Stručná analýza četnosti použití a spektra animálních modelů ve výzkumu cévních mozkových příhod

Súhrn

Cíl: Vývoj nových léčiv a léčebných postupů se v současnosti bez zvířecích modelů neobejde. Vzhledem k unikátní komplexnosti CMP je počet modelů ji studujících neobvykle široký. Cílem přehledu je popsat a jednoduše analyzovat spektrum používaných experimentálních modelů a běžně používaných živočišných druhů ve výzkumu CMP.

Metody: Publikace byly vyhledány v listopadu 2017 v databázích: PubMed, Science Direct, Wiley Online Library a Springer Link pomocí kombinace klíčových slov. U každého modelu CMP byl evidován typ modelu, druh zvířete, jeho pohlaví a věk a byla vyhodnocena četnost výskytu v sledovaných publikačních databázích. Vyloučeny byly nerelevantní publikace a duplicity.

Výsledky: Z 26 198 článků bylo dohledáno 3 093 relevantních odkazů, které odpovídaly zadání metodologie. Výsledky byly zpracovány v přehledové tabulce.

Závěr: Práce mapuje četnost použití animálních modelů a používaných živočišných druhů v problematice výzkumu CMP.

Klíčová slova:

animální model cévní mozkové příhody – potkan – myš – králík – ovce – prase – pískomil – kočka – pes – non-humánní primáti

Úvod

Velká řada farmakologických a nefarmakologických postupů vyvíjených k léčbě a diagnostice pacientů s CMP je nejdříve testována na zvířecích (animálních) modelech [1–3]. Animální modely jsou vrcholem preklinických studií u vývoje nových farmak nebo vývoje a testování nových zařízení či prostředků (stenty, šicí materiály, katetry apod.). Způsob provádění animálních modelů se v čase mění, protože některé animální modely se ukázaly málo relevantní nebo nadějné výsledky z animálních experimentů nebyly potvrzeny výsledky v humánních klinických studiích [4–6].

Zvířecí modely jsou používány ze dvou základních příčin: 1. preklinické testování léčivých látek, diagnostických a terapeutických postupů; 2. ověření hypotézy, která vznikla pozorováním v klinické praxi nebo byla formulována na základě výsledků základního výzkumu či čiré mentální indukce.

Zvířecí modely jsou speciálním typem experimentálních modelů. Model imituje reálnou situaci (nemoc, patofyziologický pochod apod.) v zjednodušeném uspořádání (jehož cílem je obvykle minimalizovat variabilitu na vstupu) s cílem sledovat nebo modifikovat reakci živého systému v modelovaném procesu. Výhodou zvířecích modelů je možnost hodnotit změny v klinické praxi nedostupnými metodami – histologie lézí, histologická kvantifikace velikosti ischemického ložiska pomocí tetrazolium chlorid, použití „bioimagingu“ (in vivo bioluminiscence, mikroCT, laser-optické metody apod.) nebo při vizualizaci použití např. kontrastních látek nevhodných pro klinické zobrazení na CT nebo MR, ale pro experiment akceptovatelných (specificky vázané nanočástice zlata nebo jiných kovů).

Vývoj nového léčiva je spojen s ustáleným postupem v dnešní době charakterizovaným 4 etapami – in silico, in vitro, in vivo, in homo [7]. Tento postup racionalizuje finančně náročný vývoj nového léku a umožní získat informace o potenciálním léčivu vyžadované příslušnou národní autoritou (u nás Státní ústav kontroly léčiv) při registraci léčivého přípravku. Etapa in silico je stadiem základního výzkumu – od rešeršní práce po syntézu nové potenciální molekuly a popsání její fyzikálně-chemické charakteristiky a stability. In vitro etapa je první částí preklinického výzkumu – účinná látka se testuje z hlediska toxicity a farmakologických vlastností na buněčných kulturách, izolovaných tkáních či orgánech [7]. In vivo etapa slouží k posouzení komplexní reakce organizmu na podanou látku. Používají se jak intaktní zvířata na základní farmakokinetické, farmakodynamické a toxikologické studie, tak i zvířecí modely pro posouzení terapeutického efektu. Na in vivo modelech se studují a ověřují základní farmakokinetické vlastnosti, vyvíjejí se analytické metody na stanovení dané látky z plazmy/moči sloužící jako podklad pro nastavení metodiky detekce u lidí [7]. Provádí se studie subchronické a chronické toxicity, speciální toxikologie se zaměřením na mutagenitu, teratogenitu, kancerogenitu. Stanovují se vhodné dávky a sleduje se vztah mezi dávkou a výskytem nežádoucích účinků [7]. Vždy je potřeba provést výše zmíněné testy minimálně na dvou zvířecích druzích, kdy jeden z nich musí být hlodavec a druhý hlodavec není [7]. Nepříznivé výsledky z in vivo části testováni obvykle zablokují přechod do poslední in homo etapy, tj. stadia klinického výzkumu. Musíme si ale uvědomit, že ani pozitivní výsledky v in vivo testech nejsou zárukou dobrých výsledků v in homo stadiu. Např. testovaná látka α-fenyl-N-tert-butyl nitrone, která vykazovala slibné neuroprotektivní účinky v modelech mozkového infarktu u hlodavců, měla stejný pozitivní efekt i u kosmana bělovousého [8]. Nakonec se ale v realitě klinické studie neprokázal předpovídaný neuroprotektivní účinek [9]. Výše uvedený postup (test na hlodavci a jiném „non-rodent“ savci) sice plně odpovídal později postulovaným doporučením Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR), ale jak je vidět, absolutní jistota při translaci výsledků neexistuje [5,9].

Správně vybraný a provedený zvířecí model je stěžejní pro následnou translaci poznatků do klinické praxe. Animální model nikdy nenahradí klinickou studii a ani nemá tyto ambice. Je ale nutnou součástí vývoje a testování nových léčiv či terapeutických a diagnostických postupů. Animálních modelů je velké množství a alespoň povrchní znalost je vhodná i pro klinicky zaměřené lékaře, protože jim umožní např. lépe interpretovat výsledky animálních experimentů. Proto je cílem práce popsat a jednoduše analyzovat spektrum používaných experimentálních modelů a běžně používaných živočišných druhů ve výzkumu CMP.

Materiál a metody

Práce je koncipována jako orientační přehled výčtu animálních modelů ve výzkumu CMP. Relevantní publikace byly vyhledány v listopadu 2017 v databázi PubMed [10], zadáním klíčových slov „stroke model“ a „animal“, kde slovo „animal“ bylo dále nahrazeno slovem „rat“, „mouse“, „gerbil“, „rabbit“, „pig“, „dog“, „cat“, „sheep“ nebo „non-human primates“. Všechny články evidované v databázi PubMed publikované do listopadu 2017 byly považovány za relevantní. Pokud zjišťované informace (typ modelu CMP, pohlaví a věk zvířete) nebyly obsaženy v abstraktu článku, byly dohledány v databázích Science Direct [11], Wiley Online Library [12] a Springer Link [13], na kterých byl zveřejněn celý obsah článku. Vyloučeny byly články, které byly: 1. duplicitní; 2. obsah nekorespondoval s tématem (např. tématem byl „stroke volume“, nebo článek obsahoval klíčová slova: stroke – animal – model, ale ne v požadovaném kontextu, např. článek: „Ultrastructure of the grasshopper proximal femoral chordotonal organ“); 3. neobsahovaly abstrakt a originální text byl v neevropském jazyce (např. japonsky).

Nalezené informace byly zpracovány do tabulky, kde u každého typu modelu CMP a druhu zvířete, na kterém se pokus prováděl, byly zapsány počty odpovídajících článků. Dále bylo zaznamenáno pohlaví zvířete a jeho věk. (Tabulka je dostupná online).

Tab. 1. Typ gyrifikace mozku u jednotlivých druhů non-humánních primátů.

Český název	Latinský název	Anglický název	Typ struktury mozku
kosman bělovousý	Callithrix jacchus	Common marmoset	lisencefalický
kotul veverovitý	Saimiri sciureus	Squirrel monkey	lisencefalický
mirikina lemuří	Aotus lemurinus	Owl monkey	lisencefalický
komba ušatá	Galago senegalensis	Senegal bush baby	lisencefalický
pavián anubi	Papio anubis	Baboon	gyrencefalický
makak Rhesus	Macaca mulatta	Rhesus macaque	gyrencefalický
makak jávský	Macaca fascicularis	Cynomolgus macaque	gyrencefalický
makak červenolící (japonský)	Macaca fuscata	Japanese monkey	gyrencefalický
kočkodan obecný	Cercopithecus aethiops	African green monkey	gyrencefalický
kočkodan červenobřichý	Chlorocebus pygerythrus syn. Cercopithecus pygerythrus	Vervet monkey	gyrencefalický

Tab. 2. Četnost zastoupení modelů a použitých zvířecích druhů. ZDE

Vysvětlivky: A – dospělý jedinec; BCCAO – bilaterální okluze společné krkavice; F – samice; G – starý jedinec; M – samec; MCAO – okluze střední mozkové tepny; N – novorozenec; P – celkový počet relevantních článků; SAH – subarachnoidální krvácení; UCCAO – unilaterální okluze společné krkavice; Y – mladý jedinec

Výsledky

Počet odkazů na výše uvedená klíčová slova „stroke model“ a „animal“ celkem byl 26 198. Celkem 23105 článků bylo vyloučeno z důvodů uvedených v materiálu a metodice, takže 3 093 odkazů zůstalo relevantních. Popis modelů členěných podle druhu použitého zvířete a modelu uvádíme níže.

Druhy zvířat

Obecná poznámka ke všem komentovaným savcům – uvádíme obvyklé hmotnosti dospělých samců; samci jsou o cca 15–35 % hmotnější než samice; objem krve tvoří 7–10 % tělesné hmotnosti s negativní úměrou k věku (vyšší věk – nižší procento); bezpečný odebraný jednorázový odběr nemá překročit 5 % objemu krve jedince a u sériových odběrů v průběhu 24 hod jejich součet 7–10 % s 1,5násobnou náhradou odebraného objemu (intraperitoneálně) krystaloidními roztoky.

U všech savců (stejně jako u člověka) platí, že mladé věkové kategorie mají lymfofilní leukogram a s narůstajícím věkem se poměr mezi lymfocyty a neutrofily posouvá ve prospěch neutrofilů.

Životaschopnost a hmotnost inbredních kmenů je obvykle o 30–50 % nižší než u outbredních kmenů.

Celkově nejčastěji používanými zvířaty v analyzovaném přehledu jsou laboratorní potkani.

Potkan obecný

Klíčová slova: rat; Rattus norvegicus

Hmotnost: 450–800 g dle kmene a linie

Nalezeno bylo celkem 6 634 článků a z toho 1 674 článků odpovídajících tématu. Potkani jsou zastoupeni téměř u všech modelů CMP. Používají se obě pohlaví, ale samci výrazně převažují. Stejně tak jsou častěji používáni dospělí potkani.

Výhodami a důvody širokého využívání potkanů jsou nízká cena, cerebrovaskulární anatomie a fyziologie podobná lidské, větvení mozkových cév včetně hypotalamických podobné lidským včetně výskytu hypertermie u mrtvice s postižením hypotalamu (ve srovnání s myšmi). Potkani mají malý objem mozku, který je ale dostatečný k různým analytickým procedurám, tj. je v experimentu již hodnocen jako individuum. Jeho velikost umožňuje opakované odběry krve k analýzám a provádění složitějších chirurgických zákroků. Možnosti genetické modifikace jej naopak favorizují vůči větším druhům experimentálních zvířat. U potkana je již standardizované hodnocení neurodefektů a behaviorálních studií. Eticky jsou širokou i odbornou veřejností akceptovány pokusy na hlodavcích lépe než na větších savcích. Dobře definované inbrední/outbrední kmeny umožňují lepší standardizaci vstupních podmínek experimentu a tím pádem i získaných dat (je to ale současně i jistý limit – nemusí platit pro celou populaci, natož translace dat na člověka). Větvení karotid je podobné jako u člověka s jedinou výjimkou společné karotidy, která se sice dělí na zevní a vnitřní karotidu, ale z vnitřní karotidy odstupuje arteria pterygopalatina. Toto vyžaduje u obturačních a trombembolických modelů pterygopalatinu podvázat nebo dočasně zneprůchodnit.

Myš domácí

Klíčová slova: mouse; Mus musculus

Hmotnost: 20–40 g podle kmene

Nalezeno bylo 3 061 článků a z toho 932 článků odpovídajících tématu. Myši se převážně používají u modelů přechodné nebo trvalé okluze střední mozkové tepny. Na rozdíl od potkanů jsou v ostatních modelech jak věkem, tak počtem zastoupeny rovnoměrněji. Používají se samci i samice, ale samci opět převažují. Četnost použití myších modelů v posledním desetiletí strmě narůstá.

Výhodou využití myších modelů je nejlepší cenová dostupnost (nízká hmotnost = nízká nákupní cena, nízká spotřeba aplikovaných léčiv apod.), široké spektrum geneticky modifikovaných kmenů, možnost „výroby“ – delece genu na zakázku. Naopak limitující je velikost zvířete – malé objemy vzorků tkání pro analýzy znamená nutnost použití směsných vzorků (vzorků z více zvířat prováděných v sérii), náročnost provedení intravazálních úkonů a nutnost zakoupení a použití speciálního chirurgického a injekčního instrumentária.

Králík domácí

Klíčová slova: rabbit; Oryctolagus cuniculus f. domesticus

Hmotnost: 3–5 kg, miniaturní plemena 2 kg

Nalezeno 561 článků a z toho 143 článků odpovídajících tématu. Králíci se používají u modelů ischemie či hemoragie mozku vytvořené aplikací autologní krve či krve získané od dárce. Často se zde používá i model přechodné okluze střední mozkové tepny. Králíci jsou převážně mladí samci.

Králíci mají podobný hemokoagulační systém jako člověk, velice podobné tepenné zásobení mozku jako potkan a člověk s výjimkou větvení společné krkavice (celkem 6 typů větvení) [14]. U větších plemen s hmotností 3–5 kg (novozélandský bílý, činčila, masní brojleři apod.) jsou králíci dobře katetrizovatelní pediatrickým instrumentáriem nebo instrumentáriem pro katetrizaci radiální tepny (4–5 F). U králíka lze lehce odebírat krev v uspokojivých objemech. Dobře se s nimi pracuje a příznivá je i cena zvířat.

Pískomil mongolský

Klíčová slova: gerbil; Meriones unguiculatus

Hmotnost: 60 g

Nalezeno bylo celkem 189 článků a z toho 106 článků odpovídajících tématu. Pískomil je specifickým živočišným druhem s neobvyklým tepenným zásobením mozku. Přední mozek je krven jenom z větví karotid, Willisův okruh postrádá zadní komunikační tepnu [15]. Díky této specifitě je možné provést rychlou a jednoduchou ischemii jedné nebo obou hemisfér. U unilaterálních postižení je ale nutné počítat s výraznou variabilitou kalibru přední komunikační tepny, a tudíž s velkou variabilitou výsledného defektu. U pískomila převažují modely oboustranné či jednostranné okluze, ligace a stenózy karotidy. Je tedy excelentním modelovým zvířetem ke studiu vztahu mezi průtokem krve a funkčními a biochemickými změnami [16]. Výhodou je nízká pořizovací cena a lehká bezproblémová manipulace se zvířetem.

Pes domácí

Klíčová slova: dog, Canine; Canis familiaris

Hmotnost: Beagle, Horákův laboratorní pes 15–20 kg

Vyhledávání detekovalo celkem 706 článků a z toho relevantních 46 článků. Převážně dospělí psi se používají u modelů okluze střední mozkové tepny a okluze karotid. Méně u modelů využívajících aplikaci autologní sraženiny či krve a u intracerebrálního krvácení navozeného autologní krví. Počet samců a samic je téměř vyrovnaný.

Pes jako laboratorní zvíře je používán převážně v neevropských destinacích. V Evropě byl poměrně často používán do 80. let minulého století. Cévní anatomie hlavy je podobná člověku, ale některé odchylky jsou zásadní – vnitřní karotida je oproti člověku více zkroucená a její kalibr je menší než vnější karotidy. U ischemických modelů je důležitá významná maxilo-karotická anastomóza, která redukuje objem vyvolaného infarktu [17]. Pes je proto v současnosti volen jako alternativa k praseti či non-humánním primátům u vývoje a zkoušení katetrizačních technik léčby. Jinak u psa nelze najít přidanou hodnotu oproti králíkovi či potkanovi, a tedy obhájit jeho použití v experimentu.

Kočka domácí

Klíčová slova: cat, Feline; Felis catus

Hmotnost – 4–6 kg

Nalezeno bylo 121 článků a z toho 29 článků obsahově odpovídalo tématu. Kočky se používají v modelech přechodné okluze střední mozkové tepny. Věk ani pohlaví v abstraktech nebylo uvedeno.

Kočka patří z pohledu experimentální praxe již do spektra “Large animal” modelů díky své délce života a tím vhodností k použití v dlouhodobých experimentech. Kočičí modely neurologických onemocnění jsou pestré – Parkinsonova nemoc, CMP, úraz hlavy, lysozomalní střádavé nemoci (gangliozidóza, mukopolysaccharidóza, alfa-mannozidóza, Krabbeho nemoc, a Neimanova-Pickova nemoc typu C [18].

Většina experimentálních prací o mrtvici u koček probíhala do konce prvního desetiletí 21. století. Kočka na rozdíl od psa má dvě karotické rete mirabile – vnější vznikající větvením čelistní tepny a vnitřní připomínající rete mirabile epidurale sudokopytníků, ale s větším diametrem cév (téměř stejným jako přívodní vnitřní karotida) tvořících arteriální síť. Tato zvláštnost nebrání provedení tromboembolie, ale velikost infarktu nelze uspokojivě standardizovat. Útlum výzkumu je ovlivněn zejména etickými aspekty použití koček v experimentu a podobně jako u psů lze konstatovat, že nelze najít přidanou hodnotu oproti králíkovi či potkanovi, a tedy obhájit jeho použití u experimentální mrtvici na rozdíl od zkoumaných degenerativních a střádavých onemocnění CNS, kde kočka stále zůstává používaným živočišným druhem. Zcela jiný, než náš pohled na použití kočky u experimentálních CMP je názor Caia a Wanga [19], kteří pro pilotní studie doporučují používat hlodavce, ale následně z „Large animal“ modelů používat buď kočky (díky gyrencefalickému mozku) nebo non-humánnní primáty.

Prase domácí

Klíčová slova: pig; Sus scrofa domestica

Hmotnost: miniprasata 25–35 kg, standardní plemena prasat 130–220 kg

Vyhledávání nabídlo celkem 777 článků a z toho 50 článků odpovídalo tématu. Prasata se používají u modelů přechodné nebo trvalé okluze střední mozkové tepny, okluze, ligace či stenózy karotid, intracerebrálního krvácení indukovaného autologní krví a zástavy srdce s kardiopulmonální resuscitací nebo bez ní jako model kompletní mozkové ischemie. Dále se u prasat modeluje mechanické poranění hlavy pomocí zařízení (obvykle pneumatických) umožňujících provést úder definovanou konstantní silou a intenzitou. Používají se jak samci, tak samice ve všech věkových kategoriích – dospělí i novorozenci.

Výhody prasete – anatomie (vyjma anatomie cévního řečiště hlavy) podobná člověku. Limity jsou složitější anestezie, nesnadná manipulace, malé množství povrchových cév pro kanylace, sklon k maligní hypertermii. Zásadním limitem (kromě prasete, je podobná situace i u přežvýkavců včetně ovce) je přítomnost tepenného rete mirabile epidurale (jsou na hlavě dvě rostrální = anteriorní a kaudální = posteriorní). Z pohledu člověka je krvení mozku prasete (i ovce) diametrálně odlišné. U většiny dospělých kusů je vnitřní karotida změněna ve vazivový pruh, popřípadě má zanedbatelný kalibr [20].

Dominantně je krvení mozku zaručeno větvemi z čelistní tepny. Tyto větve formuji dvě navzájem propojené rete mirabile epidurale rostrale et caudale (propojené s arteria condylaris a arteria vertebralis). Z nich je formovaná arteria carotis cerebralis, která ve svém větvení dále odpovídá intrakraniální lidské vnitřní karotidě, tj. podílí se na formování Willisova okruhu. Střední mozková tepna je u prasete zdvojená [20].

Uvedená situace neumožňuje provést prostou trombembolii jedním trombem a okluze kompresí střední mozkové tepny lze provádět jenom po kraniotomii [20,21].

Ovce domácí

Klíčová slova: sheep; Ovis aries

Hmotnost: miniaturní plemena 15–20 kg standardní nemasná plemena 35–45 kg, masná plemena 60–80 kg

U ovce bylo nalezeno 219 článků, z toho odpovídajících bylo 9 článků. Dospělé ovce obou pohlaví se používají k přechodné či trvalé okluzi střední mozkové tepny.

Stejně jako u prasete se i u ovce vyskytuje tepenné rete mirabile, ovce proto není vhodným zvířetem pro tromboembolické modely a okluze střední mozkové tepny se musí dělat po kraniektomii. Výhodou ovce ve srovnání s prasetem je dobrá manipulace se zvířetem a dobře dostupné cévní přístupy i pro nezkušeného operatéra, nízká cena jak zvířete, tak krmiva a široký výběr plemen ovcí s pestrou variabilitou jejích velikostí.

Non-humánní primáti

Klíčové slovo: nonhuman primate

Hmotnost: od 230 g (komba ušatá) do 37 kg (pavián anubis)

Zde bylo nalezeno celkem 13 930 článků a z toho jen 104 články odpovídající tématu. Tento nepoměr mezi nalezenými a odpovídajícími články je dán tím, že ve zbylých 13 826 článcích se studie zabývaly sledováním pacientů po CMP nebo se jednotlivá klíčová slova ocitnou v textu bez náležitého kontextu. U primátů jiných než lidských převažují modely přechodné či trvalé okluze střední mozkové tepny. Ze všech zmíněných druhů zvířat je zde nejvíce zastoupen model mozkové ischemie navozený mikroelektrodami či elektrokoagulací mozkových cév.

Nejvíce byli primáti používáni ve výzkumu cévních mozkových příhod v minulém století. Použití primátu v experimentech vzbuzuje zvláště v Evropě kontroverze a lze souhlasit s kritiky jejich použití pro studium mozkové mrtvice (při zvážení ceny, možného utrpení v kontrastu informaci navíc, co jsme schopni z modelu získat). Jejich využití je bez výrazných benefitů proti ostatním zvířecím modelům a u primátů vyzdvihovaná gyrifikace, zcela vyřazuje lisencefalické druhy (tab. 1). Ze všech použitých primátů (s výjimkou lidoopů/hominidů) se mozek makaka nejvíce podobá lidskému mozku jak anatomií se specifickou kortikální a subkortikální organizací, tak i s ohledem na nejdůležitější pro výzkum CMP – vaskulárním zásobováním a kolateralizací [22].

Typy modelů

Nejčastěji používanými modely jsou modely ischemické a z nich je nejpoužívanější model dočasné intraluminální okluze (s použitím speciálního obturačního vlákna) střední mozkové tepny (potkan 1 024, myš 484, non-humánní primáti 54), na druhém místě jsou tromboembolické modely okluze střední mozkové tepny (celkem 371 s převahou potkanů a králíků) a na třetím místě trvalá intraluminální okluze střední mozkové tepny (290, opět převaha potkanů). Za zmínku stojí ještě zejména u myší oblíbené fototrombotické (systémově je aplikována fotodynamicky aktivní látka a lokálně je osvícena vhodným světelným zdrojem tkáň za vzniku mikrovaskulárních trombů) modely (potkan 36, myš 76). Z neischemických in vivo modelů se často používají modely intrakraniálního krvácení (potkan 137, myš 72). Z in vitro modelů je nejčastěji používaným modelem model deprivace kyslíku a glukózy (Oxygen Glucose Deprivation; OGD) na organotypických kulturách se 139 publikacemi u potkanů a 74 u myší.

Modely mozkové ischemie

A. Mikrovaskulární okluze. Modely mikrovaskulární okluze provedou dočasnou nebo trvalou okluzi malých cév. V praxi se používají dva typy okluzních modelů – fototrombotická okluze nebo mikrovaskulární okluze/embolizace. Fototrombotická okluze využívá fotodynamického efektu některých barviv. Watson a kol. [23] popsali model s použitím bengálské červené. Následně ozářili mozkovou kůru argonovým laserem se vznikem mikrovaskulární (hemo)koagulace v cévách exponovaných laseru [23]. Typ poškození tkáně není totožný s CMP, a proto je vhodný jenom ke studiu regenerace mozkové tkáně. Mikrovaskulární okluze/embolizace může být provedena jako dočasná – tj. vhodná pro studium tranzitorní ischemické ataky – např. intrakarotická aplikace ADP (adenosin difosfát) [24] nebo arachidonátu [25]. Použití polyetylenu [26], dextranu [27] nebo skleněných embosfér [28] provede podle použitého materiálu obvykle trvalou embolizaci vybraného okrsku. Čím selektivněji jsou embosféry aplikovány, tím reprodukovatelnější výsledek získáme. Výhodou modelu je relativní jednoduchost a proveditelnost od myší po králíka nebo i velká zvířata (mikrosféry prochází přes tepenné rete mirabile). Zásadním limitem je to, že model není klinicky relevantní a dominantní poškození je spojeno s vznikem časného typu vazogenního otoku umocněného o cytotoxickou komponentu ischemického otoku mozku vedoucího k výraznému zvýšení objemu krve v hyperemických focích a následnému výraznému otoku v embolizované tkáni. Proto výsledný edém mozku (spíše než primární ischemické poškození) určuje konečný výsledek poškození [29].

B. Okluze vláknem (suture occlusion/stroke model seu filament occlusion/stroke model). Tento typ modelu patří k široce používaným modelům v experimentální praxi studia CMP. Lze jej provést u myši, potkana i větších zvířat (pomocí cévního okluderu). Podle požadavků klinické praxe je cílem okluze střední mozkové tepny. Poprvé jej popsal Koizumi a kol. v roce 1986 [30]. V principu lze podle provedení provést dočasnou či trvalou okluzi. Koizumi používal nylonové vlákno na konci ztluštělé akrylátem. Vlákno se zasouvá buď ze společné karotidy nebo vnější karotidy. V současnosti je preferován vstup z vnější karotidy díky zachovanému fyziologickému prográdnímu průtoku (při vstupu ze společné karotidy je tato podvázaná a průtok ve vnitřní karotidě zabezpečuje retrográdní perfuze z vnější karotidy). V případě trvalé okluze se jenom fixuje v pozici uzlem k vnější karotidě, u dočasné je pak vlákno po sledovaném čase vytaženo. Zasunuté vlákno kompromituje průtok v přilehlých oblastech (výrazně zhoršení perfuze, pokud je podvázaná společná karotida) a minimalizuje kolaterální oběh. Výsledkem je redukce penumbry na minimum [31]. Naopak u déle trvajících okluzí (nad 2 hod) vzniká rozsáhlý infarkt zasahující do hypotalamu a způsobující hypertermii [32], současně narůstá výskyt hemoragií [33]. Dočasná okluze není vhodná pro studování ischemicko-reperfuzního poškození po trombolýze, neboť obnovení průtoku je náhle a v plném průtoku na rozdíl od pomalu narůstající reperfuze u reálné trombolýzy [34]. Okluze je verifikována obvykle poklesem průtoku krve o oblasti perfundované střední mozkové tepny pomocí laser-dopplerovské techniky. S rozmachem katetrizačních trombektomických technik ale model opět nabývá na významu, protože ideálně imituje situaci po úspěšné trombektomii [6].

C. Trombembolie/trombolýza střední mozkové tepny. Z pohledu klinické poptávky může jít o ideální model. Základní limit je již zmiňovaná anestezie (její vliv na perfuzi mozku a perfuzní tlak) a charakter trombu – červený nebo bílý nebo smíšený [35]. Vlastní realizace má dvě fáze – příprava trombu a vlastní aplikace trombu. Obě fáze jsou pro konečný výsledek velice důležité. U nekvalitních trombů (nehomogenních) dochází k nepředvídatelné/nestandardizovatelné trombembolii i trombolýze. Vlastní trombembolie je realizovaná aplikaci trombu do vnitřní karotidy cestou retrográdní kanylace vnější karotidy. Podobně jako u okluzních modelů s vláknem. U králíku a větších savců lze použít selektivní katetrizace pod dohledem C-ramena. Podmínkou je ale absence arteriálního rete mirabile (viz výše). Model patří k nejkomplikovanějším, jak z pohledu zručnosti operatéra, standardizace postupu, tak technického vybavení.

D. Obliterace/přerušení střední mozkové tepny (dočasná/permanentní) z kraniotomie nebo transorbitálně. Zajímavou modifikací fokální nekrózy mozku u myší popsala Morancho a kol. [36]. Po opatrném odbroušení části spánkové kosti nad střední mozkovou tepnou je tato pomocí stereotaktického mikromanipulátoru dočasně z vně komprimována tupou jehlou s olivou nebo trvale koagulována. U zkušeného operatéra je model spojen s téměř 100% přežíváním. Oproti modelu s vláknem je ischemie selektivní a funguje kolaterální oběh. V podstatě stejnou techniku lze použít u všech zvířat např. Arikan et al. [21] ji použili u prasat. Obměnou toho postupu je přerušení průtoku v přední a střední mozkové tepně přístupem přes orbitu u paviánu [37]. Limitem kraniotomie je změna tlakový poměrů v liqouru při alteraci subarachnoideálního prostoru.

E. Spontánní CMP. Yamori a kol. [38] popsali kmen spontánně hypertenzních potkanů s náchylností k mrtvici (stroke – prone spontaneously hypertensive rats). Pokud jsou zvířata vystaveny od 6. týdne vysoko-slané dietě vyvíjí se u nich mezi 12. a 13. týdnem spontánně CMP. Model má v tomto provedení své limity – nevíme kdy CMP vznikne, srovnávat lze parametry před a po CMP. Samozřejmě lze SHR-SP potkany použít v libovolném jiném modelu CMP s tím, že jsou výsledky díky přítomné hypertenzi klinicky relevantnější [35,39]. Spontánní mrtvice lze vidět i u klasického modelu Goldblattovy renální (renovaskulární) hypertenze. V uspořádaní modelu se dvěma stenotickými ledvinami (2K2S = obě zachované ledviny, u obou provedena stenóza arteria renalis) je vysoká incidence spontánních mrtvic. Čtyřicet týdnů po konstrikci renálních arterií byla incidence spontánních stroků 61,8 %. U skupin 1K1S (jedna zachovaná ledvina, jedna sutura) 23,3 % a skupiny 2K1S (obě ledviny zachovány, u jedné provedena stenóza a. renalis) 16,7 % [40].

Modely mozkové hypoxie

Hypoxické modely slouží ke studiu globální mozkové hypoxie, zejména novorozenecké asfyxie a kardiopulmonální resuscitace a dále ke studiu vztahu mezi průtokem krve a funkčními a biochemickými změnami v mozkovém tkání. Spektrum modelů a provedení je variabilní – uni- nebo bilaterální stenózy až okluze společných karotid a současně i obratlových tepen, nebo zástava srdce a následná kardiopulmonální resuscitace (tab. 2).

Modely intracerebrálního krvácení

Dominantním regionem s modelovaným s krvácením je striatum, ale modely mohou imitovat léze i v jiných regionech. Modely nejčastěji používají hlodavce, ale popsané jsou i u prasat, králíků, koček a psů. Z pohledu četnosti převažují intraparenchymatozní aplikace autologní krve nebo kolagenázy, minoritní jsou experimenty s inertními substancemi (např. inflace balonkem, perforace cévy ostře zastřižením vláknem) nebo aplikace krevných složek (např. trombinu). Oba nejčastěji používané modely (aplikace kolagenázy a autologní krve) jsou dobře standardizovatelné [41].

Diskuze

Translační výzkum CMP používá široké spektrum zvířat a zvířecích modelů. Nejčastěji jsou používána malá zvířata: potkan, myš a nakonec králík. Dva nejčastěji používané modely jsou model intraluminální okluze a tromboembolický model. V průběhu let je možné sledovat nárůst objemu translačního výzkumu. Např. u ischemických modelů CMP to byly v 80. letech minulého století jednotky až desítky prací ročně, v poslední dekádě se počty publikací za rok blíží stovce. Současně se mění i spektrum použitých druhů s postupnou redukcí použití psů, koček a primátů a nárůstem četnosti použití hlodavců, přednostně myší. Tento trend je výsledkem dostupnosti nových zobrazovacích technik pro hlodavce (mikro CT, laboratorní MR s dostatečnou rozlišovací schopností, laser-optické metody, in vivo bioluminometrie apod.) a vyšší nabídky geneticky modifikovaných zvířat či nových inbredních kmenů.

Pro skutečnou a prakticky užitečnou translaci poznatků z preklinického výzkumu je potřeba zhodnotit limity modelu. V úvahu je potřeba vzít anatomické a fyziologické odlišnosti jednotlivých druhů/kmenů zvířat. Znalost limitů umožní také lepší interpretaci výsledků jiných autorů.

Pro relevantnost experimentu je kromě vlastního modelu stěžejní výběr vhodného živočišného druhu, kmene, pohlaví a stáří. Pohled na vhodnost využití jednotlivých druhů zvířat se v čase mění nejen díky etickým a kulturním aspektům (tady je silná geografická variabilita – Evropa vs. Asie a Amerika) u použití psů, koček a primátů, ale hlavně díky masívnímu zavádění zobrazovacích technik do výzkumu. Takže dnes i u myší či potkanů lze provádět solidní CT či MR nebo optická (in vivo bioluminometrie, laser-doppler) vyšetření a tím sledovat dynamiku změn bez nutné eutanazie.

Co je tedy potřebné vzít v úvahu při volbě správného modelu?

1. Každý model simuluje obvykle jenom část zkoumaného problému – např. modely z in situ tepennou trombózou vyvolanou třeba FeCl₃ nebo fotodynamicky. Tyto modely nejsou vhodné pro studium trombolýzy, byť formace trombu je pro model klíčová. U těchto modelů vzniká trombus na základě akutního poškození endotelu a následném odhalení kolagenních vláken submukózy se vznikem měkkého červeného trombu, který svým charakterem neodpovídá do mozku embolizovaným trombům u pacientů s aterosklerózou či fibrilací síní.
2. Vybraný živočišný druh musí reálně umožňovat sledování vybraných parametrů – např. realistické opakované odběry krve u potkana v řádu hodin jsou 0,25–0,5 ml plné krve, u myši 10× méně, u králíka 5× více než u potkana. Dále pro přenositelnost výsledků zejména při studiu imunitní reakce je potřeba respektovat genetické a epigenetické rozdíly mezi kmeny a druhy zvířat [6]. Obecně čím lépe máme geneticky i epigeneticky definovaný kmen, tím nám sice klesá variabilita odpovědi na podnět v experimentu (tj. zlepšuje se reprodukovatelnost a snižuje variabilita odpovědi), ale naměřená data nemusí odpovídat ani situaci u jiných zvířat stejného druhu, natož u člověka. Úskalí tohoto problému stručně a provokativně formuloval Becker: „... téměř vše, co víme o úloze imunitního systému při mrtvici, je odvozeno od jediné linie inbredních myší.“ [42]. Dále mikrobiota střeva může zásadně ovlivnit reakci inbredního kmene získaného od různých dodavatelů [6].
3. Anatomicko funkční rozdíly – zásadní jsou dva aspekty – rozdíly/příbuznost krevního zásobení mozku a anatomie mozku vč. gyryfikace. Např. v anatomii tepen je důležitý věk zvířat, protože s věkem se relativně zmenšuje diametr vnitřní krkavice k ostatním tepnám hlavy jako je vnější krkavice nebo arteria pterygopalatina. U mláďat a mladých jedinců je diametr vnitřní krkavice větší než diametr arteria pterygopalatina nebo vnější krkavice a s růstem lebky se diametr vnější krkavice i arteria pterygopalatina zvětšují. Např. u přežvýkavců se může vnitřní krkavice změnit ve vazivový pruh. Tato fakta jsou důležitá pro tromboembolické modely, kdy je stěžejní informací pro reprodukovatelnost modelu věk zvířete.
   Poměrně častou modifikací krevního zásobení hlavy u savců je existence tepenného rete mirabile zcela znemožňujícího intraluminární trombembolii střední mozkové tepny. Rozdíly v krevním zásobení a velikosti kolaterálního zásobení nejsou jenom mezidruhové, ale i mezi kmeny jednoho druhu. Např. u potkanů Wistar bylo prokázáno, že mají tenčí zadní komunikační tepny než u kmene Sprague-Dawley [14]. Ale Sprague-Dawley naopak vykazují atypické rozvětvení střední mozkové tepny téměř ve 20 % [43].
   Z pohledu klinických akutních a chronických následků CMP je důležité si uvědomit, že zatímco u lidí je podíl bílé hmoty 60 %, u psů klesá asi na 35 %, u králíků 20 %, u potkanů 15 % a u myší je pouze 10 % [44]. S tímto faktem je spojena i rozdílná funkční organizace, a tudíž lze očekávat jiný typ neurodefektu a jiný typ chronických následků než u lidí po CMP. Rozdíly ve složitosti a funkční organizaci mozku jsou méně problematické při analýze molekulární a buněčné odpovědi po akutní ischemické CMP. Stávají se ale hlavním problémem u modelů chronické mozkové mrtvice, kde jsou zejména sledovány obnovení funkce a neuropsychiatrické dlouhodobé následky [6]. Experimentální praxe však na tyto výtky reagovala poměrně pružně a paralelně s výzkumem neurodegenerativních onemocnění se i do výzkumu CMP zařazují behaviorální sledování zejména u hlodavců s cílem mapovat dlouhodobé funkční postižení, popřípadě vliv léčby či rehabilitace. Pro behaviorální studie jsou vhodné druhy s možností úchopu předními končetinami – drobní hlodavci a primáti. Je zajímavé, že výrazná lateralizace funkce mozku (považovaná za jeden z rysů lidského mozku), je již přítomna u hlodavců. Zatímco potkani s okluzí pravé střední mozkové tepny vykazovali přechodnou hyperaktivitu, tento účinek nebyl pozorován po okluzi levé střední mozkové tepny [45].
4. V dnešní době výběr živočišného druhu ovlivňuje i dostupná diagnostická technika – in vivo bioluminiscence je schopna zobrazit jenom myši a malé potkany do 250 g, nebo nám dostupné 9,4 T MR pro laboratorní zvířata pojme maximálně 2,5kg králíka nebo 600g potkana.
5. Dalším základním rozdílem mezi experimentálními modely a skutečností u CMP, která se vyskytuje u lidí, je použití anestezie ve většině zvířecích modelů. Vedle periferních účinků, vč. vlivu na krevní tlak, průtok krve do mozku a metabolizmus, anestetika mohou mít neuroprotektivní účinky. Tyto pak modulují některé aspekty spontánně se vyskytujících postischemických procesů [6]. Podle našich zkušeností i literárních dat je výběr anestetika zásadní pro plánovaní experimentu a může interferovat s plánovanými vyšetřeními (např. MR) [46].
6. V neposlední řadě se musí design experimentu snažit reflektovat reálnou situaci u pacientů – vyšší věk, respekt k zastoupení pohlaví, popřípadě absenci pohlavního cyklu, přítomnost komorbidit (hypertenze, obezita, diabetes apod.) apod.

Realizace experimentu by měla být v režimu podobném klinické studii – pokud to jde, tak by měla být zaslepena, randomizována s definovanými kritérii pro zařazení a vyloučení jedince z experimentu. Jsou-li k dispozici data a lze-li vypočíst velikost vzorku (sample size), tak jej v experimentu respektovat [5].

Hlavním limitem práce je neúplnost veřejně dostupných literárních zdrojů. Tyto zdroje neodráží skutečný celkový objem translačního výzkumu, neboť jeho část zůstává v archivech farmaceutických společností nebo jsou neopublikována z jiných důvodů (např. celkem pravidelně se nepublikuji negativní výsledky z pilotních studií, jsou publikovány čínsky nebo indicky bez překladu do evropských jazyků).

Závěr

Práce mapuje použití animálních modelů ve studiu CMP. Ambicí autorů bylo, aby práce byla malým přínosem jak pro čtenáře publikací týkajících se animálních modelů, tak pro výzkumníky plánující provádění animálních experimentů.

Práce vznikla s podporou projektu 16–30299A Agentury zdravotnického výzkumu Ministerstva zdravotnictví ČR.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Přijato k recenzi: 14. 9. 2018

Přijato do tisku: 5. 3. 2019

MVDr. Jana Hložková, Ph.D.

Farmaceutická fakulta

Veterinární a farmaceutická univerzita

Palackého tř. 1946/1

612 42 Brno

e-mail: jana.hlozkova.ro@gmail.com