Pokroky ve využití instrumentálního měření barevnosti ve vývoji, výrobě a v kontrole jakosti léčiv, léčivých přípravků a farmaceutických pomocných látek I 

Súhrn

Barevnost je jedním z důležitých ukazatelů jakosti léčiv, léčivých přípravků a farmaceutických pomocných látek. Příspěvek shrnuje vývoj a využití instrumentálního měření barevnosti ve farmacii v posledních 10 letech se zaměřením na léčiva syntetického původu a farmaceutické pomocné látky včetně jejich analytiky.

Klíčová slova:
měření barevnosti • barevné prostory • léčiva a léčivé přípravky • pomocné látky • analytické aplikace

Úvod a vývojové trendy

Měření barevnosti je založeno na číselném vyjadřování barev v trichromatickém systému. Přestože barevnost patří mezi důležité ukazatele, není její instrumentální (a tedy objektivní) měření ve vývoji, výrobě a v kontrole jakosti léčiv, léčivých přípravků a farmaceutických pomocných látek dosud běžnou metodou. Příspěvek navazuje na předcházející zpracování problematiky¹⁾ a shrnuje vývojové trendy a aplikace z posledních 10 let se zaměřením na léčiva syntetického původu a farmaceutické pomocné látky včetně jejich analytiky. I nadále v nich převládá využití parametrů barevného prostoru CIE L*a*b*, CIELAB, v polárních souřadnicích L*C*h, CIELCH. Častěji používán v různých praktických aplikacích je také vývojově starší barevný prostor podle Huntera (Hunter L,a,b), odvozený z barevného prostoru CIE XYZ odlišným způsobem výpočtu souřadnic. Důsledkem pokračujícího vývoje v měření barevných rozdílů je testování a zavádění vzorců zpřesňujících CIELAB, jako CIE94, CIEDE2000, CMC2, ³⁾ a GLAB⁴⁾, které jsou však zatím více než ve farmacii využívány při hodnocení stomatologických^5–7) a jiných⁴⁾ materiálů a přípravků. Barevné prostory CIELAB (např. stanovení nízkých koncentrací riboflavinu jako barviva v tabletách⁸⁾ nebo při identifikaci grafenů⁹⁾ perspektivních v cíleném transportu léčiv či kontrole procesu sušení při výrobě léčiv¹⁰⁾), RGB (např. kontrola tablet v blistrech¹¹⁾, identifikace tablet¹²⁾, detekce padělků přípravků Viagra a Cialis¹³⁾ anebo hodnocení jakosti tradičních čínských léčiv¹⁴⁾ či HSV¹⁵⁾ jsou také východiskem k novým technikám používajícím měření barevnosti a z nich odvozeným kontrolním postupům. Souběžně jsou různé barevné prostory (např. CIELAB, ANLAB, Hunter L,a,b, CIE XYZ¹⁶⁾, CIELAB, CIELCH, CIELUV¹⁷⁾, CIE XYZ, CIELAB, RGB¹⁸⁾, HSV a RGB¹⁵⁾, RGB, CMYK a další¹⁹⁾, používány spíše výjimečně. Častěji než dříve jsou publikovány práce metodického charakteru zaměřené na potřeby a problematiku farmaceutického průmyslu^20–23). Narůstá počet analytických a dalších aplikací využívajících místo měření spekter odrazu či prostupu s následným výpočtem kolorimetrických parametrů či přímých měření zpravidla volitelných kolorimetrických parametrů, skenování či digitální fotografii (jejich porovnání viz např.¹⁹⁾ s následným rozkladem digitálního obrazu na jednotlivé barevné složky v barevném prostoru RGB.

Léčiva a léčivé přípravky

Instrumentální měření barevnosti (L*a*b*) bylo použito ke sledování změn zbarvení léčiv při jejich interakci s mezoporézními materiály, např. mefenamové kyseliny se silikagelem FSM-16²⁴⁾ a indometacinu s komerčně dostupným mezoporézním materiálem s různou velikostí pórů²⁵⁾.

Častěji bylo instrumentální měření barevnosti použito při sledování fotostability léčiv a léčivých přípravků. Polymorfy nikardipin-hydrochloridu při tomto sledování vykázaly různé hodnoty rozdílu barevnosti ∆E, přičemž rozmělnění krystalů nemělo na tyto hodnoty výraznější vliv²⁶⁾. Při studiu fotostability pelet připravených z polymorfů tamoxifen-citrátu byly u jednotlivých polymorfů rovněž zjištěny různé hodnoty rozdílů barevnosti (L*a*b*) ∆E²⁷⁾. Při sledování fotostability amlodipinu a dalších léčiv ze skupiny derivátů dihydropyridinu u látky označené ve studii jako sloučenina A rozsah změn ∆E neodpovídal poklesu obsahu sledované látky zjištěnému HPLC. Po úvodní větší změně hodnota ∆E stagnovala, zatímco obsah sloučeniny A klesal dál²⁸⁾. V rámci sledování fotostability riboflavinu byly zjištěny reverzibilní změny barevnosti (L*a*b*) ∆E při ozařování vzorků střídaném s jejich uchováváním v temnu²⁹⁾. V další studii byla sledována a porovnávána fotostabilita riboflavinu získaného syntetickou a biosyntetickou cestou se závěrem, že biosyntetický riboflavin je méně stabilní, přičemž změny zbarvení jako hodnoty ∆E závisí na vlhkosti a nelze je vysvětlit vznikem rozkladných produktů³⁰⁾. Při sledování fotostability ofloxacinu v substanci a v tabletách nebyla zjištěna závislost mezi změnami zbarvení ∆E (CIELAB) a poklesem obsahu léčiva nebo jeho protimikrobní aktivity³¹⁾. V rámci hodnocení fotostability alginátových pěn obsahujících kurkumin a určených k protimikrobní fotodynamické terapii u pěn s různým složením pomocných látek (PEG 400, cyklodextriny) nekorelovaly hodnoty ∆E (CIELAB) jednoznačně s úbytkem léčiva³²⁾. V práci³³⁾ byla sledována fotostabilita a barevné změny (∆E) mekvitazinu ve směsi s oxidem titaničitým (anatas a rutil), který snižuje fotostabilitu léčiva. Fotostabilitu methyldopy zvýšila její povrchová úprava roztoky antioxidantů (kyselina askorbová, butylhydroxytoluen, cystein-hydrochlorid, ke sledování barevných změn ∆E byl použit systém L*a*b*)³⁴⁾.

Vliv radiační sterilizace na zbarvení léčiv, byl sledován u fluorochinolonů (gatifloxacin, norfloxacin, sparfloxacin) a cefalosporinů (cefdinir, cefpodoxim, cefuroxim)^{18, 35)} s použitím řady kolorimetrických prostorů a parametrů: CIE XYZ, CIELAB, RGB, ∆E, dominantní vlnová délka, excitační čistota, index žlutosti. Ke sterilizaci bylo použito gama záření a jako alternativa elektronový paprsek, který barevnost cefalosporinů ovlivňoval méně a barevnost fluorochinolonů více než gama záření¹⁸⁾. V práci³⁵⁾ byl sledován kolorimetricky s využitím různých barevných prostorů a kolorimetrických parametrů a řadou dalších metod vliv radiační sterilizace u gatifloxacinu a norfloxacinu se závěrem, že obě léčiva lze radiačně sterilizovat dávkou 25 kGy.

V několika dalších pracích bylo použito instrumentální měření barevnosti při popisu, vývoji a v kontrole jakosti tablet. V prvních z nich^{36, 37)} byly použity hodnoty souřadnic v barevném prostoru RGB získané skenováním barevných tablet obsahujících drotaverin-hydrochlorid anebo nitroxolin a obrazovou analýzou skenů k číselnému popisu jejich zbarvení s verifikací při řešení technologických problémů (složení tablet a jejich stabilita). V práci³⁸⁾ byla pomocí parametrů barevného prostoru CIELAB studována kompatibilita a stabilita rabeprazolu s kombinaci s různými pomocnými látkami v tabletách. U kombinací obsahujících stearan zinečnatý byla zjištěna nelineární (exponenciální) korelace mezi hodnotami ∆E a obsahem rozkladných produktů léčiva zjištěným HPLC. Parametry barevného prostoru CIELAB (L*, a*, b*, ∆E) byly použity také při hodnocení vzhledu modelových tablet obsahujících žlutý oxid železitý v závislosti na lisovacím tlaku³⁹⁾.

Kolorimetrické parametry barevného prostoru podle Huntera byly měřeny a vyčísleny souběžně s tvrdostí barevných a bílých tablet obsahujících theofylin⁴⁰⁾. Byla zjištěna lineární korelace mezi tvrdostí tablet a hodnotami chroma (C*) a tento ukazatel byl navržen jako parametr vhodný k detekci odchylek v tvrdosti tablet při jejich výrobě. Vliv sekundárních obalů a dalších faktorů na stabilitu kyseliny acetylsalicylové v barevných tabletách obsahujících další účinné a pomocné látky a na stabilitu zbarvení těchto tablet byl studován autory⁴¹⁾. Byla zjištěna závislost hodnot ∆E na míře rozkladu kyseliny acetylsalicylové stanoveném HPLC.

V dalších pracích bylo instrumentální měření barevnosti použito při řešení problémů obalování pelet⁴²⁾ anebo tablet⁴³⁾. K hodnocení zbarvení produktu a jeho uniformity bylo použito hodnot ∆E^{42, 43)} a relativních směrodatných odchylek těchto hodnot⁴²⁾.

Při studiu vhodného složení a stability gelu obsahujícího tretinoin byla z kolorimetrických parametrů použita hodnota ∆E (Hunter), která narůstala lineárně s teplotou a dobou uchovávání osvětleného gelu⁴⁴⁾.

Ke kontrole účinnosti stabilizace nízké úrovně zbarvení Castellanova roztoku bez fuchsinu edetanem disodným byly použity parametry barevného prostoru CIELAB (hodnoty ∆E ze spekter propustnosti) se závěrem, že vhodným přídavkem je 0,03 % stabilizátoru⁴⁵⁾.

Farmaceutické pomocné látky

Vztah mezi chemickým složením, mineralogickými parametry a barevností španělských kaolinů (CIELCH L*C*h a některé další kolorimetrické ukazatele) studovali autoři⁴⁶⁾. Jinou kolorimetricky sledovanou pomocnou látkou (L*C*h CIELCH a index žlutosti) byl kukuřičný škrob modifikovaný ozářením elektronovým paprskem (dávka 52 kGy). Změny hodnot kolorimetrických parametrů po ozáření byly malé (∆E = 1,4)⁴⁷⁾. Obdobné byly závěry při sledování změn barevnosti arabské gumy modifikované ozařováním ultrafialovým zářením (254 nm, 30 W, 120 min). Byly sledovány parametry barevného prostoru CIE L*a*b*, jejich hodnoty se ozářením prakticky nezměnily⁴⁸⁾. Další aplikace instrumentálního měření barevnosti byly zaměřeny na panenský olivový olej17, ^49–51). Ve studii⁴⁹⁾ bylo zkoumáno 1700 vzorků s použitím kolorimetrických parametrů barevného prostoru XYZ CIE včetně méně běžných (dominantní vlnová délka, kolorimetrická čistota, excitační čistota) se závěrem, že kolorimetrické parametry lze použít nejen k objektivnímu popisu zbarvení jednotlivých vzorků, ale i k rychlému odhadu obsahu chlorofylů a karotenoidů. Obdobné byly závěry ze studia stejného počtu vzorků panenského olivového oleje s použitím parametrů barevných prostorů CIELUV a CIELAB¹⁷), kde bylo dosaženo v regresních analýzách hodnot korelačních koeficientů až 0,9. V práci⁵⁰⁾ byl na základě výsledků kolorimetrických měření 107 vzorků (z toho 90 vzorků panenského oleje) vymezen prostor (CIELAB L*a*b*), ve kterém by se měly pohybovat hodnoty číselných ukazatelů barevnosti vyhovujícího panenského olivového oleje. Parametry barevných prostorů CIELAB a CIELCH byly použity ke sledování stability panenského olivového oleje vůči oxidaci. Oxidace měla u všech vzorků za následek změny hodnot parametru C* charakterizujícího barevný odstín vzorku a pouze u některých pokles hodnot L* ⁵¹⁾.

K objektivnímu popisu barviv zahrnutých do studie⁵²⁾ byly použity parametry barevného prostoru CIELAB a CIELCH (L*,a*, b*,C*, h), přičemž v některých případech jde o barviva povolená k přípravě léčivých přípravků, tedy FPL. Tytéž parametry byly použity při studiu vztahu mezi chemickou strukturou a zbarvením většího počtu karotenoidů, mezi nimiž jsou rovněž látky povolené k přípravě léčivých přípravků, jako β-karoten, lutein, lykopen⁵³⁾.

Analytické aplikace

Práce využívající instrumentální měření barevnosti v analytice jsou stejně jako aplikace metody v jiných oblastech založeny nejčastěji na měření spekter odrazu či propustnosti ve viditelné oblasti a následném výpočtu kolorimetrických parametrů, nebo na přímém měření kolorimetrických parametrů. V posledním desetiletí pak také na digitálním zobrazování skenováním, digitální fotografií či webovou kamerou a následném rozkladu obrazu na jeho složky, zpravidla v barevném prostoru RGB. Instrumentální měření barevnosti na základě spekter propustnosti bylo použito mimo oblast vlastních analytických aplikací také při hodnocení porovnávacích barevných roztoků používaných v lékopisné kontrole jakosti léčiv^{54, 55)} a stability jejich zbarvení⁵⁶⁾ v barevném prostoru CIELAB. Výsledky (hodnoty ∆E a jejich změny) ukázaly, že stabilita porovnávacích barevných roztoků podle Českého lékopisu je časově omezena, nejsou však natolik nestálé, aby bylo nutné připravovat je pro metodu II až těsně před použitím⁵⁶⁾.

Hodnoty souřadnic barevného prostoru CIE L*, a*, b* získané ze spekter prostupu nebo odrazu ve viditelné spektrální oblasti byly použity spolu se specifikací podle karet Munsellova atlasu barev k popisu a hodnocení barevných reakcí (dvě skupinová a tři selektivnější zkoumadla) použitých k identifikaci některých fluorochinolonů v tabletách (norfloxacin, ciprofloxacin, gatifloxacin, sparfloxacin, levofloxacin, ofloxacin) a k detekci tablet bez účinné látky⁵⁷⁾.

Autoři⁵⁸⁾ pomocí parametrů barevných prostorů CIELAB, CIELCH a některých dalších kolorimetrických ukazatelů podrobili kritickému hodnocení zkoušku Evropského lékopisu na přítomnost organických nečistot v kaolinu. Zjistili, že test dává správné výsledky pouze při obsahu organických nečistot > 1 %, při jejich nižším obsahu barevné změny vyvolané žíháním nekorelují s obsahem organických nečistot ve vzorku.

Kvantitativní analytika založená na instrumentálním měření barevnosti využívá lineární (anebo i nelineární) závislosti hodnot vhodně voleného kolorimetrického parametru na koncentraci analytu po jeho reakci s vhodným chromogenním činidlem. Autoři^{59, 60)} studovali stanovení lokálních anestetik prokainu a lidokainu (a mimoto cetrimonium-bromidu) jako barevných iontových asociátů s alizarinovou červení S po jejich extrakci chloroformem⁵⁹⁾, resp. s alizarinovou červení C jako barevných adsorbátů na γ-Al₂0₃ ⁶⁰⁾ (CIE XYZ, CIE L*a*b* a řada dalších kolorimetrických parametrů). Jejich závislosti na koncentraci analytu byly v dostatečně širokém rozmezí koncentrací lineární (korelační koeficient 0,99)⁵⁹⁾, přesnost stanovení 0,45 μg (cetrimonium-bromid) a 3,3 μg . ml^-1 (prokain a lidokain) v modelovém roztoku byla charakterizována relativní směrodatnou odchylkou 3–5 %60). Ke stanovení cysteinu v přípravku obsahujícím kyselinu askorbovou byl použit termoresponzivní kopolymer vázaný na povrchu nanočástic zlata⁶¹⁾. V barevném prostoru CIELAB se hodnoty souřadnice a* měnily v dostatečném rozmezí lineárně s koncentrací cysteinu a výsledky stanovení cysteinu se shodovaly s výsledky analýz HPLC⁶¹⁾. Analogický princip byl popsán a použit ke stanovení glutathionu v očních kapkách (hodnoty souřadnice a* jako analytický signál, limit detekce 2,9 . 10^-11 mol . ml^-1)⁶²⁾.

Autoři⁶³⁾ popisují instrumentálně méně náročnou metodu stanovení malých množství hliníku založenou na reakci hlinitých iontů s pyrokatechinovou violetí, alternativně za přítomnosti cetyltrimethylamonium-bromidu. Při lineární závislosti hodnot souřadnic barevného prostoru CIE X nebo Y anebo (pouze při alternativě s tenzidem) souřadnice L* barevného prostoru CIELAB na koncentraci hliníku byl limit detekce barevného komplexu adsorbovaného na adsorbentu Silochrom S-120 (varianta s tenzidem) nebo na anexu AV-17 (varianta bez tenzidu) nižší než 1 ng hliníku . ml^-1. Vzhledem k tomu, že kontrola obsahu hliníku v čištěné vodě vysoké čistoty se provádí podle platného lékopisu spektrofluorimetricky, lze nový postup vzhledem k jeho citlivosti považovat za nadějnou instrumentálně méně náročnou alternativu.

Pokud jde o aplikace využívající obrazovou analýzu, digitální záznamy jsou při nich rozkládány na jednotlivé souřadnice v barevném prostoru RGB a jejich hodnoty (často dál přepočtené) jsou korelovány s koncentrací analytu. Autoři⁶⁴⁾ porovnali výsledky tohoto postupu (digitální obraz získán skenováním) s výsledky získanými přímým měřením kolorimetrických parametrů např. u barevných produktů reakce kyseliny salicylové s diazoniovou solí a cetrimonium-bromidu s bromfenolovou modří, adsorbovaných na polyuretanové pěně. Nebyly přitom zjištěny zřetelnější rozdíly.

Jako semikvantitativní byl autory označen presumptivní test k detekci a stanovení některých opiátů (morfin, kodein, heroin) po jejich reakci s Marquisovým zkoumadlem a s koncentrovanou kyselinou dusičnou, s využitím digitální fotografie výsledného zbarvení a následného rozkladu na jeho složky v barevném prostoru RGB⁶⁵⁾. Při reakci s Marquisovým zkoumadlem byla závislost kolorimetrického parametru (intenzita jednotlivých složek anebo celková intenzita zbarvení, v obou případech s alternativním přepočtem na absorbanci) na koncentraci analytu lineární v akceptovatelném rozmezí (u jednotlivých R,G,B hodnot do 0,5 mg . ml^-1 léčiva), při reakci s koncentrovanou kyselinou dusičnou byla zjištěna lineární závislost ve větším rozsahu koncentrací stanovovaných látek. Hodnoty relativní směrodatné odchylky stanovení byly u obou testů nejvýše 4,2 % a 4,9 %, většinou ale podstatně nižší. Limit detekce byl při reakci s Marquisovým zkoumadlem pro morfin 0,016 mg . ml^-1, kodein 0,014 mg . ml^-1 a heroin 0,007 mg . ml^-1, při reakci s koncentrovanou kyselinou dusičnou morfin 0,11 mg . ml^-1, kodein 0,61 mg . ml^-1 a heroin 0,17 mg . ml^-1. Stanovení amfetaminu a metamfetaminu analýzou digitální fotografie barevných reakcí léčiva s Marquisovým zkoumadlem a s nitroprussidem sodným využívá rovněž parametry barevného prostoru RGB66). Relativní směrodatná odchylka jako charakteristika přesnosti byla při použití obou zkoumadel nejvýše 4,7 % a 4,2 % (většinou ale podstatně nižší) a výsledky stanovení amfetaminu novou metodou (Marquisovo zkoumadlo, limit detekce až 1 μg . ml^-1) byly v dobré shodě s výsledky analýz GC-MS.

Další publikace se zabývají stanovením obsahu léčiv nebo znečištěnin v léčivých přípravcích. Barevné reakce jsou při nich prováděny zpravidla na vrstvách pro TLC. Kyselina askorbová v tabletách byla stanovena na základě její reakce s železitými ionty a následné reakce vzniklých železnatých iontů s 2,2´-dipyridylem jako chromogenním činidlem (skenování a korelování na absorbanci přepočtených hodnot souřadnic G nebo B s koncentrací analytu) s relativní směrodatnou odchylkou 1,5 %. Autoři uvádí lineární rozsah 0,02–0,2 mg . ml^-1 a limit detekce 1 μg . ml^{-1 67)}. Obsah železnatých iontů v tabletách obsahujících glukonan nebo fumaran železnatý a další součásti byl stanoven s využitím jejich barevné reakce s 1,10-fenatrolinem (skenování, lineární závislost, korelační koeficient > 0,997), přičemž chyba stanovení byla zřetelně nižší než u souběžně použité konvenční spektrofotometrické metody⁶⁸⁾. Autoři⁶⁹⁾ ke stanovení železnatých iontů v různých léčivých přípravcích použili jejich barevnou reakci s 2,2´-dipyridylem (skenování, korelování přepočtených souřadnic B nebo G, lineární rozsah 2–50 μg . ml^-1, relativní směrodatná odchylka pro 30 μg . ml^-1 1,3 %, limit detekce 0,24 μg nebo 0,28 μg . ml^-1 Fe²⁺). Pro stanovení rtuti v tabletách byla použita reakce rtuťnatých iontů s kyanoželezitanem draselným a následně s brilantní zelení (skenování, nejlépe přepočtená souřadnice B, lineární rozsah 0,18–18 μg . ml^-1, limit detekce 6 ng . ml^-1, relativní směrodatná odchylka v průměru 3,8 %)⁷⁰⁾. Hydrazin v tabletách obsahujících isoniazid byl stanoven s využitím jeho barevné reakce s vanilinem (skenování, korelování přepočtených souřadnic B nebo G, lineární rozsah 1,9–6,7 μg . ml^-1, limit detekce 0,38 μg nebo 1,6 μg . ml^-1)⁷¹⁾ . Arsen jako znečištěnina v tabletách byl stanoven na základě reakce s kyselinou sulfanilovou, která následně reaguje s naftylethylendiamin-dihydrochloridem za vzniku barevného produktu (skener, přepočtená souřadnice G nebo B, lineární rozsah 1–10 μg . ml^-1 a 25–100 μg . ml^-1, limit detekce 0,18 μg . ml^-1, relativní směrodatná odchylka pro 100 μg a 10 μg As . ml^-1 5,5 % a 10 %)⁷²⁾. Studie¹⁹⁾ se zabývá stanovením dusitanů, které jsou potenciální znečištěninou nebo rozkladným produktem některých léčiv, s využitím barevné reakce diazotované polyurethanové pěny s 3-hydroxy-7,8-benzo-1,2,3,4-tetrahydrochinolinem. Analytický signál byl získán digitální fotografií anebo skenováním a dalším elektronickým zpracováním obrazu. Z parametrů různých kolorimetrických prostorů se ke sledování závislosti signálu na koncentraci analytu osvědčily nejlépe vybrané souřadnice prostorů RGB a CMYK, závislosti byly nelineární s limitem detekce 1–2 ng dusitanu . ml^-1. Při použití parametrů jiných barevných prostorů byl limit detekce vyšší. Pro stanovení močoviny byl publikován postup založený na její barevné reakci s chloranilem (skener, RGB, lineární rozsah 0,05–10 μg . ml^-1, limit detekce 0,01 μg . ml^-1)⁷³⁾. Metoda byla ověřována na biologickém materiálu, lze proto očekávat její použitelnost i pro analýzu dermatologických přípravků.

Autoři^{74, 75)} ukázali, že s koncentrací analytu lze v barevném prostoru RGB korelovat nejen jednotlivé souřadnice, ale i velikost vektoru ν počítanou jako

kde

jsou průměrné hodnoty rozdílu mezi vzorkem nebo standardem a blankem. Tento přístup použili v plamenové fotometrii, přičemž detektorem byla webová kamera. Stanovili uhličitan lithný v tabletách a chlorid sodný v 0,9% roztoku s vyšší citlivostí a lepší přesností než při použití tradiční plamenové fotometrie⁷⁴⁾, v další práci pak kalcium-glukonát, sodnou sůl diklofenaku a sodnou sůl metamizolu v injekcích⁷⁵⁾.

Střet zájmů: žádný.

Došlo 4. února 2013 / Přijato 13. února 2013

prof. RNDr. Jan Šubert, CSc.

Dušínova 1512, 664 34 Kuřim

e-mail: jan.subert@gmail.com

J. Čižmárik

Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta,

Katedra farmaceutickej chémie, Slovenská republika