#PAGE_PARAMS# #ADS_HEAD_SCRIPTS# #MICRODATA#

Homeostáza mědi jako terapeutický cíl u amyotrofické laterální sklerózy s mutací superoxiddismutázy 1 a sloučenina CuATSM


Copper homeostasis as a therapeutic goal in amyotrophic lateral sclerosis with a mutation in superoxide dismutase 1 and CuATSM molecule

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive neurodegenerative disease of motor neurons in the cerebral cortex, brain stem, and spinal cord leading to loss of muscle control and death from respiratory failure occurring mostly within 3–5 years of the disease diagnosis. The majority of ALS cases are sporadic (sALS); however, 5–10% are familial cases (fALS). Approximately 20% of fALS cases and 2–7% of sALS cases are associated with a mutation in the SOD1 gene that encodes the copper-zinc superoxide dismutase 1 enzyme (SOD1). The most common free radical arising in the human body is a not very reactive, and thus, not a very harmful superoxide which, however, is capable of spontaneous conversion by dismutation to hydrogen peroxide. SOD1 accelerates this dismutation and the produced hydrogen peroxide is eliminated by successive reactions. The mutations affecting SOD1 lead to copper dyshomeostasis in the spinal cord of animal (mice) models of ALS. Currently, the Cu2+ diacetyl-di, N4-methylthiosemicarbazone molecule is being tested in Australia in a phase I/II clinical trial in patients with ALS. It is assumed that this molecule could work not only in cases of ALS with SOD1 mutation (SOD1-ALS) as a copper or zinc carrier allowing their interaction with SOD1, and thus, it’s the proper function of the enzyme, but also as a compound for peroxynitrite uptake. As a result, its therapeutic use appears not to be limited only to cases of SOD1-ALS or ALS in general, but it might also have an effect as a compound to reduce cell damage by oxidative and nitrosative stress in other neurodegenerative diseases.

Keywords:

amyotrophic lateral sclerosis – copper-zinc superoxide dismutase – Cu2+ diacetyl-di, N4-methylthiosemicarbazone


Autori: P. Hemerková;  M. Vališ
Pôsobisko autorov: Neurologická klinika LF UK a FN Hradec Králové
Vyšlo v časopise: Cesk Slov Neurol N 2020; 83(1): 21-27
Kategória: Přehledný referát
doi: https://doi.org/10.14735/amcsnn202021

Súhrn

Amyotrofická laterální skleróza (ALS) je progresivní neurodegenerativní onemocnění (ND) motoneuronů v mozkové kůře, mozkovém kmeni a míše vedoucí ke ztrátě svalové kontroly a úmrtí vlivem respiračního selhání většinou do 3–5 let od stanovení diagnózy. Většina případů ALS je sporadická (sALS), avšak 5–10 % tvoří případy familiární (fALS). Asi 20 % případů fALS a 2–7 % případů sALS je spojeno s mutací SOD1 genu, který kóduje enzym měď-zinek superoxiddismutázu 1 (SOD1). Nejběžnější volný radikál vznikající v lidském těle je málo reaktivní a tedy nikoliv příliš škodlivý superoxid mající však schopnost spontánní přeměny dismutací na peroxid vodíku. SOD1 tuto dismutaci urychluje a vzniklý peroxid vodíku je odstraňován navazujícími reakcemi. Mutace postihující SOD1 vedou k poruše homeostázy mědi v míše zvířecích (myších) modelů ALS. V současnosti je v Austrálii testována sloučenina Cu2+ diacetyl-di, N4-methylthiosemicarbazon v I/II fázi klinické studie u ALS pacientů. Předpokládá se, že tato molekula by mohla fungovat nejen u případů ALS s mutací SOD1 (SOD1-ALS) jako nosič mědi nebo zinku umožňující jejich interakci se SOD1, a tím správnou funkci enzymu, ale i jako sloučenina vychytávající peroxynitrit. Léčebný potenciál tedy není limitován pouze na SOD1-ALS či ALS obecně, ale jako sloučenina snižující poškození buněk oxidativním a nitrosativním stresem by mohla najít využití i při terapii dalších ND.

Klíčová slova:

amyotrofická laterální skleróza – měď-zinek superoxiddismutáza – Cu2+ diacetyl-di, N4-methylthiosemicarbazon

Úvod

Amyotrofická laterální skleróza (ALS) je progresivní neurodegenerativní onemocnění (ND) motorických neuronů v mozkové kůře, mozkovém kmeni a míše vedoucí ke ztrátě svalové kontroly a úmrtí vlivem respiračního selhání ve většině případů do 3– 5 let od stanovení dia­gnózy [1,2]. Většina případů ALS je sporadická (sALS), avšak přibližně 10 % tvoří případy familiární (fALS) [3]. Dosud bylo identifikováno více než 25 genů, jejichž mutace je spojena se vznikem fALS [4]. Nejčastější genetická příčina fALS je hexanukleotidová expanze genu C9ORF72, kterou nalézáme u 40 % pa­cientů s fALS, u 7 % pa­cientů se sALS, ale také u 25 % pa­cientů s familiární formou frontotemporální demence (fFTD) [5]. Obě tyto nemoci jsou nyní nově brány jako součást jednoho klinickopatologického spektra, TDP-43 proteinopatie, a jejich symp­tomy se mohou často do jisté míry prolínat. U přibližně 15 % pa­cientů s FTD se rozvine i ALS, naopak 5– 22 % pa­cientů s ALS onemocní i FTD. Kognitivní dysfunkci typu FTD ale můžeme pozorovat téměř u 50 % pa­cientů s ALS [6,7]. Jako první gen, jehož mutace je spojena se vznikem fALS, byl detektován SOD1 gen, který kóduje enzym měď-zinek superoxiddismutázu (Cu2+/ Zn2+SOD1, dále jen SOD1). Bylo popsáno více než 170 různých mutací SOD1, které mohou být kauzálními pro přibližně 20 % fALS a 2– 7 % sALS [8– 10].

Fyziologická role superoxiddismutázy 1

Nejběžnější volný radikál vznikající v lidském těle je málo reaktivní a relativně neškodný superoxid schopný spontán­ní přeměny tzv. dismutací na peroxid vodíku, který je ihned odstraňován navazujícími reakcemi katalyzovanými katalázou a peroxidázou. Ze superoxidu ale mohou vznikat i další velmi škodlivé reaktivní formy kyslíku, jako jsou hydroxylový radikál, peroxynitrit či kyselina chlorná. Jelikož má hydroxylový radikál velmi krátký bio­logický poločas, neexistuje mechanizmus jeho odstranění, a organizmy proto odstraňují již samotný superoxid. A právě k tomu slouží enzym SOD1 urychlující dismutaci superoxidu. SOD1, přítomná ve všech aerobních organizmech, se vyskytuje ve třech formách lišících se svým kofaktorem, tedy atomem kovu. Fylogeneticky mladší Mn2+SOD1 a Fe2+SOD1 se nachází v prokaryontech, prokaryotických řasách a protozoích. Cu2+/ Zn2+SOD1 se nachází v buňkách eukaryotických organizmů –  rostlin i živočichů. Je to enzym dimerické struktury obsahující na každé z podjednotek jeden kovový atom zinku a mědi [11,12].

Navázáním zinku dochází ke stabilizaci struktury bílkoviny. Katalytická funkce enzymu, a tedy vychytávání volných radikálů, závisí na přítomnosti mědi, která je k proteinu doručována pomocí chaperonu mědi pro SOD1 (copper chaperone for SOD1; CCS) [13– 15]. Struktura a základní funkce SOD1 jsou shrnuty na obr. 1 [16]. V motoneuronu je enzym přítomen nejenom v cytoplazmě, ale také v intermembránovém prostoru mitochondrií. Kromě již zmíněné role při ochraně buňky před oxidativním stresem je SOD1 schopna i regulace genové exprese dalších proteinů a účastní se během axonového transportu mitochondrií z buněčného těla k synapsi (obr. 2) [17].

Obr. 1. Schéma struktury a funkce superoxiddismutázy 1 [16].
H2O2 – peroxid vodíku; O2 •− – superoxid
Fig. 1. Diagram of structure and function of superoxide dismutase 1 [16].
H2O2 – hydrogen peroxide; O2 •− – superoxide
Schéma struktury a funkce superoxiddismutázy 1 [16].<br>
  H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> – peroxid vodíku; O2 •− – superoxid<br>
Fig. 1. Diagram of structure and function of superoxide dismutase 1 [16].<br>
H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> – hydrogen peroxide; O2 •− – superoxide

Obr. 2. Funkce SOD1 v motorických neuronech [17].
SOD1 se nachází v cytoplazmě, na synapsi a v mezimembránovém prostoru mitochondrií. Rolí SOD1 je přeměna volných radikálů, zejména superoxidu O2 −, čímž zmírňuje oxidativní stres. Je rovněž secernována extracelulárně a předpokládá se, že i zde má neuroprotektivní účinky. SOD1 je schopna změnit stav aktivace jiných proteinů, a tím i regulace genové exprese, proliferace a diferenciace dalších proteinů. Studie zkoumající následky ztráty funkce enzymu prokázaly, že se SOD1 rovněž podílí na axonovém transportu mitochondrií k synapsi.
SOD1 – superoxiddismutáza 1
Fig. 2. Functions of SOD1 in motoneurons [17].
SOD1 is located in the cytoplasm, synapse and intermembrane space of mitochondria. The role of SOD1 role is to oxidize free radicals, notably superoxide O2 −, thereby mitigating oxidative stress. It is also secreted and thought to have neuroprotective eff ects extracellularly. SOD1 can change the activation states of other proteins, thereby regulating gene expression, proliferation, and diff erentiation of other proteins. Loss of function studies have shown that SOD1 also participates in axonal traffi cking of mitochondria to the synapse.
SOD1 – superoxide dismutase 1
Funkce SOD1 v motorických neuronech [17].<br>
SOD1 se nachází v cytoplazmě, na synapsi a v mezimembránovém prostoru mitochondrií. Rolí SOD1 je přeměna volných radikálů, zejména
superoxidu O2 −, čímž zmírňuje oxidativní stres. Je rovněž secernována extracelulárně a předpokládá se, že i zde má neuroprotektivní účinky.
SOD1 je schopna změnit stav aktivace jiných proteinů, a tím i regulace genové exprese, proliferace a diferenciace dalších proteinů. Studie
zkoumající následky ztráty funkce enzymu prokázaly, že se SOD1 rovněž podílí na axonovém transportu mitochondrií k synapsi.<br>
SOD1 – superoxiddismutáza 1<br>
Fig. 2. Functions of SOD1 in motoneurons [17].<br>
SOD1 is located in the cytoplasm, synapse and intermembrane space of mitochondria. The role of SOD1 role is to oxidize free radicals, notably
superoxide O2 −, thereby mitigating oxidative stress. It is also secreted and thought to have neuroprotective eff ects extracellularly. SOD1
can change the activation states of other proteins, thereby regulating gene expression, proliferation, and diff erentiation of other proteins.
Loss of function studies have shown that SOD1 also participates in axonal traffi cking of mitochondria to the synapse.<br>
SOD1 – superoxide dismutase 1

Porucha homeostázy mědi u neurodegenerativních onemocnění a role superoxiddismutázy 1

Měď se vstřebává v tenkém střevě, odkud se dostává do jater a do ledvin. V játrech je 65– 90 % vstřebané mědi navázáno na ceruloplazmin a takto uvolněno do krevního oběhu [18]. Hematoencefalickou bariéru (HEB) je ale schopen překonat jen zbytek volné, nenavázané mědi [19]. Kapiláry HEB jsou v těsném kontaktu s astrocyty exprimujícími metalotioneiny (MT), které plní úlohu měď-sekvestrujících proteinů. Z astrocytů jsou následně ionty mědi uvolňovány do neuronů [20,21]. Inkorporace mědi do buňky je zajištována influxními proteiny –  transportními proteiny mědi (CTR 1-3) a divalentním transportérem kovů (DMT 1). Při přebytku mědi v buňce je za její vyloučení zodpovědná adenozin trifosfatáza katalyzující hydrolýzu adenozin trifosfátu na adenozin difosfát a fosfát, ATPáza 7 A, která vzniklou energii využívá k aktivnímu pumpování nadbytečných molekul mědi ven z buňky [22,23]. Uvnitř buňky je měď prostřednictvím tří přenašečů, tzv. chaperonů mědi, doručována do Golgiho aparátu, cytochrom C oxidázy v mitochondriích a konečně SOD1 v cytoplazmě [24,25]. Doručení mědi do SOD1 závisí pouze na CCS a u myší s genetickou delecí CCS dochází k signifikantnímu poklesu enzymatické aktivity SOD1 [25,26]. Dříve se předpokládalo, že právě mutace způsobující ztrátu enzymatické aktivity SOD1 vedou ke vzniku ALS, nicméně enzymatická aktivita SOD1 zůstává u mnoha případů SOD1-ALS přibližně stejná jako u nemutovaného proteinu [27]. Obecně tedy mutace postihující SOD1 můžeme rozdělit do dvou typů. První skupinu tvoří tzv. wild-type like (WTL) mutace, u kterých je aktivita enzymu podobná nemutovanému. Druhá skupina je popisována jako tzv. metal-bind­­ing region (MBR) mutace, které vedou ke snížení katalytické aktivity enzymu [12]. Oba typy mutací ve svém důsledku vedou k narušení homeostázy mědi v míše zvířecích modelů ALS a k její intracelulární akumulaci [28,29]. Tato akumulovaná měď je ale nedostupná jednak pro SOD1, což vede k chybné agregaci proteinu, a navíc dochází i k ovlivnění dalších enzymů vázajících měď, jako je mitochondriální cytochrom c oxidáza [28,30]. Nadbytečná měď hraje roli spouštěče oxidativního stresu, lipidové peroxidace, apoptózy a formace SOD1 agregátů. Studie zabývající se poruchou homeostázy mědi u ALS většinou používají transgen­ní G93A-SOD1 myši. Jedná se o model fALS s mutací SOD1, kde dochází k záměně glycinu za alanin v pozici 93. Terapeutické přístupy uvedené níže by ale mohly mít efekt i u sALS a dokonce i u dalších ND. I u pa­cientů se sALS totiž bývá hladina mědi zvýšena v séru, v motorickém kortexu i v likvoru, kde byly navíc naměřeny i zvýšené hladiny železa a hořčíku [31,32]. U ně­kte­rých pa­cientů se sALS byla zjištěna extrémně vysoká hladina zinku a mědi v likvoru dokonce před zhoršením motorických funkcí [33]. U nemocných s Parkinsonovu nemocí se mění množství mědi v substantia nigra [34]. Pro Alzheimerovu demenci je typické zvýšení množství mědi a zinku v placích amyloidu, ale naopak v ně­kte­rých částech neokortexu dochází k jejich depleci [35,36]. Není tedy s podivem, že mnohé výzkumné strategie léčby ND cílí právě na obnovení homeostázy mědi a ostatních těžkých kovů.

Chelatační terapie a homeostáza mědi

Chelatace je fyzikálně-chemický proces, při kterém dochází k navázání vícevazebných kationtů, např. kovů, na ně­kte­ré organické sloučeniny a k jejich vyloučení z organizmu. S použitím myších modelů SOD1-ALS byla zkoušena chelatační terapie D-penicilaminem, trientinem a tetratiomolybdátem (TTM) [28,37– 39]. Léčba všemi třemi chelátory měla za následek pozdější nástup onemocnění a prodloužení celkového přežití transgen­ních myší. TTM navíc zpomaloval progresi onemocnění, dokonce i pokud bylo podávání započato až v průběhu onemocnění a při léčbě došlo k redukci intracelulární mědi v míše G93A-SOD1 myší k normálním hladinám [28,39]. Podávání TTM vedlo i k prodloužení délky trvání onemocnění. Tento rozdíl v terapeutickém účinku jednotlivých chelátorů bude pravděpodobně způsoben velmi dobrou schopností TTM procházet HEB i při periferním podání [39,40]. Tyto závěry jsou velmi slibné, nicméně žádné výsledky klinických zkoušek s TTM dosud publikovány nebyly.

Metalotioneiny a jejich vliv na homeostázu mědi

Dále se nabízí možnost ovlivnění intracelulární hladiny mědi prostřednictvím indukce exprese MT. MT jsou nízkomolekulární, intracelulární, na cystein velmi bohaté proteiny mající velkou afinitu k těžkým kovům [41]. Existují čtyři izoformy MT. MT-1 a MT-2 se vyskytují ve všech tkáních a právě tyto formy hrají důležitou roli ve zprostředkování homeostázy kovových iontů a při ochraně buněk CNS před oxidativním stresem, potlačování zánětu a apoptózy [42– 45]. MT jsou schopny i stabilizace transkripčního faktoru indukovaného hypoxií a podporují neovaskularizaci. Mohou hrát významnou roli i v rozvoji ně­kte­rých onemocnění (obr. 3) [46]. Tokuda et al prokázali, že k indukci MT-1 a MT-2 lze použít syntetický glukokortikoid dexametazon. K indukované expresi MT dochází v předních rozích míšních v astrocytech a mikroglii, nikoli však v motorických neuronech. U SOD1-ALS myší se při podávání dexametazonu signifikantně prodloužily délka života i trvání onemocnění. Došlo i k významné redukci G93A-SOD1 agregátů v astrocytech a mikroglii. Tyto výsledky korelují s předpokladem, že mutace SOD1 v neuronech ovlivňuje začátek/ nástup onemocnění, zatímco přítomnost mutované SOD1 v astrocytech ovlivňuje rychlost progrese onemocnění [47,48]. Hashimoto et al zjistili, že expresi MT-1/ -2 a dokonce i MT-3 v astrocytech u myších G93A-SOD1 modelů lze indukovat i fyzickou aktivitou [49]. Kromě ALS se zkoumá možný terapeutický potenciál indukce MT i u spinální muskulární atrofie, onemocnění postihujícího pouze periferní motoneuron [46]. Předpokládá se i možný neuroprotektivní účinek MT při terapii ischemické CMP. MT, především izoforma MT-3, by svým antioxidačním účinkem mohly napomáhat záchraně buněk v ischemickém polostínu. Zde buňky nezanikají nekrózou jako v centru ischemie, ale porucha krevního průtoku nastartuje apoptickou kaskádu s fragmentací genomické deoxyribonukleové kyseliny a s ischemicko-reperfuzním poškozením spojeným se vznikem reaktivních forem kyslíku [50,51].

Obr. 3. Předpokládaný schematický mechanizmus zapojení metalotioneinů do procesu neurodegenerace a neovaskularizace [46].
Metalotioneiny vážou kovové ionty, snižují produkci volných kyslíkových radikálů a působí tedy proti neurodegenerativním onemocněním. Zároveň podporují neovaskulární poruchy prostřednictvím stabilizace faktoru- -1α indukovatelného hypoxií.
Fig. 3. Putative schematic mechanism of the involvement of metallothioneins in neurodegeneration and neovascularization [46]
. Metallothioneins bind metal ions and inhibit reactive oxygen species production to protect against neurodegenerative diseases, and support neovascular disorders via stabilizing hypoxia inducible factor-1α.
Předpokládaný schematický
mechanizmus zapojení metalotioneinů
do procesu neurodegenerace
a neovaskularizace [46].<br>
Metalotioneiny vážou kovové ionty, snižují
produkci volných kyslíkových radikálů a působí
tedy proti neurodegenerativním onemocněním.
Zároveň podporují neovaskulární
poruchy prostřednictvím stabilizace faktoru-
-1α indukovatelného hypoxií.<br>
Fig. 3. Putative schematic mechanism of the
involvement of metallothioneins in neurodegeneration
and neovascularization [46]<br>.
Metallothioneins bind metal ions and inhibit
reactive oxygen species production to protect
against neurodegenerative diseases, and
support neovascular disorders via stabilizing
hypoxia inducible factor-1α.

Superoxiddismutáza a CuATSM

V 60. letech 20. století byly u malé sloučeniny známé jako Cu2+ diacetyl-di, N4-metylthiosemicarbazon (CuATSM) popsány protinádorové účinky. Byla také popsána selektivní distribuce či retence této látky v hypoxických tkáních a v tkáních s oxidativním stresem a sloučenina našla svoje využití jako marker hypoxie při zobrazování tkání PET [52,53]. V současné době je tento komplex mědi v Austrálii testován v I/ II fázi klinické studie u pa­cientů s ALS [54]. Předpokládá se, že sloučenina CuATSM by mohla mít terapeutický efekt nejen u SOD1-ALS jako nosič mědi nebo i zinku umožňující interakci těchto kovů se SOD1, a tím i její správnou funkci, ale i jako látka vychytávající peroxynitrit. Léčebný účinek by se tedy mohl dostavit jak u případů SOD1-ALS či ALS obecně, tak i u dalších ND. Australští autoři Far­rawell et al v roce 2019 publikovali studii, ve které zkoumali efekt CuATSM na buněčných kulturách s buňkami exprimujícími deset různých SOD1-ALS mutací. Zjistili, že u WTL mutací, tedy u mutací, kde je zachována schopnost enzymu navázat měď či zinek, vede podávání CuATSM k doručení a navázání mědi k SOD1, což je doprovázeno správným skládáním enzymu, zvýšením aktivity SOD1, naopak snížením SOD1 agregace a v konečném důsledku záchranou buněk. U MBR mutací, tedy u mutací postihujících oblast kódující schopnost proteinu navazovat měď či zinek, tento efekt pozorován nebyl (obr. 4) [54]. I ve studii Robertse et al bylo u G37R-SOD1 myší detekováno velké množství měď-deficientní SOD1, které bylo následně sníženo podáváním CuATSM, přičemž množství Cu2+/ Zn2+SOD1 se následně zvýšilo a došlo k prodloužení přežití myších modelů i zlepšení jejich motorického výkonu [55]. Zdá se tedy, že nadměrná exprese patogen­ních WTL SOD1 mutantních forem vede ke vzniku měď-pozbývajících forem SOD1, které se potom chybně skládají a agregují (obr. 5) [54]. Stejný mechanizmus působení CuATSM předpokládají i Mc Al­lum et al, kteří navíc efekt CuATSM srovnávali s riluzolem, prozatím jediným léčivem běžně užívaným v ČR při léčbě ALS, inhibujícím glutamátergní transmisi a prodlužujícím přežití nemocných přibližně o pouhé 3 měsíce. Podávání CuATSM v jejich studii také prodlužovalo přežití a zlepšovalo motorické funkce transgen­ních G37R-SOD1 myší, přičemž efekt byl závislý na dávce. Zatímco nejvyšší testovaná dávka CuATSM prodloužila přežití o celých 26 %, při terapii riluzolem se jednalo pouze o 3,3 % a zlepšení motorických funkcí nebylo pozorováno vůbec [56]. Mc Al­lum et al se zaobírali i otázkou, zda také doručení zinku k SOD1 pomocí Zn2+ATSM bude mít obdobný terapeutický efekt. I transgen­ní G37R-SOD1 myši při podávání Zn2+ATSM vykazovaly zlepšení motorických funkcí i delší přežití. Biochemická analýza jejich míšní tkáně ale ukázala, že množství celkového zinku i množství zinku navázaného na SOD1 zůstalo stejné, avšak došlo k elevaci celkového množství mědi i mědi navázané na SOD1. Další experimenty prokázaly, že při podávání Zn2+ATSM v přítomnosti mědi dochází k tzv. transmetalaci, tedy k výměně kovu za kov [57]. Zinkem a jeho rolí v patogenezi SOD1-ALS se zabývali Ermilova et al. Vycházeli z předpokladu, že dieta prostá zinku povede ke zvýšení frakce zinek-deficientní SOD1, což bude vést k chybnému skládání, agregaci a akumulaci enzymu, a tudíž k akceleraci progrese onemocnění, a naopak suplementace zinkem v potravě bude působit protektivně. Prokázali, že podávání malých dávek zinku opravdu vede k prodloužení přežití G93A-SOD1 myší, avšak výsledky nebyly statisticky významné. Podávání vysokých dávek zinku ale vedlo naopak k výrazné akceleraci průběhu onemocnění, pravděpodobně vlivem zhoršeného vstřebávání mědi. Nicméně dá se předpokládat, že mírná perorální suplementace zinkem by mohla vést k redukci rizika vzniku ALS v rodinách s potenciálními mutacemi SOD1 genu [58]. Vieira et al se zabývali otázkou, zdali efekt CuATSM a ZnATSM opravdu závisí právě na přítomnosti kovových iontů a ATSM hraje roli přenašeče zvyšujícího interakci těchto kovů se SOD1 nebo jde o efekt samotné molekuly ATSM. V jejich studii byly znovu použity G93A-SOD1 myši. Při léčbě CuATSM opět docházelo k opožděnému nástupu příznaků nemoci i k prodloužení délky jejího trvání, ale při terapii samotnou molekulou ATSM žádný efekt pozorován nebyl [52]. Poněkud odlišný efekt působení CuATSM předpokládají autoři Soon et al. Ti ve své studii CuATSM opět podávali G93A-SOD1 myším, přičemž léčba měla zase za následek signifikantní prodloužení přežití, a to i při započetí podávání až po objevení se prvních příznaků onemocnění. Autoři předpokládají, že CuATSM funguje jako efektivní vychytávač peroxynitritu, který spouští oxidativní stres [59]. Peroxynitrit, schopný indukce apoptózy motoneuronů, vzniká reakcí superoxidu s oxidem dusnatým a je odpovědný za hydroxylaci a nitraci aminokyseliny tyrozinu, ale i mnohých dalších proteinů. Nesporná je i jeho role v aktivaci mikroglie a astrocytů vedoucí k rozvoji neuroinflamace účastnící se v patogenezi nejen ALS, ale i neurodegenerace obecně. Jako scavenger volných radikálů funguje i další léčivo pro ALS pa­cienty již uvedené na trh, a to po více než 20 letech od zavedení léčby riluzolem. Jedná se o edaravon, který byl v roce 2015 registrován pro léčbu ALS v Japonsku a v Jižní Koreji a o 2 roky později i v USA [60].

Obr. 4. CuATSM chrání před in vitro cytotoxicitou mutant WTL superoxiddismutázy mědi a zinku, ale nikoli mutantů, které narušují vazbu kovů [54].
MBR – metal-binding region; SOD1 – superoxiddismutáza 1; WTL – wild-type like
Fig. 4. CuATSM protects against the in vitro cytotoxicity of WTL copper-zinc superoxide dismutase mutants but not mutants that disrupt metal binding [54].
MBR – metal-binding region; SOD1 – superoxide dismutase 1; WTL – wild-type like
CuATSM chrání před in vitro cytotoxicitou mutant WTL superoxiddismutázy mědi
a zinku, ale nikoli mutantů, které narušují vazbu kovů [54].<br>
MBR – metal-binding region; SOD1 – superoxiddismutáza 1; WTL – wild-type like<br>
Fig. 4. CuATSM protects against the in vitro cytotoxicity of WTL copper-zinc superoxide
dismutase mutants but not mutants that disrupt metal binding [54].<br>
MBR – metal-binding region; SOD1 – superoxide dismutase 1; WTL – wild-type like

Obr. 5. Model zásahu CuATSM do patologie mutantní SOD1 [54].
Červené šipky znázorňují chybné skládání SOD1 a jejich následnou agregaci během syntézy enzymu, zatímco modré šipky ukazují, jak CuATSM dokáže tento proces ovlivnit. Tloušťka šipky koreluje s pravděpodobností znázorněného děje. Během syntézy se nejprve vytvoří meziprodukt (červená hvězda), který je připravený k navázání zinku. Poté dochází k asociaci s mědí pomocí CCS. Spojením s mědí dochází k vytvoření zralých monomerů, které se potom spojují v dimery tvořící funkční plnohodnotný enzym. Výsledkem CuATSM je větší množství mědi doručené k CCS, což vede k většímu přenosu mědi na SOD1, a tedy ke snížení množství SOD1, která by se v této fázi syntézy počala chybně skládat a agregovat.
CCS – chaperon mědi pro SOD1; SOD1 – superoxiddismutáza 1
Fig. 5. Model of CuATSM rescue of mutant SOD1 pathology [54].
Red arrows show the folding and off-folding pathways for SOD1, whereas blue arrows show the contribution of CuATSM to these pathways. The arrow thickness suggests the probability of the pathways occurring. Following synthesis, mutant SOD1 (red star) folds into an intermediate state that is primed for Zn binding. Zn-bound SOD1 associates with Cu-loaded CCS for transfer of Cu leading to the formation of a mature SOD1 monomer that can form dimers forming a functional full-fl edged enzyme. CuATSM results in a larger pool of Cu-bound CCS, which in turn results in greater transfer of Cu to SOD1, reducing the amount of SOD1 that enters an off-folding pathway at this point.
CCS – copper chaperone for SOD1; SOD1 – superoxide dismutase 1
Model zásahu CuATSM do patologie mutantní SOD1 [54].<br>
Červené šipky znázorňují chybné skládání SOD1 a jejich následnou agregaci během syntézy enzymu, zatímco modré šipky ukazují, jak
CuATSM dokáže tento proces ovlivnit. Tloušťka šipky koreluje s pravděpodobností znázorněného děje. Během syntézy se nejprve vytvoří
meziprodukt (červená hvězda), který je připravený k navázání zinku. Poté dochází k asociaci s mědí pomocí CCS. Spojením s mědí dochází
k vytvoření zralých monomerů, které se potom spojují v dimery tvořící funkční plnohodnotný enzym. Výsledkem CuATSM je větší množství
mědi doručené k CCS, což vede k většímu přenosu mědi na SOD1, a tedy ke snížení množství SOD1, která by se v této fázi syntézy počala
chybně skládat a agregovat.<br>
CCS – chaperon mědi pro SOD1; SOD1 – superoxiddismutáza 1<br>
Fig. 5. Model of CuATSM rescue of mutant SOD1 pathology [54].<br>
Red arrows show the folding and off-folding pathways for SOD1, whereas blue arrows show the contribution of CuATSM to these pathways.
The arrow thickness suggests the probability of the pathways occurring. Following synthesis, mutant SOD1 (red star) folds into an intermediate
state that is primed for Zn binding. Zn-bound SOD1 associates with Cu-loaded CCS for transfer of Cu leading to the formation of a mature
SOD1 monomer that can form dimers forming a functional full-fl edged enzyme. CuATSM results in a larger pool of Cu-bound CCS,
which in turn results in greater transfer of Cu to SOD1, reducing the amount of SOD1 that enters an off-folding pathway at this point.<br>
CCS – copper chaperone for SOD1; SOD1 – superoxide dismutase 1

Závěr

Přesná patogeneze vzniku ALS i mnoha dalších ND zůstává stále nejasná. Většina případů těchto onemocnění je sporadická a mají multifaktoriální ráz. Nezbývá tedy než hledat dílčí patogenetické mechanizmy a terapeutické přístupy na ně se zaměřující. Při terapii ALS, ale i ostatních ND je pravděpodobně takovým jednotlivým patogenetickým dějem porucha homeostázy mědi a zcela jistě i působení oxidativního a nitrosativního stresu. Molekula CuATSM by mohla příznivě ovlivnit oba tyto etiopatogenetické činitele. Kauzální terapie ALS pravděpodobně nebude ještě dlouho dostupná, avšak je reálné, že brzy budeme moci našim pa­cientům nabídnout i další léčebné postupy než pouhou terapii riluzolem prodlužujícím přežití o několik měsíců a že budeme umět pomoci i tam, kde to zatím není možné.

Grantová podpora

Podpořeno MZ ČR –  RVO (FNHK, 00179906) a UK PROGRES Q40. Financováno z projektu IT4Neuro(degeneration), reg. č. CZ.02.1.01/ 0.0/ 0.0/ 18_069/ 0010054.

Konflikt zájmů

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádný konflikt zájmů.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

The Editorial Board declares that the manu­script met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers.

Přijato k recenzi: 7. 8. 2019

Přijato do tisku: 10. 12. 2019

MUDr. Pavlína Hemerková

Neurologická klinika

LF UK a FN Hradec Králové

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové

e-mail: pavlinahemerkova@seznam.cz

doc. MUDr. Martin Vališ, Ph.D., FEAN

Neurologická klinika

LF UK a FN Hradec Králové

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové

e-mail: martin.valis@fnhk.cz


Zdroje

1. Wijesekera LC, Leigh PN. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet J Rare Dis 2009; 4: 3. doi: 10.1186/ 1750-1172-4-3.

2. Niedermeyer S, Murn M, Choi PJ. Respiratory failure in amyotrophic lateral sclerosis. Chest 2019; 155(2): 401– 408. doi: 10.1016/ j.chest.2018.06.035.

3. Alsultan AA, Wal­ler R, Heath PR et al. The genetics of amyotrophic lateral sclerosis: cur­rent insights. Degener Neurol Neuromuscul Dis 2016; 6: 49– 64. doi: 10.2147/ DNND.S84956.

4. Nguyen HP, Van Broeckhoven C, van der Zee J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends Genet 2018; 34(6): 404– 423. doi: 10.1016/ j.tig.2018.03.001.

5. Lafer­riere F, Polymenidou M. Advances and chal­lenges in understand­­ing the multifaceted pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Swiss Med Wkly 2015; 145: w14054. doi: 10.4414/ smw.2015.14054.

6. Lomen-Hoerth C, Murphy J, Langmore S et al. Are amyotrophic lateral sclerosis patients cognitively normal? Neurology 2003; 60(7): 1094– 1097. doi: 10.1212/ 01.wnl.0000055861.95202.8d.

7. Strong MJ. The syndromes of frontotemporal dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Amyotroph Lateral Scler 2008; 9(6): 323– 338. doi: 10.1080/ 17482960802372371.

8. Rosen DR, Siddique T, Patterson D et al. Mutations in Cu/ Zn superoxide dismutase gene are as­sociated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature 1993; 362(6415): 59– 62. doi: 10.1038/ 362059a0.

9. Taylor JP, Brown RH Jr, Cleveland DW. Decod­­ing ALS: from genes to mechanism. Nature 2016; 539(7628): 197– 206. doi: 10.1038/ nature20413.

10. Jackson M, Al-Chalabi A, Enayat ZE. Copper/ zinc superoxide dismutase 1 and sporadic amyotrophic late­ral sclerosis: analysis of 155 cases and identification of a novel insertion mutation. Ann Neurol 1997; 42(5): 803– 807. doi: 10.1002/ ana.410420518.

11. Racek J. Superoxiddismutáza. [online]. Dostupné z URL: https:/ / www.krevnicentrum.cz/ laboratorni-prirucka/ BOJRAAI.htm.

12. Valentine JS, Doucette PA, Zittin Potter S. Copper-zinc superoxide dismutase and amyotrophic lateral sclerosis. An­nu Rev Biochem 2005; 74: 563– 593. doi: 10.1146/ an­nurev.bio­chem.72.121801.161647.

13. Leinartaite L, Saraboji K, Nordlund A et al. Fold­­ing catalysis by transient coordination of Zn2+ to the Cu ligands of the ALS-as­sociated enzyme Cu/ Zn superoxide dismutase 1. J Am Chem Soc 2010; 132(38): 13495– 13504. doi: 10.1021/ ja1057136.

14. Banci L, Bertini I, Cantini F et al. Human superoxide dismutase 1 (hSOD1) maturation through interaction with human copper chaperone for SOD1 (hCCS). Proc Natl Acad Sci USA 2012; 109(34): 13555– 13560. doi: 10.1073/ pnas.1207493109.

15. McCord JM, Fridovich I. Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem 1969; 244(22): 6049– 6055.

16. Franco MC, Den­nys CN, Ros­si FH et al. Superoxide dismutase and oxidative stress in amyotrophic lateral sclerosis. [online]. Available from URL: https:/ / www.intechopen.com/ books/ cur­rent-advances-in-amyotrophic-lateral-sclerosis/ superoxide-dis­mutase-and-oxidative-stres­s-in-amyotrophic-lateral-sclerosis.

17. Al­lison WT, DuVal MG, Nguyen-Phuoc K. Reduced Abundance and subverted functions of proteins in prion-like dis­eases: gained functions fascinate but lost functions af­fect aetiology. Int J Mol Sci 2017; 18(10): E2223. doi: 10.3390/ ijms18102223.

18. Zheng W, Mon­not AD. Regulation of brain iron and copper homeostasis by brain bar­rier systems: implication in neurodegenerative dis­eases. Pharmacol Ther 2012; 133(2): 177– 188. doi: 10.1016/ j.pharmthera.2011.10.006.

19. Choi BS, Zheng W. Copper transport to the brain by the blood-brain bar­rier and blood-CSF bar­rier. Brain Res 2009; 1248: 14– 21. doi: 10.1016/ j.brainres.2008.10.056.

20. Scheiber IF, Dringen R. Astrocyte functions in the copper homeostasis of the brain. Neurochem Int 2013; 62(5): 556– 565. doi: 10.1016/ j.neuint.2012.08.017.

21. West AK, Hidalgo J, Eddins D et al. Metal­lothionein in the central nervous system: roles in protection, regeneration and cognition. Neurotoxicology 2008; 29(3): 489– 503. doi: 10.1016/ j.neuro.2007.12.006.

22. Kuo YM, Zhou B, Cosco D et al. The copper transporter CTR1 provides an es­sential function in mam­malian embryonic development. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98(12): 6836– 6841. doi: 10.1073/ pnas.111057298.

23. Ar­redondo M, Muñoz P, Mura CV et al. DMT1, a physiological­ly relevant apical Cu1+ transporter of intestinal cel­ls. Am J Physiol Cell Physiol 2003; 284(6): C1525– C1530. doi: 10.1152/ ajpcel­l.00480.2002.

24. Hamza I, Prohaska J, Gitlin JD. Es­sential role for Atox1 in the copper-mediated intracel­lular traf­fick­­ing of the Menkes ATPase. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100(3): 1215– 1220. doi: 10.1073/ pnas.0336230100.

25. Wong PC, Waggoner D, Subramaniam JR et al. Copper chaperone for superoxide dismutase is es­sential to activate mam­malian Cu/ Zn superoxide dismutase. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(6): 2886– 2891. doi: 10.1073/ pnas.040461197.

26. Furukawa Y, Tor­res AS, O’Hal­loran TV. Oxygen-induced maturation of SOD1: a key role for disulfide formation by the copper chaperone CCS. EMBO J 2004; 23(14): 2872– 2881. doi: 10.1038/ sj.emboj.7600276.

27. Gurney ME, Pu H, Chiu AY et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science 1994; 264(5166): 1772– 1775. doi: 10.1126/ science.8209258.

28. Tokuda E, Okawa E, Watanabe S et al. Dysregulation of intracel­lular copper homeostasis is com­mon to transgenic mice expres­s­­ing human mutant superoxide dismutase-1s regardless of their copper-bind­­ing abilities. Neurobio­l Dis 2013; 54: 308– 319. doi: 10.1016/ j.nbd.2013.01.001.

29. Tokuda E, Okawa E, Ono SI et al. Dysregulation of intracel­lular copper traf­fick­­ing pathway in a mouse model of mutant copper/ zinc superoxide dismutase-linked familial amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem 2009; 111(1): 181– 191. doi: 10.1111/ j.1471-4159.2009.06310.x.

30. Wil­liams JR, Trias E, Beilby PR et al. Copper delivery to the CNS by CuATSM ef­fectively treats motor neuron dis­ease in SOD(G93A) mice co-expres­s­­ing the Copper-Chaperone-for-SOD. Neurobio­l Dis 2016; 89: 1– 9. doi: 10.1016/ j.nbd.2016.01.020.

31. Domzał T, Radzikowska B. Ceruloplasmin and copper in the serum of patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Neurol Neurochir Pol 1983; 17(3): 343– 346.

32. Gel­lein K, Gar­ruto RM, Syversen T et al. Concentrations of Cd, Co, Cu, Fe, Mn, Rb, V, and Zn in formalin-fixed brain tis­sue in amyotrophic lateral sclerosis and Parkinsonism-dementia complex of Guam determined by High-resolution ICP-MS. Biol Trace Elem Res 2003; 96(1– 3): 39– 60. doi: 10.1385/ BTER:96:1-3:39.

33. Hozumi I, Hasegawa T, Honda A et al. Patterns of levels of bio­logical metals in CSF dif­fer among neurodegenerative dis­eases. J Neurol Sci 2011; 303(1– 2): 95– 99. doi: 10.1016/ j.jns.2011.01.003.

34. Genoud S, Roberts BR, Gunn AP et al. Subcel­lular compartmentalisation of copper, iron, manganese, and zinc in the Parkinson’s dis­ease brain. Metal­lomics 2017; 9(10): 1447– 1455. doi: 10.1039/ c7mt00244k.

35. Mil­ler LM, Wang Q, Telivala TP et al. Synchrotron-based infrared and X-ray imag­­ing shows focalized accumulation of Cu and Zn co-localized with beta-amyloid deposits in Alzheimer’s dis­ease. J Struct Biol 2006; 155(1): 30– 37. doi: 10.1016/ j.jsb.2005.09.004.

36. Schrag M, Muel­ler C, Oyoyo U et al. Iron, zinc and copper in the Alzheimer’s dis­ease brain: a quantitative meta-analysis. Some insight on the influence of citation bias on scientific opinion. Prog Neurobio­l 2011; 94(3): 296– 306. doi: 10.1016/ j.pneurobio­.2011.05.001.

37. Hottinger AF, Fine EG, Gurney ME et al. The copper chelator D-penicil­lamine delays onset of dis­ease and extends survival in a transgenic mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci 1997; 9(7): 1548– 1551. doi: 10.1111/ j.1460-9568.1997.tb01511.x.

38. Andreas­sen OA, Dedeoglu A, Friedlich A et al. Ef­fects of an inhibitor of poly(ADP-ribose) polymerase, desmethylselegiline, trientine, and lipoic acid in transgenic ALS mice. Exp Neurol 2001; 168(2): 419– 424. doi: 10.1006/ exnr.2001.7633.

39. Tokuda E, Ono S, Ishige K et al. Am­monium tetrathiomolybdate delays onset, prolongs survival, and slows progres­sion of dis­ease in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol 2008; 213(1): 122– 128. doi: 10.1016/ j.expneurol.2008.05.011.

40. Ogra Y, Suzuki KT. Target­­ing of tetrathiomolybdate on the copper accumulat­­ing in the liver of LEC rats. J Inorg Biochem 1998; 70(1): 49– 55. doi: 10.1016/ S0162-0134(98)00012-9.

41. Hozumi I, Asanuma M, Yamada M et al. Metal­lothioneins and neurodegenerative dis­eases. J Health Sci 2004; 50(4): 323– 331. doi: 10.1248/ jhs.50.323.

42. Piotrowski JK, Trojanowska B, Sapota A. Bind­­ing of cadmium and mercury by metal­lothionein in the kidneys and liver of rats fol­low­­ing repeated administration. Arch Toxicol 1974; 32(4): 351– 360. doi: 10.1007/ BF00330118.

43. Richards MP. Recent developments in trace element metabolism and function: role of metal­lothionein in copper and zinc metabolism. J Nutr 1989; 119(7): 1062– 1070. doi: 10.1093/ jn/ 119.7.1062.

44. Murakami S, Miyazaki I, Sogawa N et al. Neuroprotective ef­fects of metal­lothionein against rotenone-induced myenteric neurodegeneration in parkinsonian mice. Neurotox Res 2014; 26(3): 285– 298. doi: 10.1007/ s12640-014-9480-1.

45. Scheiber IF, Dringen R. Astrocyte functions in the copper homeostasis of the brain. Neurochem Int 2013; 62(5): 556– 565. doi: 10.1016/ j.neuint.2012.08.017.

46. Nakamura S, Shimazawa M, Hara H. Physiological roles of metal­lothioneins in central nervous system dis­eases. Biol Pharm Bull 2018; 41(7): 1006– 1013. doi: 10.1248/ bpb.b17-00856.

47. Tokuda E, Watanabe S, Okawa E et al. Regulation of intracel­lular copper by induction of endogenous metal­lothioneins improves the dis­ease course in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurotherapeutics 2015; 12(2): 461– 476. doi: 10.1007/ s13311-015-0346-x.

48. Ono SI. Metal­lothionein is a potential therapeutic strategy for amyotrophic lateral sclerosis. Curr Pharm Des 2017; 23(33): 5001– 5009. doi: 10.2174/ 1381612823666170622105513.

49. Hashimoto K, Hayashi Y, Inuzuka T et al. Exercise induces metal­lothioneins in mouse spinal cord. Neuroscience 2009; 163(1): 244– 251. doi: 10.1016/ j.neuroscience.2009.05.067.

50. Eidizadeh A, Trendelenburg G. Focus­­ing on the protective ef­fects of metal­lothionein-I/ II in cerebral ischemia. Neural Regen Res 2016; 11(5): 721– 722. doi: 10.4103/ 1673-5374.182689.

51. Otevřel F, Smrčka M, Kuchtíčková Š et al. Korelace ptiO2 a apoptózy u fokální mozkové ischemie a vliv systémové hypertenze. Cesk Slov Neurol N 2007; 70/ 103(2): 168– 173.

52. Vieira FG, Hatzipetros T, Thompson K et al. CuATSM ef­ficacy is independently replicated in a SOD1 mouse model of ALS while unmetal­lated ATSM ther­apy fails to reveal benefits. IBRO Rep 2017; 2: 47– 53. doi: 10.1016/ j.ibror.2017.03.001.

53. Vāvere AL, Lewis JS. Cu-ATSM: a radiopharmaceutical for the PET imag­­ing of hypoxia. Dalton Trans 2007; (43): 4893– 4902. doi: 10.1039/ b705989b.

54. Far­rawell NE, Yerbury MR, Plotkin SS et al. CuATSM Protects against the in vitro cytotoxicity of wild-type-like copper-zinc superoxide dismutase mutants but not mutants that disrupt metal binding. ACS Chem Neurosci 2019; 10(3): 1555– 1564. doi: 10.1021/ acschemneuro.8b00527.

55. Roberts BR, Lim NK, McAl­lum EJ et al. Oral treatment with Cu(II)(atsm) increases mutant SOD1 in vivo but protects motor neurons and improves the phenotype of a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Neurosci 2014; 34(23): 8021– 8031. doi: 10.1523/ JNEUROSCI.4196-13.2014.

56. McAl­lum EJ, Lim NK, Hickey JL et al. Therapeutic ef­fects of CuII(atsm) in the SOD1-G37R mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener 2013; 14(7– 8): 586– 590. doi: 10.3109/ 21678421.2013.824000.

57. McAl­lum EJ, Roberts BR, Hickey JL et al. Zn II(atsm) is protective in amyotrophic lateral sclerosis model mice via a copper delivery mechanism. Neurobio­l Dis 2015; 81: 20– 24. doi: 10.1016/ j.nbd.2015.02.023.

58. Ermilova IP, Ermilov VB, Levy M et al. Protection by dietary zinc in ALS mutant G93A SOD transgenic mice. Neurosci Lett 2005; 379(1): 42– 46. doi: 10.1016/ j.neulet.2004.12.045.

59. Soon CP, Don­nel­ly PS, Turner BJ et al. Diacetylbis (N(4)-methylthiosemicarbazonato) copper(II) (CuII(atsm)) protects against peroxynitrite-induced nitrosative damage and prolongs survival in amyotrophic lateral sclerosis mouse model. J Biol Chem 2011; 286(51): 44035– 44044. doi: 10.1074/ jbc.M111.274407.

60. Štětkářová I, Matěj R, Ehler E. Nové poznatky v dia­gnostice a léčbě amyotrofické laterální sklerózy. Cesk Slov Neurol N 2018; 81(5): 546– 554. doi: 10.14735/  amcsn­n2018546.

Štítky
Detská neurológia Neurochirurgia Neurológia
Článek Editorial

Článok vyšiel v časopise

Česká a slovenská neurologie a neurochirurgie

Číslo 1

2020 Číslo 1
Najčítanejšie tento týždeň
Najčítanejšie v tomto čísle
Kurzy

Zvýšte si kvalifikáciu online z pohodlia domova

Aktuální možnosti diagnostiky a léčby litiáz
nový kurz
Autori: MUDr. Tomáš Ürge, PhD.

Všetky kurzy
Prihlásenie
Zabudnuté heslo

Zadajte e-mailovú adresu, s ktorou ste vytvárali účet. Budú Vám na ňu zasielané informácie k nastaveniu nového hesla.

Prihlásenie

Nemáte účet?  Registrujte sa

#ADS_BOTTOM_SCRIPTS#