej populácii definované ďalšie nové mutácie (Zaťková, 2009 – osobné oznámenie). Štyri mutácie (V300G, P230S, R58fs, IVS1-1G→A) predstavujú len malé percento všetkých mutácií zistených na Slovensku (15 %). Sú široko rozšírené v Európe a na Slovensko sa pravdepodobne dostali v dôsledku migrácie. Mutácie G270R, G161R, G152fs, P370fs, S47L, IVS5+1G→A, ktoré spolu reprezentujú takmer 85 % všetkých mutácií identifikovaných v slovenskej populácii, sú veľmi staré a pravdepodobne vznikli na Slovensku, konkrétne v oblasti Kysúc. Slovenský pôvod týchto mutácií potvrdzuje aj ich relatívne častý výskyt v našej populácii. Mutácie vznikali v úsekoch trinukleotidov CCC, resp. GGG molekuly DNA, ktoré sa považujú za mutačné hot – spoty génu HGD (10). Predpokladá sa, že dôvodom ich vysokej heterogenity je práve zvýšená mutačná frekvencia v rámci génu HGD v regióne Kysúc. Častejší výskyt mutácií pravdepodobne vyvolali niektoré faktory prostredia, resp. výživy. Následný genetický drift a izolácia zapríčinili zvýšenú frekvenciu týchto mutácií, čo viedlo k častejšiemu výskytu AKU v tejto oblasti. Mutácie sa pravdepodobne neskôr rozšírili z Kysúc aj do ostatných častí Slovenska (12, 18). Molekulová genetika takto prispela k lepšiemu definovaniu a pochopeniu príčin, ktoré vyvolali zvýšený výskyt AKU na Slovensku.

Z pohľadu populačnej genetiky patrí AKU medzi zriedkavé ochorenia. Doteraz sa v literatúre zaznamenalo len niečo vyše 1000 prípadov. Celosvetová prevalencia AKU nie je presne známa. Odhaduje sa na 1 : 250 000 až 1 : 1 000 000 (20). Má však široké etnické a geografické rozšírenie. Jej výskyt sa opísal v rôznych populáciách v Európe, Amerike a Ázii, ide teda o ochorenie, ktoré sa neobmedzuje len na určitú rasu, ale postihuje príslušníkov rozličných etnických skupín. Nálezy typickej ochronotickej spondylózy u egyptských múmií datované približne do roku 1500 p. n. l., svedčia o jej výskyte už v dávnej minulosti (20). Pre Slovensko je charakteristický celosvetovo najvyšší výskyt AKU. Napríklad v 80. rokoch minulého storočia bolo v SR registrovaných celkovo 149 pacientov. Šesťročný skríning v celej novorodeneckej populácii Slovenska (417 122 novorodencov, ktorí prežili prvé 4 týždne života) odhalil incidenciu približne na 1 : 19 000 (21). Je zaujímavé, že výskyt AKU sa nezaznamenal u rómskeho etnika. V určitých oblastiach Slovenska bola frekvencia ochorenia až 10-násobne vyššia. Ide predovšetkým o lokality, ktoré sa dlhodobo, až do 2. svetovej vojny, vyvíjali ako genetické izoláty, predovšetkým Kysuce, Orava, okolie Trenčína, Horehronie – koeficient inbredingu bol F = 0,003–0,029 (21). Zvýšený výskyt AKU v týchto oblastiach sa pravdepodobne pozoruje ako dôsledok ich dlhodobej geografickej izolácie a endogamie, pričom sa tu uplatnili také genetické faktory ako genetický drift a efekt zakladateľa. Rozpad izolátov po 2. svetovej vojne vedie k postupnému poklesu výskytu AKU na Slovensku. Na základe genetických populačných analýz sa odhadla frekvencia génu/alely pre AKU na Slovensku na 0,7 % – q = 0,007 (21). Táto hodnota je pomerne vysoká, pričom ju významnejšie, na rozdiel od frekvencie AKU, neovplyvní ani rozpad izolátov. Na jej podklade možno urobiť určité genetické odhady, ktoré nie sú presné vzhľadom na celý rad faktorov, ktoré by bolo nevyhnuté brať do úvahy v rámci populačných analýz. Umožňujú však získať niektoré orientačné údaje, ktoré sú užitočné z praktického hľadiska. V celej súčasnej populácii Slovenska (približne 5,5 milióna) by na základe týchto odhadov mohlo byť viac ako 250 pacientov s AKU. Frekvencia heterozygotov, teda zdravých prenášačov chorobnej alely, by bola približne okolo 14 osôb na 1 000, pričom 2 manželstvá z 10 000 by predstavovali rizikové manželstvá 2 zdravých prenášačov, v ktorých sa môžu narodiť choré deti s AKU s pravdepodobnosťou 25%. Treba zdôrazniť, že v prípade príbuzenských sobášov, alebo sobášov osôb, ktoré pochádzajú zo spomínaných endogamných lokalít, je riziko výskytu dieťaťa s AKU v potomstve ešte vyššie. Tieto údaje dokumentujú, že problematika AKU a samozrejme aj následnej ochronózy a ochronotickej artropatie je v slovenskej populácii aktuálna aj v súčasnosti a treba jej venovať stálu pozornosť.

AKU, vzhľadom na už spomínaný častý výskyt v slovenskej populácii, je dlhodobo predmetom výskumu. Jej štúdiu sa na Slovensku venovali 4 pracoviská – Národný ústav reumatických chorôb Piešťany (bývalý Výskumný ústav reumatických chorôb), Ústav klinickej genetiky LF UK v Martine, Inštitút molekulovej fyziológie a genetiky SAV Bratislava a Prír. F UK Bratislava. Z historického hľadiska sú významné tieto roky:

• r. 1947 – opísaný prvý prípad AKU a ochronózy v slovenskej populácii (Siťaj, 1947)
• r. 1956 – na Slovensku vychádza prvá monografia o AKU v svetovej literatúre (Siťaj, 1956)
• r. 1950–1960 – v slovenskej populácii (4 milióny obyvateľov) sa zachytilo 182 prípadov AKU. Pacienti pochádzali z 28 rodín. Bola to najväčšia zostava chorých vo svetovom meradle (24).
• r. 1966 – Hüttl a spol. opísali inklúzie ochronotického pigmentu v cytoplazme buniek synoviálnej tekutiny (25)
• r. 1974–1984 – na Slovensku sa realizovali rozsiahle populačné štúdie. Ich výsledky sú zhrnuté v druhej monografii o AKU (Sršeň, 1984)
• r. 1980–1981 – analýza 90 rodín s výskytom AKU potvrdila autozomálne recesívny typ dedičnosti AKU aj v slovenskej populácii (26)
• r. 1993–1994 – gén pre AKU sa lokalizoval na dlhé ramienko chromozómu číslo 3 u človeka (3q). Na tomto objave sa podieľali aj slovenskí autori (9).
• r. 1994–2000 – molekulová charakterizácia mutácií v géne HGD v slovenskej populácii (12, 17, 18, 19). Štúdie sú významné aj z medzinárodného hľadiska. Možno ich chápať ako príspevok Slovenska do projektu HGP (Human Genome Projekt) – mapovanie ľudského genómu.

Pokroky v oblasti molekulovej genetiky AKU prispeli nielen k lepšiemu pochopeniu etiopatogenézy choroby, ale sú významné aj z praktického hľadiska. Umožňujú diagnostiku choroby na úrovni DNA (génu), ktorá je definitívnou diagnózou a patrí kvalitatívne medzi najvyšší stupeň diagnózy. DNA analýzu možno využiť pri odhaľovaní zdravých prenášačov chorobnej alely (heterozygotov), čo pomocou biochemických metód ešte do nedávna nebolo možné. Tieto poznatky sa dajú využiť v genetickom poradenstve. Poznanie molekulovogenetickej podstaty AKU je veľkým prísľubom aj pre rozvoj nových prístupov v terapii tejto choroby, ktorá je v súčasnosti zameraná len na symptomatickú liečbu niektorých komplikácií a je málo účinná. Do úvahy prichádzajú 2 možnosti kauzálnej terapie – náhradné podávanie enzýmu HGD a génová terapia na úrovni somatickej bunky. Priame podávanie enzýmu naráža na niektoré problémy, najmä na jeho lokalizáciu v pečeni, spôsob aplikácie, dávku, dobu a interval podávania. Najschodnejším riešením by bola aplikácia tzv. rekombinantného enzýmu. Príkladom takejto substitučnej enzymatickej liečby je Gaucherova choroba. Pokiaľ ide o somatickú génovú terapiu, v súčasnosti sa už dostáva z fázy skúšania na zvieratách do štádia klinických skúšok, napríklad pri fenylketonúrii. Pacientovi je aplikovaný normálny funkčný gén pomocou vhodného vektora. Podľa doterajších poznatkov a skúseností s génovou terapiou stačí dosiahnuť 5% expresivitu génu, aby sa prejavil jeho priaznivý účinok. Takýto prístup podporujú aj nedávne výsledky transplantácie pečene u pacienta s AKU, u ktorého sa zastavila progresia klinických a rádiologických zmien, pretože hepatocyty transplantovanej pečene mali funkčný gén HGD (31). Génová terapia je veľkou nádejou pre pacientov s AKU, pretože túto chorobu, ktorá spôsobuje častú invaliditu a nemalé utrpenie, doposiaľ stále nevieme liečiť.

Práca je venovaná pamiatke prof. MUDr. Š. Siťaja, DrSc., člena korešpondenta SAV, zakladateľa dnešného Národného ústave reumatických chorôb v Piešťanoch a významného priekopníka československej reumatológie k stému výročiu jeho narodenia.  

Doc. RNDr. Vladimír Bošák, CSc.

Nábr. I. Krasku 4

921 01 Piešťany

Slovenská republika

e-mail: bosak@nurch.sk