Deriváty pyrazinkarboxylové kyseliny jako účinné abiotické elicitory produkce isoflavonoidů

Súhrn

Genista tinctoria (Kručinka barvířská) je rostlinou obsahující isoflavonoidy, které se řadí k významným estrogenům. Kultura in vitro této rostliny produkuje více isoflavonoidů než matečná rostlina. Cílem této práce byla snaha ještě zvýšit produkci těchto látek v kalusové kultuře působením abiotických elicitorů a to derivátů pyrazinkarboxylové kyseliny. Vhodnějším elicitorem pro produkci isoflavonoidů se ukázala látka A (N-(3-jod-4-methylfenyl)pyrazin-2-karboxamid), i když naprostého maxima produkce genistinu bylo dosaženo 12hodinovým působením látky B 5‑terc-butyl-6-chlor-N-(3-jod-4-methylfenyl)pyrazin-2-karboxamid v koncentraci 2,33 . 10-3 mol/l (57 × oproti kontrole). Elicitací látkou B bylo dosaženo vyrovnanějších výsledků ve zvýšené produkci isoflavonoidů v průřezu jednotlivých odběrových časů i koncentrací.

Klíčová slova:
Genista tinctoria – isoflavonoidy – kalusová kultura – deriváty pyrazinkarboxylové kyseliny

Úvod

Rostlinné tkáňové kultury představují nadějný zdroj látek přírodního původu. Hlavním problémem jejich využití je nízká produkce většiny sekundárních metabolitů. Jednou z metod pro zvýšení tvorby těchto látek je elicitace, protože biosyntéza mnoha sekundárních metabolitů v rostlinných buňkách je součástí obranné reakce vůči biologickým nebo abiotickým stresovým vlivům^1–3). Základním předpokladem úspěšné elicitace, která se využívá ke zvýšení produkce sekundárních metabolitů, je mimo jiné nalezení vhodného elicitoru, jeho koncentrace a optimální doby působení elicitoru na rostlinnou kulturu in vitro ⁴⁾.

Role látek odvozených od pyrazinu se intenzivně studuje od sedmdesátých let 20. století. V přírodě se často vyskytují jako feromony, atraktanty či signální látky. V potravinách je najdeme jako flavoranty a fragranty – přírodní i přírodně identické. V poslední době jsou často využívány i jako součásti parfémů a v tabákovém průmyslu. Pyrazinové sloučeniny vytvářené některými druhy plísní a kvasinek mohou mít i antibiotický nebo antifungální účinek.

Významné farmakologické účinky byly zjištěny i u syntetických derivátů pyrazinu. Pyrazinový kruh je farmakoforem především u menších molekul, nicméně je součástí široké palety účinných látek. Molekulu pyrazinu obsahují například sulfonamidová chemoterapeutika, kalium šetřící diuretikum amilorid, perorální antidiabetikum glipizid a pyrazin najdeme i v hypnotiku eszopiklon. Od pyrazinu je odvozeno i antituberkulotikum pyrazinamid, konkrétně amid pyrazin-2-karboxylové kyseliny. K perspektivním látkám s antimykobakteriálním účinkem patří jednoduché chlorované pyrazinové deriváty, které se chovají jako proléčivo, tedy estery a amidy pyrazin-2-karboxylové kyseliny ⁵⁾. Látky typu substituovaných pyrazin-2-karboxamidů byly zkoumány nejen pro svůj potenciální antimykobakteriální účinek, ale většina z nich vykazovala i účinek herbicidní a ukázaly se i vhodnými abiotickými elicitory ⁶⁾. Většina látek popsaných Doležalem a kol. inhibovala elektronový transport při fotosyntéze v chloroplastech špenátu. Míra inhibice produkce kyslíku byla ovlivněna lipofilitou a elektronakceptorovými vlastnostmi substituentů dané sloučeniny. Některé z látek redukovaly obsah chlorofylu v Chlorella vulgaris ⁷⁾.

Substituované pyrazin-2-karboxamidy byly použity jako elicitory u kalusové kultury Ononis arvensis (L.), kde se po 12 hodinové elicitaci jednou z pěti testovaných látek tohoto typu zvýšila produkce flavonoidů o 900 % oproti kontrole. Výrazného navýšení produkce bylo dosaženo i po 48 a 72hodinové elicitaci a navíc k určitému nárůstu produkce flavonoidů došlo po aplikaci všech testovaných látek ⁶⁾.

Další nově syntetizované látky typu substituovaných pyrazin-2-karboxamidů byly použity k elicitaci kalusové a suspenzní kultury Silybum marianum (L.) Gaertn. I v tomto případě došlo k významnému ovlivnění produkce sekundárních metabolitů – flavolignanů ⁸⁾.

Genista tinctoria je 10–100 cm vysoký keř nebo polokeř s vystoupavým nebo poléhavým kmínkem. V České republice se vyskytuje roztroušeně až hojně od nížin až po podhůří. Sbírá se kvetoucí nať – Genistae tinctoriae herba, která působí močopudně, zvyšuje chorobně snížený tlak, čistí krev a ovlivňuje metabolismus. V lidovém léčitelství je používána proti dně, revmatismu a při ledvinových kamenech ¹⁰⁾.

Droga obsahuje důležité isoflavonoidy – známou skupinu látek s estrogenní aktivitou, tzv. fytoestrogeny a chinolizidinové alkaloidy (cytisin, spartein, methylcytisin, anagyrin) ^{9, 10)}. Fytoestrogeny jsou funkčně definovány jako látky, které v savčím organismu vykazují estrogenní aktivitu, navíc jejich molekula je i strukturálně podobná hlavnímu savčímu estrogenu 17ß-estradiolu. Mezi přírodně se vyskytující isoflavonoidy s estrogenní aktivitou řadíme především aglykony daidzein (4’,7-dihydroxyisoflavon) a genistein (4’,5,7-trihydroxyisoflavon) a jejich glykosidy daidzin a genistin. Dále se jedná o aglykony biochanin A a formononetin, což jsou 4’ methylethery genisteinu a daidzeinu. Pro získávání isoflavonoidů je dnes nejvíce využívána čeleď Fabaceae – např. sója (Glycine max) nebo jetel (Trifolium pratense). Dalšími, především potravinovými zdroji, jsou semena a ořechy bohaté na oleje – např. slunečnicová semínka (Helianthus spp., Asteraceae) a vlašské ořechy (Juglans regia L., Juglandaceae). Isoflavonoidy byly prokázány i v čeledích Iridaceae či Euphorbiaceae. Fytoestrogeny svým působením v organismu zasahují do průběhu mnoha typů onemocnění od rakoviny prostaty a prsu po ovlivnění kardiovaskulárních onemocnění. Jsou čím dál častěji používány při kompenzaci menopauzálních symptomů a jako podpůrná léčba při osteoporóze ^{9, 13, 14)}. I zde se ovšem objevují pochybnosti o jejich přínosu. Vzhledem k jejich možné podpoře proliferace nádorových buněk u hormon-dependentních nádorových onemocnění je zvážení poměru přínosu a rizik stále předmětem mnoha studií.

Łuckiewicz et al. zkoumali šest druhů rodu Genista z hlediska produkce isoflavonoidů. Zabývali se různými metodami kultivace včetně vlivu morfogeneze na množství a zastoupení jednotlivých isoflavonoidů. Testovány byly kultury suspenzní, kalusové, embryonální, kořenové i prýtové. Bylo zjištěno, že kultury in vitro produkovaly zpravidla více isoflavonoidů než matečné rostliny, a to dokonce 6–9×. Kultury in vitro narozdíl od matečných rostlin neprodukovaly jednoduché flavonoidy – luteolin a apigenin. Jejich syntéza je prokazatelně potlačena při in vitro podmínkách, jelikož v regenerovaných rostlinách byla jejich tvorba znovu obnovena. Potlačena byla i syntéza chinolizidinových alkaloidů. V kořenových kulturách byl naproti tomu prokázán vysoký obsah isoliquiritigeninu – prekurzoru isoflavonoidů – naprosto chybějícího v matečných rostlinách. Ve všech kulturách byly isoflavonoidy akumulovány jako intracelulární metabolity. Obsah isoflavonoidů byl výrazně ovlivněn stupněm tkáňové morfogeneze. Studie ukázaly negativní vztah mezi procesem organogeneze a akumulací isoflavonoidů – aglykonů i glykosidů. Naopak pozitivně morfogeneze ovlivňovala tvorbu esterů genistinu. Nejvyšší obsah genistin malonátu a acetátu byl zaznamenán v prýtové kultuře. Skupina produkovaných isoflavonoidů byla tvořena 14 sloučeninami s jasnou dominancí genistinu. Z testovaných druhů byla nejvyšší produkce isoflavonoidů potvrzena u suspenzní a kalusové kultury Genista tinctoria. Nejvhodnějším médiem se pak ukázalo SH médium (Schenk-Hildebrandt) s přídavkem 22,6 μmol^-1 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny (2,4-D), 23,2 μmol^-1 kinetinu a 3 % (w/v) sacharosy ^{9, 11, 12)}.

POKUSNÁ ČÁST

Použitý rostlinný materiál

Byla použita kalusová kultura odvozená z kořenové části klíční rostliny Genista tinctoria v 16. až 28. pasáži.

Kultivace kultur in vitro a elicitace

Kalusová kultura Genista tinctoria byla kultivována na médiu sestaveném dle Schenka Hildebrandta ¹⁵⁾. Jako růstové regulátory byly přidány: kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová v koncentraci 0,5 mg/l a kinetin v koncentraci 0,1 mg/l. Pasážování bylo prováděno v prostředí laminárního boxu. Kultura rostla po dobu 30 dní při teplotě 25 °C při normálním světelném režimu (16 hodin světlo, 8 hodin tma). Jako elicitory byly použity ethanolické roztoky látky A a B, a to ve třech koncentracích (obr. 1, 2):

látka A:N-(3-jod-4-methylfenyl)pyrazin-2-karboxamid)

c_A1 = 100 mg/100 ml (2,95 . 10^-3 mol/l);
c_A2 = 10 mg/100 ml (2,95 . 10^-4 mol/l)
c_A3 = 1 mg/100 ml (2,95 . 10^-5 mol/l)

látka B: (5-terc-butyl-6-chlor-N-(3-jod-4-methylfenyl)pyrazin-2-karboxamid)

c_B1 = 100 mg/100 ml (2,33 . 10^-3 mol/l);
c_B2 = 10 mg/100 ml (2,33 . 10^-4 mol/l)
c_B3 = 1 mg/100 ml (2,33 . 10^-5 mol/l)

Pro každou koncentraci látky A i B bylo použito vždy 36 baněk, které byly rozděleny do šesti skupin dle časů elicitace. Byl aplikován vždy 1ml roztoku dané látky v dané koncentraci ke kalusové kultuře. Kultura byla po aplikaci elicitoru udržována za stejných podmínek jako při kultivaci. Vzorky byly odebírány po 6, 12, 24, 48, 72 a 168 hodinách po aplikaci elicitoru. Po dané době elicitace byly kalusy vyjmuty z baněk a usušeny na filtračním papíře při laboratorní teplotě. Usušené vzorky byly následně upráškovány a použity ke stanovení obsahu isoflavonoidů. Jako kontrola sloužila kalusová kultura bez přídavku elicitoru. Bylo sledováno i vylučování metabolitů do živného média. Médium bylo odebíráno vždy společně s kalusem ve zmíněných odběrových časech. Odebrané médium bylo odpařeno a dále byl v odparku stanoven obsah isoflavonoidů.

Stanovení obsahu isoflavonoidů ¹⁹⁾

Přibližně 0,100 g usušeného a upráškovaného kalusu bylo extrahováno s 10 ml 80% methanolu na vodní lázni pod zpětným chladičem 20–30 minut. Po ochlazení se výluh zfiltroval přes chomáček vaty. Extrakce byla opakována ještě jednou za stejných podmínek. Získané výluhy se spojily a doplnily na objem 25 ml. Vytřepáním v 10 ml petroletheru byl extrakt zbaven tuků a chlorofylu. Přibližně 2 ml výluhu byly přefiltrovány přes mikrofiltr do označených vialek a analyzovány pomocí metody HPLC.

Vzorky média byly nejprve odpařeny na vodní lázni do sucha a poté vysušeny v sušárně při 105 °C. Sušina byla rozpuštěna v 5 ml methanolu, vzniklý roztok zfiltrován přes mikrofiltr a množství o objemu přibližně 1,7 ml bylo převedeno do vialek. Poté byly vzorky analyzovány pomocí HPLC.

Parametry HPLC analýzy

Chromatograf: sestava Jasco; čerpadlo: PU-2089; autosampler: AS-2055; kolona: Li Chrospher RP – 18 250 × 4, sorbent Li Chrospher 5 μm; předkolonový filtr, ochranná předklonka; objem nástřiku:20 μl; detekce: DAD MD – 2015, λ = 190–450 nm, vyhodnoceno při λ = 260 nm; mobilní fáze: methanolický roztok 0,15% kyseliny fosforečné; eluční profil: 0–9 min., gradientová eluce, z t = 0 min, 30% methanol na t = 9 min, 80% methanol, 9–15 min, isokratická eluce, 80% methanol.

Standardy: genistin, genistein, daidzein, formononetin, biochanin A; průtoky: 1,1 ml/min.

VÝSLEDKY A DISKUZE

Elicitace je jednou z metod vhodných k ovlivnění produkce sekundárních látek v kulturách in vitro ¹⁶⁾. Jedním ze základních předpokladů úspěšné elicitace, která povede k požadovanému zvýšení produkce sekundárních látek, je nalezení vhodného elicitoru, jeho koncentrace a optimální doby působení elicitoru na rostlinnou kulturu in vitro ¹⁷⁾.

Cílem naší práce bylo prověřit potenciál nově nasyntetizovaných látek typu substituovaných pyrazin-2-karboxamidů jako elicitorů u kalusové kultury Genista tinctoria.

Po aplikaci látky A v koncentraci c_A1 došlo v kalusové kultuře Genista tinctoria k vysokým nárůstům obsahu genistinu. Po 6hodinovém působení byl zaznamenán dvanáctinásobný nárůst oproti kontrole a po 12hodinovém působení dokonce zvýšení obsahu genistinu 28× oproti kontrole. Po 24, 48, 72, 168 hodinách byla produkce genistinu také zvýšena a to minimálně o 120 % (po 168 hodinách). Obsah daidzeinu ve většině vzorků poklesl oproti kontrole, jen po 48 hodinové elicitaci byl jeho obsah na úrovni kontroly. Elicitovaná kultura tvořila od 0,04 % (6 hod.) do 0,47 % (48 hod.) genisteinu. Byl detekován i formononetin (0,01 %) a to v čase 48 a 72 hodin elicitace. V kontrolním vzorku byl pod detekovatelnou hranicí. Biochanin A po elicitaci prokázán nebyl stejně jako v kontrolním vzorku (tab. 1).

Jak vyplývá z tabulky 1 po aplikaci látky A o koncentraci c_A2 došlo k ještě významnějšímu navýšení obsahu genistinu. Maximální zvýšení jeho produkce látkou A bylo dosaženo po 6 hodinách elicitace, a to 33× proti kontrole. V ostatních odběrových časech byla jeho produkce zvýšena také velmi výrazně. Minimální navýšení dosahovalo 900 % proti kontrole a bylo zaznamenáno po 168 hodinách působení elicitoru. Obsah daidzeinu (0,01%), který byl v kontrolním vzorku zaznamenán, byl navýšen po 168 hodinové elicitaci pětinásobně. V ostatních odběrových časech ovšem jeho množství buď bylo stejné jako ve vzorku kontrolním, nebo kleslo pod detekovatelnou mez. I po aplikaci koncentrace c_A2 došlo k navýšení tvorby genisteinu, i když ne tak výrazně jako po aplikaci látky A o koncentraci c_A1. Zde bylo maximum produkce dosaženo až po 168 hodinách působení elicitoru a obsahem genisteinu 0,17 %. Formononetin ani biochanin A detekovány nebyly.

Navýšení syntézy isoflavonoidů bylo dosaženo i působením látky A o koncentraci c_A3, ovšem u genistinu a genisteinu bylo o něco menší než u koncentrací předchozích. Nejvyšší nárůst genistinu byl zaznamenán po 48hodinové elicitaci, a to 9× a u genisteinu byl zaznamenán maximální obsah 0,06 % po 168 hodinách. Naopak tato koncentrace stimulovala lépe syntézu daidzeinu a formononetinu. Po 72 hodinách elicitace byla navýšena produkce daidzeinu 6× oproti kontrole. Jeho obsah byl vyšší i u kalusů elicitovaných 24 a 168 hodin. Ve zbylých odběrových časech byl jeho obsah nedetekovatelný stejně jako v případě kontroly. Obsah formononetinu byl detekovatelný po 12, 24, 48 a 72 hodinách, přičemž v posledním uvedeném čase dosáhl maxima, a to 0,02 %. Biochanin A nebyl detekován ani po aplikaci této koncentrace (tab. 1).

Po aplikaci látky B v koncentraci c_B1 došlo po 12hodinovém působení elicitoru k vůbec nejvyššímu navýšení produkce genistinu. Jeho obsah byl zvýšen 57× oproti kontrole. Vysokého obsahu genistinu bylo dosaženo i po 24hodinovém působení elicitoru, kde byl jeho obsah zvýšen 14×, ovšem v ostatních časech byl obsah genistinu buď zvýšen jen nevýrazně, nebo naopak snížen oproti kontrole. Po 12 a 24 hodinách elicitace byl ve vzorku prokázán i obsah daidzeinu (na úrovni kontroly), genisteinu (navýšení oproti kontrole) a formononetinu (navýšení oproti kontrole). Ve zbylých vzorcích nebyly daidzein, genistein ani formononetin detekovatelné. Biochanin A nebyl detekován v žádném ze vzorků (tab. 2).

Po aplikaci látky B o koncentraci c_B2 došlo k výraznějšímu navýšení produkce pouze u daidzeinu po 168hodinové elicitaci, a to o 200 %. V tomto případě bylo také zjištěno navýšení produkce genisteinu, ale pouze o 40 %, a obsah formononetinu dosáhl 0,11 %, přičemž v kontrole nebyl detekovatelný. V ostatních odběrových časech byla produkce isoflavonoidů buď na úrovni kontroly, nebo snížená (tab. 2).

Působením elicitoru o koncentraci c_B3 bylo dosaženo obecné snížení tvorby isoflavonoidů. Jedinými dvěma výjimkami je navýšení obsahu daidzeinu po 168 hodinách působení elicitoru a detekovatelný obsah formononetinu po 6 a 12 hodinách. Jinak ve většině vzorků byl obsah isoflavonoidů pod detekovatelnou mezí (tab. 2).

Výhodnějším elicitorem pro produkci isoflavonoidů se ukázala být látka A, protože bylo dosaženo vyrovnanějších výsledků (zvýšené tvorby isoflavonoidů) v průřezu jednotlivých odběrových časů i koncentrací. Naprostého maxima produkce genistinu (57 násobného) však bylo dosaženo 12hodinovým působením látky B v koncentraci c_B1 oproti kontrole.

Bylo sledováno i vylučování isoflavonoidů do živného média. V žádném z testovaných vzorků nebyla prokázána detekovatelná hladina isoflavonoidů.

Látky typu pyrazin-2-karboxamidů byly jako potenciální elicitory popsány i Doležalem a kol. ⁶⁾ u kalusové kultury Ononis arvensis. Testováno bylo celkem pět látek typu substituovaných pyrazin–2–karboxamidů. Nejvyššího zvýšení produkce flavonoidů bylo dosaženo aplikací 6-chlor-N-(3-jod-4-methylfenyl)pyrazin-2-karboxamidu. Po 12hodinovém působení na tkáňovou kulturu Ononis arvensis bylo dosaženo navýšení produkce flavonoidů v tkáňové kultuře o 900 %. Vysoký obsah flavonoidů byl zjištěn i po 48 a 72hodinovém působení stejné látky. I u ostatních testovaných látek byl obsah navýšen, i když ne tak výrazně.

Zvýšená produkce flavonoidů v kalusové kultuře Ononis arvensis a flavolignanů v kalusové kultuře Silybum marianum po elicitaci látkami typu substituovaných amidů pyrazinkarboxylových kyselin testovala i Tůmová a kol. ¹⁸⁾. Jako elicitory byly testovány N-(3-jod-4-methylfenyl)pyrazin-2-karboxamid a 5-terc-butyl-N-(3-jod-4-methylfenyl)pyrazin-2-karboxamid. U kultury Ononis arvensis byla testována pouze první z uvedených látek a produkci flavonoidů zvyšovala jen minimálně nebo vůbec. Nejvyšší produkce flavonoidů bylo dosaženo po 168hodinové elicitaci u této kultury, a to o 88 %. Při elicitaci kalusové kultury Silybum marianum oběma látkami byl zaznamenán jen nižší nárůst produkce flavolignanů. Za použití N-(3-jod-4-methylfenyl)pyrazin-2-karbo- xamidu se nejvyšší tvorby silychristinu podařilo dosáhnout po 6hodinové elicitaci, kdy jeho obsah byl dvojnásobný oproti kontrole. Šestihodinovou elicitací 5 terc--butyl-N-(3-jod-4-methylfenyl)pyrazin-2-karboxamidem bylo dosaženo jedenáctinásobného navýšení obsahu silychristinu oproti kontrole, což bylo celkově nejvyšší navýšení. Zvýšená tvorba flavolignanů byla zjištěna i při elicitaci kalusové a suspenzní kultury Silybum marianum látkami typu terc-butyl-N-(3-methylfenyl)pyrazin-2-karboxamidu a 5-terc-butyl-6-chlor-N--(5-brom-2-hydroxyfenyl)pyrazin-2-karboxamidu ⁸⁾. Maximální produkce flavolignanů se podařilo dosáhnout 72hodinovou elicitací suspenzní kultury 5-terc-butyl-N--(3-methylfenyl)pyrazin-2-karboxamidem o koncentraci 3,71 . 10^-7 mol . l^-1, přičemž bylo dosaženo navýšení produkce o 893 % oproti kontrolnímu vzorku. Po 24hodinové elicitaci kalusové kultury 5-terc-butyl-6-chlor-N-(5--brom-2-hydroxyfenyl)pyrazin-2-karboxamidem o koncentraci 2,59. 10^-4 mol . l^-1 byl dokonce zaznamenán nárůst produkce flavolignanů o 1039 %. Z dostupné literatury vyplývá, že se jako elicitory velmi dobře uplatňují zvláště jodované deriváty pyrazin-2-karboxamidů. Potvrzuje to ve své práci i Doležal a kol. ⁶⁾. Ačkoliv elicitací tkáňové kultury Ononis arvensis nebylo dosaženo aplikací jodovaných pyrazin-2-karboxamidů výrazného navýšení produkce flavonoidů (pouze o 88 %), u tkáňové kultury Silybum marianum se podařilo aplikací těchto látek dosáhnout značného navýšení produkce sekundárních metabolitů¹⁸⁾. Z tohoto hlediska se zdá být potenciál těchto jod-derivátů velmi nadějný.

Práce byla vypracována za finanční podpory Výzkumného záměru MSM 0021620822.

Adresa pro korespondenci:
doc. PharmDr. Lenka Tůmová, CSc.
Katedra farmakognozie FaF
Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové
e-mail: tumova@faf.cuni.cz