Abstrakta z XII. semináře mladých revmatologů

Skalní Mlýn, 14.–16. 5. 2015

Non – Hodgkinův lymfom u pacientů se Sjögrenovým syndromem

Bělobrádková M, Soukup T, Belada D, Bradna P, Kopáčová M

II. interní gastroenterologická klinika, IV. interní klinika FN, Hradec Králové, Česká republika

Úvod. Sjögrenův syndrom (SjS) je chronické autoimunitní onemocnění charakterizované lymfocytárním infiltrátem exokrinních žláz, zejména slzných a slinných, který vyvolává poškození žlázového parenchymu a poruchu sekreční funkce. Nejvíce obávanou komplikací u Sjögrenova syndrom (SjS) je non-Hodgkinův lymfom (NHL), který se vyskytuje u 5–10 % pacientů se SjS.

Diskuse. Medián času od stanovení diagnózy SS ke vzniku lymfomu je zhruba 10 let. Nejčastěji se jedná o lymfom z B buněk či MALTom. Náš ­pacient zemřel 8 let od zjištění lymfomu, který byl diagnostikován 5 let po rozpoznání Sjögrenova syndromu. Lymfom byl v remisi a nestal se tedy primární příčinou jeho smrti, ta byla pravděpodobně způsobena pozdním následkem jeho léčby.

Pacienti se SjS mají 15–20x vyšší riziko vzniku NHL než zdravá populace. Některé práce uvádějí, že mají zároveň vyšší riziko další malignity, jako je myelom, karcinom prsu, ledviny, kůže atd. Včasné vyhledání pacientů s vyšší pravděpodobností vzniku lymfomu je proto velmi důležité. K tomu napomáhají prediktivní faktory (klinické, laboratorní i histologické). Nejvýznamnější klinické příznaky jsou lymfadenopatie, splenomegalie, purpura. Mezi nejsilnější laboratorní prediktory patří CD 4+ T – lymfocytopenie, nízký poměr CD4+/CD8+ T buněk, hypokomplementémie, neutropenie, kryoglobulinémie. Detekce germinal center-like struktur v biopsii slinné žlázy, podle recentních studií, rovněž predikuje vyšší riziko vzniku NHL.

Závěr. Porozumění a nalezení dalších markerů v rámci moderních molekulárně-biologických metod povede k zlepšení péče a prognózy pro tyto pacienty.

Koncentrace extracelulárního Hsp90 korelují s aktivitou nemoci, plicním postižením a kožním skóre u pacientů se systémovou sklerodermií

Štorkánová H¹, Hulejová H¹, Špiritovič M^1,2, Bečvář R¹, Pavelka K¹, Vencovský J¹, Distler JHW³, Šenolt L¹, Tomčík M¹

¹Revmatologický ústav a Revmatologická klinika 1.LF UK, Praha, Česká republika, ²Fakulta tělesné výchovy a sportu UK, Praha, Česká republika, ³Department of Internal Medicine III and Institute for Clinical Immunology, University of Erlangen-Nuremberg, Erlangen, Germany

Systémová sklerodermie (SSc) je vzácné autoimunitní onemocnění pojivové tkáně s nejasnou etiologií postihující kůži a vnitřní orgány. V patogenezi tohoto onemocnění hrají významnou roli tři vzájemně propojené patologické procesy, (1) autoimunita a zánět, (2) vaskulopatie a (3) fibróza. Naše nedávno publikovaná studie prokázala zvýšenou expresi heat shock proteinu 90 (Hsp90) v kůži a dermálních fibroblastech izolovaných z postižené kůže pacientů se SSc v závislosti na hlavním profibrotickém mediátoru TGFβ. Popsali jsme významnou roli Hsp90 v regulaci TGFβ signální dráhy a prostřednictvím inhibice Hsp90 jsme dosáhli snížení stimulačního efektu cytokinu TGF-β na tvorbu kolagenu a vzniku kožní fibrózy u tří různých experimentálních myších modelů SSc1. Cílem této studio bylo stanovit koncentrace extracelulárního Hsp90 u pacientů se SSc a analyzovat jejich možné asociace s jednotlivými parametry klinických manifestací.

Metody. Do této studie bylo vybráno 40 pacientů se SSc (36 žen; průměrný věk 53,9; délka trvání nemoci 5 let; difúzní (dc)SSc/limitovaná (lc)SSc = 9/31), kteří splňovali ACR/EULAR 2013 klasifikační kritéria pro SSc, a 39 zdravých kontrol s věkem a pohlavím. Koncentrace Hsp90 v plazmě byla změřena pomocí metody ELISA (eBioscience, Vienna, Austria). Klinické manifestace byly získány z Českého registru pacientů se SSc. Kožní změny byly hodnoceny podle modifikovaného Rodnanova kožního skóre a aktivita onemocnění byla stanovena podle EUSTAR SSc activity score. Data jsou prezentována jako medián (25.–75. percentil).

Výsledky. Koncentrace extracelulárního Hsp90 byly srovnatelné jak mezi pacienty se SSc a zdravými kontrolami [10,8 (9,2-15,5) vs. 10,1 (8,2–12,8) ng/ml, p = 0,250], tak i mezi pacienty s difúzní (dc)SSc a limitovanou (lc)SSc [11,6 (9,3–15,8) vs. 10,4 (8,6–15,6) ng/ml, p = 0,710]. Navzdory srovnatelným hodnotám plazmového Hsp90 mezi pacienty se SSc a zdravými kontrolami byla u pacientů se SSc nalezena pozitivní korelace mezi koncentracemi Hsp90 a aktivitou onemocnění stanovenou podle EUSTAR SSc activity score (r = 0,418, p = 0,007). Pozitivní korelace byla dále zjištěna mezi koncentracemi Hsp90 a modifikovaným Rodnanovým kožním skóre (r = 0,742, p = 0,022), avšak pouze u pacientů s dcSSc. Negativní korelace byly nalezeny mezi hladinami Hsp90 a jednotlivými parametry plicního postižení: usilovná vitální kapacita (FVC) (r = - 0,457, p = 0,004), usilovný vydechnutý objem za 1 sekundu (FEV 1) (r = - 0,346, p = 0,033) a difuzní kapacita plic pro oxid uhelnatý (DLCO) (r = - 0,444, p = 0,005). Další parametry klinických manifestací tohoto onemocnění nijak signifikantně neovlivnily plazmatické koncentrace Hsp90.

Závěr. V naší studii jsme zjistili srovnatelné hodnoty extracelulárního Hsp90 mezi pacienty se SSc a zdravými kontrolami. Zatímco se Hsp90 hodnoty mezi nemocnými a zdravými jedinci nijak neliší, koncentrace Hsp90 v plazmě jsou vyšší u pacientů s těžším průběhem onemocnění, se sníženou funkcí plic a u pacientů s difuzním typem SSc i s větším kožním postižením. Tato data podporují významnou regulační roli Hsp90 v aktivaci fibroblastů a vzniku kožní fibrózy u SSc.

Poděkování: Práce vznikla za podpory MZ ČR – Institucionální podpora, Koncepční rozvoj výzkumné organizace č. MZO 023728.

Analýza genu ABCG2 u kohorty pacientů s primární dnou

Šimek P, Čepek P, Závada J, Pavelka K, Petrů L, Stibůrková B.

Revmatologický ústav Praha

Protein ABCG2 je membránový transportér náležející do široké a evolučně staré rodiny ABC transportérů (ATP-binding cassette). ABCG2 disponuje širokou substrátovou specifitou a hraje významnou roli při eliminaci řady xenobiotik. Recentní publikace ukazují, že ABCG2 je transportérem, který se významnou měrou podílí na komplexním procesu exkrece kyseliny močové. V systému proximálních renálních tubulů je ABCG2 považován za zcela zásadní sekretor a poškození jeho funkce signifikantně zvyšuje hladinu sérové kyseliny močové. Doposud byly popsány a funkčně charakterizovány dvě alelické varianty ABCG2, vedoucí na úrovni aminokyselinové sekvence k záměně Q141K a Q126X, které mají výrazný vliv na snížení kapacity transportu kyseliny močové. Výskyt obou alelických variant je asociován s fenotypem primární hyperurikémie a primární dny.

Cílem této studie je identifikace a funkční charakterizace dosud nepublikovaných alelických variant ABCG2 u detailně biochemicky a klinicky charakterizované kohorty 150 pacientů s primární hyperurikémií a/nebo primární dnou. Alelické varianty ABCG2 jsou identifikovány Sangerovou metodou sekvenování. Nově objevené varianty jsou charakterizovány pomocí in silico predikce a funkčních studií v expresním systému oocytů Xenopus laevis. Mapování objevených alelických variant bude také provedeno u již shromážděné a detailně charakterizované kontrolní skupiny 150 jedinců.

Doposud byla shromážděna kohorta 106 pacientů, u 80 z nich bylo sekvenováním analyzováno 15 exonů genu ABCG2, včetně intron-exonových rozhraní. V analyzovaných sekvencích bylo identifikováno 12 popsaných intronových polymorfismů, 7 nukleotidových záměn v exonových oblastech (rs2231137, rs2231142, rs34783571, rs35622453, rs369630458, další dvě bez referenčního označení) a z toho 5 nesynonymních (p.V12M, p.Q141K, p.T153M, p.F373C, p.D620N). Dvě z těchto objevených variant, které způsobují na proteinové úrovni aminokyselinovou záměnu p.T153M a p.F373C, nebyly zaznamenány v  databázi a nebyly dosud publikovány. Pozice obou aminokyselinových záměn je na úrovni topologického modelu proteinu ABCG2 lokalizována v predikované N-terminální doméně vázající ATP. Aminokyselinová záměna v této oblasti může vést k destabilizaci nativní konformace této domény a hypoteticky narušit transportní funkci proteinu, podobně jako bylo již popsáno u varianty p.Q141K (Woodward et al., 2013).

Membránový transportér ABCG2 hraje zásadní roli v procesu sekrece kyseliny močové a regulace její hladiny v séru. Probíhající studie genu ABCG2 akcentuje důležitost genetického podkladu primární dny.

Grantová podpora: Tato práce byla podpořena interní grantovou agenturou Ministerstva zdravotnictví České republiky (AZV 15-26693A) a projektem Ministerstva zdravotnictví České republiky pro konceptuální rozvoj výzkumné organizace 00023728 (Revmatologický ústav).

Vliv pohybové léčby na pohyblivost axiálního systému u non-radiografické axiální spondyloartritidy (předběžné výsledky)

Levitová A, Špiritović M, Hušáková M, Pavelka K, Baláš J

RÚ Praha, UK FTVS, Praha

Edukace a cvičení je nutnou součástí léčby spondyloartritid (SpA). Jedinci s ankylozující spondylitidou (AS) dosahují významně lepších výsledků, pokud absolvují každodenní domácí cvičení a alespoň 1x týdně skupinové či individuální cvičení pod vedením fyzioterapeuta. Nejvíce je doporučována kombinace specializovaného cvičení pod dohledem fyzioterapeuta a v domácím prostředí. Fyzioterapeutické postupy jsou podle některých autorů zkoumány nedostatečně, proto je nezbytné pokračovat ve výzkumech a ověřovat účinky pohybové léčby. O účinnosti cvičení u non-radiografické axiální spondyloartritidy (nr ax SpA) nejsou data. Srovnání účinnosti cvičení u AS a nr ax SpA nebylo provedeno. Preventivní účinek časného zařazení cvičení nebyl zatím určen.

Cíl. Zjistit účinnost pohybové léčby u respondentů s nr ax SpA a AS. Porovnat naměřené hodnoty mezi respondenty s nr ax SpA a AS.

Metodika. Jedná se o otevřenou observační studii s paralelním designem v délce 6 měsíců. Výzkumný soubor byl tvořen respondenty navštěvující Revmatologický ústav v Praze (n = 45). Všichni respondenti buď splňovali kritéria pro AS (modifikovaná New Yorská kritéria), nebo ax SpA (kritéria AS AS). Do výzkumu byli respondenti zařazeni podle předem určených kritérií (tzv. kvótní výběr). Kromě výše uvedených diagnostických kritérií byla stanovena další 3 kritéria: 1. kritérium – věk 19 až 45 let, 2. kritérium – délka trvání onemocnění od zjištění dg do 10 let, 3. kritérium – žádný vrcholový sport. Pohyblivost axiálního systému byla měřena pomocí Bath Ankylosing Spondylitis Metrology Index (BASMI), expanze hrudníku a Thomayerovy distance.

Pohybovou léčbu (PL) absolvovali respondenti s nr ax SpA a AS 2x týdně. Probíhala pod vedením fyzioterapeuta formou skupinového cvičení a trvala 60 minut. Obsahovala prvky z edukačních a fyzioterapeutických metod, technik a konceptů, které byly modifikovány na cvičení s balanční pomůckou (Bosu). Součástí PL byla edukace do každodenního domácího cvičení.

Výsledky a závěr. Nepotvrdily se významné rozdíly u vstupních naměřených parametrů mezi respondenty s nr ax SpA a AS, kromě tragus ke stěně (patří do BASMI). U respondentů s nr ax SpA a AS došlo po 6 měsících k významnému zlepšení pohyblivosti axiálního systému kromě modifikované Schoberovy distance (patří do BASMI). Nebyly zjištěny významné rozdíly po 6 měsících pohybové intervence mezi respondenty s nr ax SpA a AS, kromě tragus ke stěně. Mezi respondenty s nr ax SpA a AS nebyl nalezen významný rozdíl po 6 měsících pohybové intervence u celkového BASMI. Můžeme odvodit využitelnost intenzivní pohybové intervence u nr ax SpA a AS v příčinném vztahu k BASMI, expanzi hrudníku a Thomayerově distanci.

IL-35 je zvýšen v kůži a séru pacientů se systémovou sklerodermií a koreluje s délkou trvání nemoci

Tomčík M¹, Zerr P², Palumbo-Zerr K², Štorkánová H¹, Hulejová H¹, Špiritović M^1,3, Kodet O⁴, Štork J⁴, Bečvář¹, Vencovský J¹, Pavelka K¹, Filková M¹, Distler JHW², Šenolt L¹

¹Revmatologický ústav a Revmatologická klinika 1. LF UK, Praha, ²Department of Internal Medicine III and Institute for Clinical Immunology, University of Erlangen-Nuremberg, Erlangen, Germany, ³Fakulta tělesné výchovy a sportu UK, Praha, ⁴Dermatovenerologická klinika 1. LF UK a VFN, Praha

Úvod. Interleukin-35 (IL-35) je nejnovějším přírůstkem do rodiny cytokinů IL-12, kam rovněž patří IL-12, IL-23 a IL-27. IL-35 je tvořen dvěma podjednotkami, řetězcem p35 / IL-12a a EBI3 / IL-27b a má imunomodulační vlastnosti u autoimunitních zánětlivých onemocnění. Potenciální významná role tohoto cytokinu byla již popsána v patogenezi revmatoidní artritidy, sarkoidózy a systémového lupus erythematodes.

Cíl. Cílem této práce bylo stanovit význam IL-35 u systémové sklerodermie (SSc), u které nebyl doposud zkoumán, a analyzovat jeho expresi v kůži, dermálních fibroblastech a periferním oběhu pacientů se SSc a následně zhodnotit možné asociace s klinickými manifestacemi.

Metody. Exprese IL-35 v kůži a dermálních fibroblastech byla analyzována pomocí qPCR, imunohistochemie a imunofluorescence. Sérové koncentrace IL-35 (měřeny pomocí ELISA s vysokou senzitivitou, USCN Life Sciences Inc., Hubei, Čína), CRP (měřeno metodou turbidimetrie), protilátky ANA (analyzovány metodou imunofluorescence) a ENA komplexu (analyzovány imunoblotem) byly měřeny u 40 pacientů se SSc, kteří splnili klasifikační kritéria pro SSc podle EULAR / ACR z roku 2013. Sérové koncentrace IL-35 byly stanoveny i u 40 zdravých jedinců se srovnatelným věkem a zastoupením pohlaví.

Výsledky. Řetězce IL-35, EBI3 a p35, byly zvýšeně exprimovány ve fibrotické kůži pacientů se SSc ve srovnání se zdravými kontrolami na transkripční i translační úrovni. Výrazná intenzita barvení obou podjednotek IL-35 byla detekována v dermálních fibroblastech, myofibroblastech a perivaskulárních zánětlivých buňkách fibrotické kůže pacientů se SSc. Zvýšená exprese IL-35 přetrvávala i v kultivovaných dermálních fibroblastech izolovaných z fibrotické kůže pacientů se SSc, jak na mRNA i proteinové úrovni z buněčných lyzátů, tak i na úrovni koncentrace IL-35 v supernatantu buněk, ve srovnání se zdravými fibroblasty. Stimulace zdravých fibroblastů pomocí hlavního profibrotického cytokinu TGF-β (transformující růstový faktor beta) rovněž zvýšila expresi IL-35 jak na úrovni mRNA a proteinu obou řetězců, tak i samotnou koncentraci IL-35 v supernatantu buněk. Inkubace zdravých fibroblastů s rekombinantním IL-35 indukovala aktivovaný fenotyp v klidových fibroblastech a zvýšenou produkci kolagenu v závislosti na koncentraci IL-35. Analýza sérových hladin IL-35 prokázala vyšší hodnoty u pacientů se SSc ve srovnání se zdravými kontrolami (průměr ± SEM: 61,3 ± 20,2 vs. 8,2 ± 0,8 pg / ml, p <0,0001). Sérové koncentrace IL-35 negativně korelovaly s dobou trvání onemocnění (p <0,05, r = -0,352) a byly zvýšeny u pacientů s kapilaroskopickým nálezem charakteristickým pro časnou fázi SSc („early SSc pattern“) ve srovnání s pacienty s nálezem typickým pro pozdnější fázi SSc („SSc active and late pattern“) (p < 0,05, p < 0,05), Nenalezli jsme žádné korelace sérového IL-35 s dalšími klinickými manifestacemi SSc.

Závěr. Tato práce prokazuje zvýšenou expresi IL-35 v kůži, v dermálních fibroblastech a v séru pacientů se SSc oproti zdravým kontrolám. TGF-β indukuje expresi IL-35, který aktivuje klidové fibroblasty a zvyšuje tvorbu kolagenu a může tak přispívat k aberantní chronické aktivaci signální dráhy TGF-β u SSc. Zvýšená sérová koncentrace IL-35 u pacientů se SSc je spojena s časnou, zánětlivou fázi této nemoci.

Poděkování: tato práce vznikla za podpory grantu IGA12440-4 a za podpory MZ ČR – Institucionální podpora, Koncepční rozvoj výzkumné organizace č. MZO 023728.

Koincidence séronegativní revmatoidní artritidy a p–ANCA asociované vaskulitidy

Petrů L

Revmatologický ústav, Praha

Úvod. Revmatoidní artritida je chronické zánětlivé onemocnění, charakterizované hyperplazií synoviální tkáně a infiltrací kloubního prostředí zánětlivými buňkami. Prevalence séronegativní formy je asi 0,2 %. ANCA asociované vaskulitidy jsou autoimunitní onemocnění charakterizovaná nekrotizujícím zánětlivým postižením malých cév. Patognomická je pro ně přítomnost protilátek proti cytoplazmě neutrofilních leukocytů (ANCA). Prevalence ANCA asociovaných vaskulitid je velmi nízká, asi 0,00002 %.

Popis případu. Jedná se o 61letou pacientku, která se přes 40 let léčí se séronegativní revmatoidní artritidou chorobu modifikujícími léky. V minulém roce u ní byla zjištěna chronická renální insuficience s erytrocyturií a proteinurií. Diferenciálně diagnosticky byla zvažována především amyloidóza ledvin, glomerulonefritida při revmatickém onemocnění či analgetická nefropatie. Při revmatologické kontrole byla prokázána pozitivita antinukleárních protilátek a pANCA protilátek. Pro chronickou renální insuficienci nejasné etiologie a pozitivitu pANCA protilátek byla indikována renální biopsie, ve které byla popsána nekróza s fibrinem a epitelový srpek vysoce suspektní z nekrotizující pauciimunní ANCA pozitivní glomerulonefritidy. U pacientky byla tedy diagnostikována velice vzácná koincidence nekrotizující pANCA pozitivní glomerulonefritidy a séronegativní, antiCCP negativní revmatoidní artritidy II. – III. stadia. Byla zahájena pulzní léčba cyklofosfamidem.

Závěr. V tomto případě se jedná o velmi vzácnou formu overlap syndromu. Dle dostupných údajů předchází diagnóza revmatoidní artritidy ve většině případů diagnózu ANCA asociované vaskulitidy. Časté je postižení ledvin ve formě fokálně segmentální nekrotizující glomerulonefritidy se srpky. Včasný protilátkový screening, diagnóza a zahájení terapie zlepšuje prognózu a přežití pacientů.

Vliv methotrexátu na hladinu mRNA genů HSP70

Čepek P, Novota P, Vencovský J.

Revmatologický ústav, Praha

Úvod. Mezi rodinu HSP70 patří dva evolučně konzervované geny HSPA1A a HSPA1B, které jsou lokalizovány na krátkém raménku 6. chromosomu a jsou součástí MHC (hlavní histokompatibilní komplex) III. třídy. Za fyziologických podmínek jsou oba geny exprimovány ve slabé míře, avšak po vystavení buňky stresu či teplotnímu šoku se jejich exprese několikanásobně zvyšuje. Na proteinové úrovni plní HSPA1A a HSPA1B chaperonovou funkci, tedy napomáhají ostatním proteinům skládat se do správné konformace. Polymorfismy v těchto genech jsou asociované se zánětlivými procesy, autoimunitními onemocněními (1, 2). Dosud nepublikovaná data nasvědčují tomu, že je exprese obou genů zvýšená u některých autoimunitních onemocnění. Cílem naší studie bylo prokázat, že zvýšená exprese HSPA1A a HSPA1B není způsobena podáváním některých léčiv. Konkrétně jsme chtěli ověřit, zda-li methotrexát (MTX) nezvyšuje hladinu exprese HSPA1A a HSPA1B.

Metody. Vliv MTX na hladinu mRNA HSPA1A a HSPA1B byl zkoumán u 5 jedinců bez příznaků autoimunitních nebo maligních onemocnění. 40 ml krve od každého jedince bylo odebráno do EDTA zkumavky a pomocí Ficollu byly separovány PBMC buňky. Viabilita PBMC buněk byla zkontrolována barvením trypanovou modří. PBMC buňky byly následně a inkubovány (37 °C, 5% CO₂) s 2 různými konc. MTX (5 µg/ml, 15 µg/ml) po dobu 1 h a 6 h. Poté byly buňky sklizeny a za využití Magna pure compact systému byla získána RNA. Kvalita RNA byla zkontrolována za použití Agilent Bioanalyzeru 2100, byly použity pouze vzorky s hodnotou RIN větší než 7. Hladina mRNA obou genů byla změřena za využití Sybr green technologie (Applied Biosystems, USA) a vyhodnocena za použití ddCt metody. Pro statistickou analýzu byl využit Mann Whitneyho neparametrický test s hladinou významnosti α < 0,05.

Výsledky. HSPA1A: Hladina mRNA HSPA1A nebyla po 1h inkubaci s MTX (5 µg/ml) zvýšena, naopak po 1h inkubaci s 15 µg/ml MTX došlo k mírnému zvýšení exprese HSPA1A. Po 6 h došlo naopak ke snížení exprese HSPA1A. Snížení exprese se zdá být závislé na koncentraci MTX.

HSPA1B: Hladina mRNA HSPA1B nebyla po 1h inkubaci s MTX (5µg/ml) nijak zvýšena. Po 1h inkubaci PBMC buněk při koncentraci MTX 15 µg/ml došlo ke zvýšení exprese HSPA1B. Po 6h inkubaci s MTX (5,15 µg/ml) došlo stejně jako v případě HSPA1A ke snížení exprese HSPA1B. Odpověď HSPA1B na MTX byla daleko variabilnější než u HSPA1A.

Závěr. Kultivace PBMC buněk s MTX vede k mírnému, nesignifikantnímu zvýšení hladiny mRNA HSPA1A a HSPA1B po 1h inkubaci s MTX při koncentraci (15 µg/ml). Inkubace s MTX (5 µg/ml, 15 µg/ml) po dobu 6 h vede ke snížení hladin transkriptů obou genů. MTX nezvyšuje hladinu HSPA1A a HSPA1B. Tyto výsledky ukazují, že léčba MTX nezvyšuje hladinu mRNA HSPA1A a HSPA1B. Zvýšené hladiny HSPA1A, HSPA1B mohou sloužit jako markery pro některá autoimunitní onemocnění.

Grantová podpora: Tato práce byla podpořena interní grantovou agenturou Ministerstva zdravotnictví České republiky (Nr. NT 13699) a projektem Ministerstva zdravotnictví České republiky pro konceptuální rozvoj výzkumné organizace 00023728 (Revmatologický ústav).