Laboratorní ukazatele neurodegenerace v likvoru a míra motorického postižení u Parkinsonovy nemoci: korelační studie

Súhrn

Parkinsonova nemoc (PN) je chronické progredientní neurodegenerativní onemocnění. U pacientů s tímto onemocněním dochází procesem neurodegenerace k morfologickým a neurochemickým změnám centrálního nervového systému, které jsou vyjádřeny postupnou progresí nemoci. Tzv. Braakův koncept dělí toto postižení do 6 stupňů a ty uvádí do korelace s klinickým stavem, hodnoceným pomocí Hoehnovy-Yahrovy stupnice. Zároveň je známo, že neurodegenerativním procesem dochází k elevaci určitých laboratorních ukazatelů v likvoru. Cílem předkládané studie bylo stanovení koncentrací neurodegenerativních ukazatelů v likvoru u pacientů s PN a u kontrolní skupiny jedinců, a dále zjistit, zda v podskupině pacientů s PN existují korelace mezi těmito hladinami a délkou trvání onemocnění či mírou motorického postižení vyjádřeného Hoehnovou-Yahrovou stupnicí. Do studie bylo zařazeno 32 pacientů s PN a 20 jedinců bez příznaků neurodegenerativního onemocnění jako kontrolní skupina. U všech jedinců byly stanoveny hladiny tau-proteinu, beta-amyloidu_(1-42) a cystatinu C v likvoru a dále vypočítán index tau-protein/beta-amyloid_(1-42). U pacientů s PN byly zjištěny signifikantně vyšší hladiny tau-proteinu v likvoru oproti kontrolní skupině (p = 0,05). Dále byly u pacientů s PN do 2 let trvání nemoci zjištěny signifikantně vyšší hladiny tau-proteinu v likvoru (p = 0,03) a vyšší hodnoty indexu tauproteinbeta-amyloid_(1-42) (p = 0,01) oproti pacientům s délkou trvání nemoci nad 2 roky. Nebyla prokázána korelace hladin tau-proteinu v likvoru s tíží motorického postižení vyjádřeného Hoehnovou-Yahrovou stupnicí. Ostatní sledované hodnoty nevykázaly žádnou korelaci s diagnózou, délkou trvání onemocnění či tíží motorického postižení. Výsledky provedené studie svědčí o přínosné roli stanovení tau-proteinu v likvoru jako laboratorního ukazatele přítomnosti neurodegenerace u pacientů s PN, a to zvlástě u pacientů s délkou trvání onemocnění do 2 let od prvního prvního projevu klinickýh příznaků.

Klíčová slova:
Parkinsonova nemoc – tau-protein – beta-amyloid – cystatin C – likvor

Úvod

Parkinsonova nemoc (PN) je chronické neurodegenerativní onemocnění, u kterého je  hlavní poruchoue deficit dopaminu v oblasti bazálních ganglií. Deficit je způsoben sníženým transportem dopaminu do oblasti striata cestou nigrostriatálních projekcí a jeho prvotní příčinou je apoptotický zánik melaninových buněk v oblasti substantia nigra v mezencefalu [1].

Podstatou patofyziologie PN je funkční defekt bílkoviny zvané alfa-synuklein, čímž se PN řadí mezi synukleinopatie. V postižených neuronech u PN nacházíme Lewyho tělíska, což jsou intraneuronální inkluze v cytoplazmě blízko jádra. Lewyho tělíska jsou složena z různých poteinů, pro diagnostiku je nejdůležitější přítomnost ubikvitinu, proteinu p62 a alfa-synukleinu. Výsledky nedávno zveřejněných studií svědčí o tom, že součástí Lewyho tělísek je i degenerovaný tau-protein, který navíc potencuje degeneraci alfa-synukleinu a tímto se podílí na patogenezi PN [2–5].

Kromě výše popsané poruchy jsou ale u PN popisovány další morfologické a neurochemické změny, které jsou spojeny s postupnou progresí nemoci. Nedávno publikovaný tzv. Braakův koncept [6,7] uvádí 6 stupňů prokázaného morfologického postižení centrální nervové soustavy v průběhu progrese PN, přičemž těchto 6 stupňů koreluje s klinickým stavem, který je možno vyjádřit hodnotami Hoehnovy-Yahrovy stupnice. Podle této koncepce jsou v průběhu PN postihovány v podstatě všechny struktury centrální nervové soustavy (CNS).

Morfologické změny tkání CNS podle Braakova konceptu jsou působeny relativně pomalu progredujícím neurodegenerativním procesem. Zároveň tento koncept počítá s tím, že míra neurodegenerativního procesu koreluje s tíží motorického postižení [8].

Je známo, že neurodegenerace souvisí s přítomností určitých laboratorních ukazatelů v likvoru. Lze předpokládat, že míra motorického postižení u PN hodnocená pomocí Hoehnovy-Yahrovy stupnice, by mohla souviset s určitou koncentrací neurodegenerativních ukazatelů (tau-protein, beta-amyloid_(1-42), cystatin C) v likvoru.

Cílem předkládané studie bylo stanovení koncentrací neurodegenerativních ukazatelů v likvoru u pacientů s PN a u kontrolní skupiny jedinců a dále zjistit, zda v podskupině pacientů s PN existují korelace mezi těmito hladinami a délkou trvání onemocnění či mírou motorického postižení vyjádřeného Hoehnovou-Yahrovou stupnicí.

Tau-protein

Tau-protein se za normálních podmínek podílí na integritě buněčného cytoskeletu. Pokud dojde k jeho nadměrné fosforylaci, jak k tomu dochází u řady neurodegenerativních onemocnění včetně PN, pak dochází k poruše integrity buňky, ztrátě její fyziologické funkce, až k buněčné smrti. Očekávané hodnoty tau-proteinu v likvoru u zdravých jedinců jsou kolem 160 ng/l (ng/l = nanogram/litr).

Beta-amyloid

Beta-amyloid je tvořen z amyloidového prekurzorového proteinu (APP). APP je štěpen buď alfa-sekretázou a produktem je sAPPa, u něhož se předpokládá, že má neuroprotektivní význam, a nebo beta-amyloid štěpícím enzymem (BACE), čili beta-sekretázou a v následném kroku chí-sekretázou a produktem štěpení je beta-amyloid40 a beta-amyloid42. Ty tvoří po agregaci jádro neuritických plak. Následuje kaskáda dalších procesů, např. oxidativní stres, cytotoxické jevy a zánětlivá odpověď a výsledkem je zánik neuronu a rozvoj demence. Snížená hladina beta-amyloidu v likvoru je nalézána u pacientů s Alzheimerovou demencí [9,10] či u pacientů s PN s demencí [9]. Očekávané hodnoty beta-amyloidu v likvoru u zdravých jedinců jsou kolem 850 pg/ml a pro hodnocení degenerace se využívá spíše než prosté stanovení s výhodnou index tau-protein/beta-amyloid [11].

Cystatin C

Cystatin C je inhibitor cysteinových proteáz, které hrají důležitou roli např. v procesu trávení potravy, aktivaci komplementu či krevní koagulaci. Cystatin C se účastní procesu neuronální degenerace a reparace centrálního nervového systému tak, že v mozku pravděpodobně inhibuje aktivitu katepsinu L v astrocytech, který spolu s katepsinem S patří ke klíčovým komponentám regulace imunitního potenciálu astrocytů a mikroglie. Dále je cystatin C podle současných znalostí považován za amyloidogenní protein, který se vyskytuje společně s beta-amyloidem ve stěnách arteriol u pacientů s Alzheimerovou demencí. Díky zvýšení koncentrace cystatinu C v určitých tkáních či systémovém oběhu dochází např. k precipitaci amyloidu v cerebrálních cévách, cerebrálním hemoragiím a akcelerované ateroskleróze [12,13].

Pacienti a metodika

Skupina vyšetřovaných

Studie byla schválena ústavní etickou komisí a všichni pacienti podepsali informovaný souhlas.

V rámci studie bylo vyšetřeno 32 pacientů trpících PN bez příznaků demence, 9 žen, 23 mužů, ve věku 29–77 let, průměrný věk 59,9 ± 11,96 let, průměrný věk na začátku onemocnění byl 55,2 ± 12,77 let, průměrná doba trvání nemoci 4,4 ± 3,6 let. 12 pacientů bylo léčeno L-dopou, průměrná dávka byla 492,3 ± 137,2 mg denně, průměrná doba trvání terapie L-dopou byla 3,92 ± 3,4 let.

Jako kontrolní skupina bylo vyšetřeno 20 pacientů, 9 žen, 11 mužů, ve věku 32–73 let, průměrný věk 51,2 ± 10,74 let. Kontrolní skupinu tvořilo 6 pacientů s vertebrogenním onemocněním, 6 pacientů s psychogenními poruchami, 3 pacienti po cévní mozkové příhodě, 2 pacienti s tenzní cefaleou, 2 pacienti s diabetickou neuropatií a 1 pacient po boreliové infekci. Diagnóza PN byla stanovena podle kritérií United Kingdom Parkinson’s Disease Society Brain Bank [14]. Kognitivní deficit byl vyloučen psychologickým vyšetřením, jehož součástí byl Minimental Status Examination (MMSE). U všech pacientů byly vyšetřeny hladiny tau-proteinu, beta-amyloidu_(1-42) a cystatinu C v likvoru.

Laboratorní vyšetření a technika náběru krve

Likvor byl získáván cestou lumbální punkce, která byla prováděna za obvyklých sterilních kautel při poloze vyšetřovaného vsedě, vpich byl směřován do meziobratlového prostoru L4/5. Při punkci bylo odebíráno celkem 10 ml likvoru do sterilní zkumavky. Po odběru byl likvor vyšetřen morfologicky a centrifugován (10 min při 1 100 g při 4° C). Z části vzorku byly stanoveny hladiny cystatin C, druhá část byla zamražena při -80° C a do 10 týdnů od zamražení byla v sérii u všech osob změřena koncentrace celkového tau-proteinu (ELISA, Biosource, Velká Británie), beta-amyloidu_(1-42) (ELISA, Innogenetics, Belgie) a cystatinu C (ELISA, Biovendor, Česká republika). Analytické charakteristiky všech ELISA metod při verifikaci údajů výrobce byly uspokojivé (opakovatelnost i reprodukovatelnost < 9 %). Současně byl u všech pacientů proveden výpočet indexu tauprotein/beta-amyloid_(1-42) v likvoru [11].

Rozdělení souboru na podskupiny

Pro hodnocení sledovaných parametrů byly výsledky porovnány mezi skupinou pacientů s PN a kontrolní skupinou. V podskupině pacientů s PN byly dále výsledky sledovaných ukazatelů porovnávány s mírou motorického postižení, vyjádřeného hodnotami Hoehnovy-Yahrovy stupnice. Ke zjištění korelace sledovaných ukazatelů s délkou trvání onemocnění byla podskupina pacientů s PN rozdělena na pacienty s délkou trvání nemoci do 2 let (včetně) a nad 2 roky, hodnoty pak byly porovnány mezi oběma skupinami.

Statistické zpracování dat

Data byla zpracována pomocí software Medcalc (Belgie). Ke zjištění rozdílů mezi skupinou pacientů s PN a kontrolní skupinou a dále v podskupinách pacientů s PN byly použity pro kategoriální znaky χ² test, pro metrické parametry Studentův t-test, resp. Mannův-Whitneyův test. K posouzení závislosti hodnot měrných parametrů a Hoehnovy-Yahrovy stupnice byla použita neparametrická Spearmanova korelační analýza. Hodnota p < 0,05 byla považována za statisticky signifikantní. Neparametrické testy pro analýzu dat byly použity z důvodu nenormální distribuce parametrů (pro testy normality byl použit test Shapiro-Wilk), resp. z důvodů přítomnosti extrémních hodnot v datech.

Výsledky

Při porovnání demografických dat obou skupin bylo zjištěno, že skupiny mají stejné zastoupení obou pohlaví, avšak skupina jedinců s PN je oproti kontrolní skupině signifikantně starší (p = 0,01) (tab. 1).

Bylo zjištěno, že jedinci s PN měli významně vyšší koncentrace tau-proteinu v likvoru oproti kontrolní skupině (mediány 225 vs 197 ng/l; p = 0,05). Ostatní sledované hodnoty se v obou skupinách významně nelišily (tab. 2, graf 1).

U jedinců s PN s délkou trvání nemoci do 2 let byly nalezeny významně vyšší koncentrace tau-proteinu v likvoru (mediány 263 vs 202 ng/l; p = 0,03) a vyšší hodnota indexu tau-protein/beta-amyloid_(1-42) (mediány 0,44 vs 0,23; p = 0,04) oproti pacientům s délkou trvání nemoci nad 2 roky (tab. 3, graf 2). Ostatní sledované hodnoty se podle doby trvání nemoci významně nelišily.

U hladin tau-proteinu byla zjištěna korelace s tíží motorického postižení vyjádřeného Hoehnovou-Yahrovou stupnicí, tato korelace však nedosahovala hladiny statistické významnosti (p = 0,07). U ostatních sledovaných parametrů nebyla zjištěna souvislost s tíží motorického postižení vyjádřeného Hoehnovou-Yahrovou škálou (tab. 4).

Diskuse

V rámci předkládané práce jsme prokázali významně vyšší hladinu tau-proteinu v likvoru u pacientů s PN oproti kontrolní skupině, což koreluje s výsledky provedených studií o jeho spolupodílu na vzniku onemocnění, nekoreluje však s dříve provedenou studií u jedinců s PN bez příznaků demence [15]. Tento výsledek však může být ovlivněn právě tím, že skupina jedinců s PN je signifikantně starší [16].

Současně jsme prokázali signifikantně vyšší hladinu tau-proteinu v likvoru u pacientů s PN do 2 let od manifestace prvních symptomů nemoci. Tento fakt nás vedl k hypotéze, že k neurodegeneraci pravděpodobně dochází v největší míře (resp. že neurodegenerativní proces je nejvíce intenzivní) v počátečním stadiu, tj. tehdy, když tíže patologických změn v mozku „prolomí“ hranici klinické manifestace. Dříve provedené studie prokázaly vyšší hladinu tau-proteinu u jedinců s PN s demencí oproti jedincům s PN bez příznaků demence [17]. Proto by bylo vhodné u zařazených jedinců s PN následně klinicky sledovat jejich kognitivní deficit a zvýšení hladiny tau-proteinu v likvoru jako potenciální ukazatel pozdějšího rozvoje demence [18].

Limitací studie však zůstává, že u jedinců zařazených do kontrolní skupiny mohl taktéž probíhat blíže neurčený neurodegenerativní proces, který u nich v době odběru likvoru nebyl klinicky vyjádřen.

Závěr

Závěrem lze shrnout, že stanovení tau-proteinu v likvoru lze považovat za přínosný laboratorní ukazatel přítomnosti neurodegenerace u pacientů s PN. Za cennou považujeme skutečnost, že jsme prokázali jeho zvýšení především u osob, u kterých trvá nemoc 2 roky a méně od prvního projevu klinických příznaků. Stanovení beta-amyloidu_(1-42) ani cystatinu C se u našeho souboru pacientů s PN neosvědčilo. Stejně tak se nám nepodařilo prokázat ani významnou souvislost mezi uvedenými ukazateli a stupněm motorického poškození.

V současnosti asi nedokážeme jednoznačně říci, zda Braakův staging progrese Parkinsonovy nemoci do detailu odpovídá skutečnosti, a to jednoduše proto, že počáteční stupně stagingu (tj. I–III) budou moci být jen velmi obtížně klinicko-patologicky korelovány u více případů, pokud vůbec. Výsledky naší studie zatím nesvědčí ve prospěch hypotézy, že hladina neurodegenerativních markerů v likvoru pacientů s PN koreluje s tíží jejich motorického postižení, hodnoceného pomocí Hoehnovy-Yahrovy stupnice.

MUDr. Hana Vranová

Neurologická klinika

Fakultní nemocnice Olomouc

I.P. Pavlova 6

775 20 Olomouc

e-mail: vranovaha@seznam.cz

Přijato k recenzi: 20. 4. 2007

Přijato do tisku: 8. 4. 2008