Apoptóza - vybrané metody detekce apoptózya asociovaných regulačních faktorů natkáňových řezech z nádorového materiálu

K detekci apoptózy (AP) na tkáňových řezech lze využít morfologické hodnocení AP figur světelnouči elektronovou mikroskopií a imunohistochemický průkaz antigenů asociovaných s AP. Bcl-2u řady nádorů inverzně koreluje s AP a je nepřímým markerem počtu AP figur. Imunohistochemickýprůkaz je bezproblémový. Tkáňovou transglutaminázu, která je výrazně exprimovánai v neapoptotických buňkách, nelze považovat za specifický marker AP. Podobně FAS, jehož expresenemusí být bezpodmínečně spojena se vstupem buňky do AP. Kaspázy: v současnosti používanáimunohistochemická detekce nerozlišuje aktivní a neaktivní formy těchto enzymů. AnexinV: technika, detekující fosfatidylserin, normálně lokalizovaný na vnitřní straně buněčné membrány,jenž je při apoptotickém procesu detekovatelný i extracelulárně. Průkaz Anexinu V značenéhokoloidním zlatem lze využít k detekci AP imunoelektronovou mikroskopií, nicméně jde o velmináročnou metodiku. TUNEL, ISEL, ISNTA jsou metody, které označují zlomy DNA vznikající přiapoptóze. TUNEL ve srovnání s morfologickým hodnocením AP figur detekuje o cca 20 % apoptotickýchbuněk více. Označeny mohou být i fragmenty DNA vznikající v jádrech během reparace,po elektrokoagulaci, při autolýze, následkem fixace a řezání tkání. Apostain je metoda založenána průkazu jednovláknových zlomů DNA pomocí monoklonální protilátky, která využívá sníženoustabilitu apoptotické DNA vůči termální denaturaci způsobující její zlomy. Protilátka M30 Cyto-Death detekuje neoepitopy vzniklé při štěpení cytokeratinu 18 kaspázami. Ve srovnání s TUNELemchybí exprese v nekrotických buňkách, neoznačuje však buňky v pokročilých stadiích AP(tělíska). Na rozdíl od některých pilotních studií se nám u M30 (Roche) nepodařilo docílit dostatečnousenzitivitu ani specificitu při detekci AP na mamárních karcinomech. Rutinní, resp. automatizovanéhodnocení AP vyžaduje ověření a standardizaci dalších metodik.

Klíčová slova:
apoptóza - regulace - detekovat

Apoptosis - Selected Detection Methods of Apoptosis and AssociatedRegulatory Factors in Histologic Slides of Tumors

Methods for identification of apoptotic (AP) cells in tissue sections include light and electronmicroscopy and immunohistochemical (IHC) detection of apoptotic antigens. Bcl-2 at many tumorsinversely correlates with AP and is an indirect marker of AP index. Transglutaminase isoften expressed in nonapoptotic cells, and thus represents a non specific marker of AP. Likewise,expression of FAS does not necessarily represent a transformation into AP. IHC detection ofcaspases does not distinguish between active and nonactive forms of the proteases. Immunolabelingof biotin-conjugated Annexin V is used for the identification of phosphatidylserine residuesexposed on the surface of AP cells. Annexin V immuno-gold labeling by means of electron microscopywill allow a more refined description of the morphological events occurring during apoptosis.TUNEL, ISEL and ISNTA methods detect DNA breaks. The rate of AP detected by TUNEL isabout 20 % higher then by apoptotic figure counting. DNA strand breaks can also occur duringDNA repair, electrocoagulation, autolysis, fixation and paraffin embedding. With Apostain, DNA isselectively denaturated by heating with formamide and stained by monoclonal antibody specificto single-strand DNA. It specifically stains condensed chromatin of apoptotic cells. M30 IHC usesa monoclonal antibody binding to the product resulting from cleavage of cytokeratin 18 by activatedcaspases. M30 is negative in necrotic cells and in progressively degraded cells (AP bodies). Incontrast to some pilot studies, we have not reached sufficient sensitivity and specificity of IHCdetection with M30 (Roche) in breast carcinomas.

Key words:
apoptosis - regulation - detection

Autoři: Z. Pavlovský; V. Vagunda
Působiště autorů: Oddělení patologie, Masarykův onkologický ústav, Brno
Vyšlo v časopise: Čes.-slov. Patol., , 2003, No. 1, p. 6-10
Kategorie: Články