Průkaz chromozomálních změn u nádorových onemocnění pomocí CGH, array-CGH a SNP array

Súhrn

Nové molekulárně biologické metody umožnily zpřesnění průkazu chromozomálních změn v nádorové tkáni. Tyto změny lze prokázat u většiny maligních nádorů. Rychlý rozvoj celogenomových molekulárně biologických metod napomohl zlepšení poznání genetického pozadí nádorů. V současné době je jejich průkaz součástí diagnostických nebo prognostických schémat používaných u jednotlivých nádorových onemocnění. Jako první bylo v klinické praxi využíváno klasické cytogenetické vyšetření karyotypu, které je využíváno dodnes, i když s nástupem nových molekulárně biologických technik se jeho význam zmenšil. Metodami dnes nejčastěji používanými ke stanovení chromozomálních delecí nebo zmnožení při celogenomovém vyšetření jsou komparativní genomová hybridizace (CGH), array-CGH a SNP array. První dvě jsou založeny na principu porovnání nádorové DNA a normální, kontrolní DNA. Princip SNP array využívá přítomnosti jednonukleových polymorfismů rozložených po celém genomu u každého jedince. SNP array prokazuje nejen delece nebo zmnožení chromozómů, tak jak je tomu u CGH technik, ale je schopna prokázat i ztrátu heterozygozyty nebo unipaternální dizomii.

Vyšetření chromozomálních změn se dnes stává rutinním a v některých případech také nezbytným vyšetřením pro stanovené diagnózy a prognózy nádorového onemocnění a správného výběru onkologické terapie.

Klíčová slova:
cytogenetika – CGH – array-CGH – SNP array – genetická změna

Ve tkáni většiny nádorů je možné prokázat chromozomální změny, které vznikají primárně nebo sekundárně v důsledku genomové instability. Chromozomální abnormality, které se v nádorech prokazují, jsou jednak početní změny celých chromozómů (delece, nebo zmnožení chromozómů) nebo změny části chromozómu (zmnožení (amplifikace) a delece), takové změny označujeme jako segmentální. Druhou skupinou jsou strukturální chromozomální změny, mezi které řadíme translokace (balancované i nebalancované), inverze, inzerce a další. Mnohé z nich jsou nalézané opakovaně u stejného typu nádorových onemocnění a mohou tak napomoci při diagnostice těchto nádorů (např. t(11;22) u Ewingova sarkomu (1,2)). Jiné je možné využít jako biologický prognostický znak pro zařazení pacienta do příslušné prognostické skupiny a umožnit odpovídající způsob terapie (např. amplifikace MYCN onkogenu je významným negativním prognostickým znakem u neuroblastomu) (3).

První metodou, která byla k průkazu chromozomálních změn využívána, bylo klasické karyotypické vyšetření, které je využíváno dodnes, i když s nástupem nových molekulárně biologických technik se jeho význam zmenšil. Mezi takovéto nové techniky, které jsou používány k vyšetření celého genomu, řadíme komparativní genomovou hybridizaci (CGH), její variantu array-CGH a Single nucleotide polymorphism (SNP) array. Pomocí těchto technik jsme schopni prokázat delece, zmnožení a amplifikace na všech chromozómech při jednom vyšetření. Charakteristika jednotlivých vyšetření je shrnuta v tabulce 1.

KOMPARATIVNÍ GENOMOVÁ HYBRIDIZACE - CGH

Komparativní genomová hybridizace, byla poprvé popsána v roce 1992 Kallioniemi et al. (7). Jedná se o molekulárně cytogenetickou metodu, která umožňuje stanovení relativního počtu kopií (balance, zmnožení, delece) jednotlivých sekvencí DNA mezi dvěma genomy (DNA nádoru versus DNA zdravého jedince jako kontrolní). Hlavním přínosem je, že pro vyšetření není potřeba získat kvalitní mitózy, tak jak je tomu u klasického cytogenetického vyšetření, ale pouze 1 - 2 µg nádorové DNA. Metoda naopak vyžaduje, aby zastoupení nádorových buněk ve vzorku, ze kterého je DNA izolována, bylo aspoň 50 %. Zde je úloha patologa zcela nezastupitelná, protože vyšetřením vzorku, který má méně než 50 % nádorových buněk, získáme zkreslený nebo nepravdivý výsledek vyšetření. Kvalita vyšetření je také závislá na fixaci materiálu. Z tohoto pohledu je nejvhodnější materiál nativní, nebo zamražený. Vyšetření DNA z parafinových bloků jsou často nekvalitní a v některých případech nemožná i přesto, že jsou zaváděny nové izolační a recovery kity, které umožňují zlepšení výsledku těchto vyšetření.

Princip metody je založený na kvantitativním porovnání nádorové a kontrolní DNA. Po izolaci DNA je nádorová i kontrolní DNA fluorescenčně označena. V případě CGH je referenční DNA značená červeně a testovaný vzorek od pacienta zelenou barvou. Po obarvení jsou vzorky ve stejném množství smíchány a směs je nanesena na sklíčko s normálními metafázickými chromozómy získanými od zdravého dárce. Následuje hybridizace, při které kompetují jednotlivé značené úseky zdravé a nádorové DNA o párování se shodným místem na chromozómech přichycených na sklo. Chromozómy jsou dobarveny pomocí modrého fluorochromu DAPI (4‘,6‑diamidino‑2‑phenylindol), který na chromozómech vytváří pruhování, a umožňuje tak jejich karyotypování (8). Princip metody ukazuje obr. 1. Takto připravené mitózy jsou snímány pomocí černobílé kamery v jednotlivých fluorescenčních filtrech (FITC (zelená barva), rhodamin (červená barva), DAPI (modrá barva)). Po nasnímání do systému jsou mitózy počítačově zpracovány, je detekovaný kvantitativní poměr fluorescenčních intenzit jednotlivých chromozómu (viz obr. 1). Takto odhalíme místa s vyšší nebo nižší intenzitou červené a zelené barvy podél osy chromozómu, což odpovídá lokalizaci chromozómových oblastí se ziskem nebo ztrátou nádorové DNA. Pokud testovaný vzorek obsahuje nadbytečný materiál, objeví se silnější zelený signál v cílových oblastech chromozómů, naopak v případě ztráty genetického materiálu má signál v těchto oblastech intenzivnější červenou barvu (obr. 2A-C). Technikou CGH detekujeme pouze nebalancované přestavby v genomu, tj. zmnožení nebo ztráty, ale nedokážeme odhalit balancované chromozomální změny (translokace, inverze) (8). Dále není CGH nejvhodnější technikou pro hodnocení polyploidie, protože určuje pouze změny počtu kopií chromozómů, ale není schopna určit jejich absolutní počet. Například tetraploidní buněčná populace dává v genomu konstantní poměr a je nerozlišitelná od výsledku získaného z diploidní testované populace.

ARRAY-CGH

V druhé polovině devadesátých let Solinas-Toldo et al. (9) představili novou metodu CGH techniky probíhající na čipu, tzv. array-CGH. Tato metoda opět porovnává referenční genom proti genomu pacienta a identifikuje rozdíly. Princip array-CGH je velmi podobný CGH, referenční a zkoumaná DNA jsou fluorescenčně značeny a hybridizovány ke specifickým fragmentům normální DNA uchyceným na čipu (sklíčku) (10). Následuje přečtení hotového čipu na scanneru, softwarové zpracování a vyhodnocení. U array-CGH je opačné značení kontrolní a sledované DNA než u CGH (obr. 1.). Zásadní rozdíl je v citlivosti obou metod. Rozlišovací schopnost detekce chromozomálních alterací je u chromozomální CGH přibližně 5-10Mb (11,12). U array-CGH se velikost fragmentů pohybuje od desítek bází až po kilobáze.

Rozeznáváme několik typů čipů, jako jsou oligonukleotidové čipy nebo BAC čipy. U oligonukleotidových čipů jsou sekvence DNA nanášené na sklíčko velice krátké (25 – 85 bazí) (13), naproti tomu BAC čipy využívají DNA získanou z jednotlivých BAC (Bacterial Artificial Chromosome) což jsou plazmidy do kterých je možné vkládat a následně v E. coli namnožit specifickou lidskou DNA délky 150 – 200 kb.

Rozlišovací schopnost array-CGH závisí na dvou faktorech - na délce a množství nanášených fragmentů a na jejich skutečném zastoupení v rámci genomu (10). Rozlišovací schopnost stoupá se zvyšováním počtu co nejkratších fragmentů, a to tak, aby souvisle pokryly celý genom nebo sledovanou oblast. Právě proto je výhodnější používat čipy vytvořené metodou oligonukleotidů, jejich délka menší (13), a tím poskytuje přesnější výsledek, než je tomu u BAC čipů (viz obr. 1). Nevýhodou této metody, stejně jako při CGH, je nemožnost detekce balancovaných změn.

SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM (SNP) ARRAY

Zavedení SNP array znamenalo další pokrok v analýze genomických abnormalit u nádorových onemocnění. Jedná se o metodu s vysokým rozlišením, pomocí které jsme schopni prokazovat početní změny podobně jako u array-CGH, ale také ztrátu heterozygozity (LOH) a uniparentální dizomii. SNP tak poskytuje více informací při jednom vyšetření než aCGH a podle množství vyšetřovaných polymorfismů obdobnou nebo vyšší citlivost. (15). Metoda je založena na principu vyšetření jednonukleotidových polymorfismů SNP, které jsou nejčetnější genetickou variací genomu. O SNP mluvíme tehdy, pokud je nukleotid A, T, C nebo G rozdílný v jednotlivých alelách chromozómu. Například sekvence AAGCCTA a AAGCTTA se liší tím, že v jedné alele je C, ve druhé T. Tyto bodové mutace se přirozeně vyskytují v průběhu evoluce a jsou definovány přítomností minoritní alely minimálně v 1% případů sledované populace. V současné době bylo prokázáno přibližně 15 miliónů SNP rozložených po celém lidském genomu (16).

Metodika vyšetření je u jednotlivých systémů modifikována, u nás používáme SNP čipy firmy Illumina. Při tomto vyšetření je DNA (genomická DNA nebo DNA nádoru) nejdříve amplifikována, následně rozštěpena restrikčními enzymy a hybridizovana ke krátkým úsekům DNA přichyceným na sklíčko čipu. Tím je zajištěna specificita vyšetřovaného SNP. Následuje jednonukleotidová extenze značeným nukleotidem (obr. 3). Jednotlivé SNP spoty, které se podobně jako u aCGH barevně zvýrazní (červená, zelená, žlutá), jsou snímány pomocí skeneru a následně softwarově zpracovány (obr. 3). Výsledek vyšetření poskytne informaci o intenzitě SNP na základě intenzity fluorescence (obr. 4). Tak můžeme stanovit homozygotní, nebo heterozygotní deleci, případně duplikaci nebo amplifikaci genetického materiálu. Pomocí tohoto vyšetření je také možné určit, zda je vyšetřovaný vzorek pro daný SNP homozygot AA (obě alely mají v místě SNP stejný nukleotid), nebo BB, případně heterozygot AB (každá alela má v místě SNP jiný nukleotid). Pokud kombinujeme data o intenzitě a alelickém rozložení, jsme schopni prokazovat LOH i unipaternální dizomii (17).

PŘÍKLADY VYUŽITÍ CELOGENOMOVÝCH TECHNIK V DĚTSKÉ ONKOLOGII

Meduloblastom

Na základě klinických a biologických faktorů je nově meduloblastom rozčleněn do 4 podskupin (tabulka 2). První podskupina nese název podle signální dráhy WNT, která je u této skupiny změněna. Charakteristická je pro ni delece 6. chromozómu a mutace CTNNB1 genu. Jedná se především o pacienty dětského věku. Pacienti WNT skupiny mají dobrou prognózu. Druhou podskupinou je SSH odvozena od signální dráhy SHH (Sonic Hedgehog), která se vyznačuje zmnožením 3q, delecí na 9q, 10q a amplifikací GLI2 a MYCN onkogenů. Pacienti s diagnostikovaným SHH meduloblastomem jsou kojeneckého věku, nebo dospělí a mají průměrnou prognózu. Meduloblastom třetí skupiny nebo tzv. klasicky meduloblastom, je charakteristický zmnožením 7, 1q, 17q, 18q a delecí na 8, 11p, 5q, 10q,16q, inverzí 17q chromozómu a MYCC amplifikací. Typický je pro pacienty dětského věku a má velmi špatnou prognózu. Poslední skupinou jsou meduloblastomy čtvrté skupiny, které se vyznačují chromozomálními změnami, jako jsou zmnožení 7, 17q, 18q nebo delecí 11p, 8, X chromozómů, inverze 17q a také amplifikace CDK6 a MYCN onkogenů (18). Vyskytují se hlavně u dětských pacientů a z prognostického hlediska patří mezi středně závažné.

Neuroblastom

V roce 1997 Brodeur et al. (20) navrhli klinicko-genetickou klasifikaci neuroblastomu na základě retrospektivní analýzy. Podle tohoto schématu se pacienti dělí do tří rizikových skupin (obr. 5). Pokud se nádorová buňka vydá cestou mitotické dysfunkce, následkem které je porucha separace chromozómů, vznikají změny celých chromozómů. Delece nejčastěji prokazujeme u chromozómů 1, 3 a 11; naopak zmnožení je nejčastější u chromozómu 2, 7 a 17 (20). Tyto pacienty řadíme do skupiny s nízkým rizikem neuroblastomu. Pacienti nízkého rizika jsou buď pouze sledováni pomocí zobrazovacích metod v pravidelných intervalech po předešlé biopsii nádoru (část těchto nádorů sama zaniká apoptózou, nebo se změní na benigní formy nádorů), nebo jsou léčení chirurgicky radikálním odstraněním nádoru, nevyžadují však další onkologickou léčbu. Celkové přežití pacientů nízkého rizika neuroblastomu se blíží téměř 100 %. Pokud při vyšetření prokážeme kromě změn celých chromozómů i segmentální změny, jde o pacienty středního nebo vysokého rizika neuroblastomu. Mezi nejčastěji prokazované změny v této skupině patří delece 1p, 3p, 4p a 11q a zmnožení 1q, 2p, a především 17q (21,22). Zmnožení 17q je nejčastější změnou u neuroblastomu středního a vysokého rizika. Pacienti středního rizika jsou již léčeni pomocí chemoterapie a často jsou indikováni k chirurgickému výkonu. Pacienti vysokého rizika jsou z biologického hlediska charakterizováni amplifikací MYCN onkogenu. Tito pacienti jsou léčení pomocí chemoterapie, chirurgické léčby, megachemoterapie s autologní transplantací hematopoetických progenitorových buněk, radioterapie, bioterapie (23,24), a za použití specifických protilátek anti-GD2 (25). I přesto 60 – 70 % pacientů vysokého rizika zemře.

Kromě výše uvedených nádorů se celogenomové techniky využívá i u nádorů vaječníků (26), nádoru prsů (27), rektálního adenomu a karcinomu (28), nádorů prostaty (29), karcinomu plic (30), ale i u mnoha dalších nádorových onemocnění.

ZÁVĚR

Rychlý rozvoj celogenomových molekulárně biologických metod napomohl zlepšení poznání genetického pozadí nádorů. Tyto poznatky jsou stále častěji využívány v onkologii při průkazu genetických abnormalit, které mohou být spojeny s jednotlivými nádorovými onemocněními. Detekce specifických genetických změn je využívána ke zlepšení klasifikace nádorů nebo stanovení prognostických znaků daného nádorového onemocnění. V neposlední řadě pak mohou napomoci k určení nových terapeutických cílů využitelných při onkologické léčbě.

PODĚKOVÁNÍ

Práce byla podpořena MZ ČR – RVO, FN v Motole 00064203 a PRVOUK-P27/LF1/1

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Aleš Vícha, PhD.

Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol

V úvalu 84, Praha 5- Motol, 150 08

tel.: +420-224436470, 6494, fax: +420-224436417

e-mail: ales.vicha@lfmotol.cuni.cz, avicha@yahoo.com