HPV-asociované karcinómy hlavy a krku: Aktualizácia poznatkov a odporúčania pre prax

Súhrn

HPV-asociovaný skvamocelulárny karcinóm (SCC) orofaryngu predstavuje špecifickú klinicko-patologickú podskupinu nádorov hlavy a krku so signifikantne lepšou prognózou v porovnaní s HPV-negatívnymi SCC. Morfologicky sa väčšinou jedná o nekeratinizujúci SCC, signifikantá časť HPV-asociovaných SCC orofaryngu však má variantnú morfológiu. Dôkaz prítomnosti transkripčne aktívnej infekcie HPV v orofaryngeálnych SCC poskytuje nenahraditeľnú prognostickú informáciu, ktorá dokonca nahrádza formálny histopatologický grading. V prehľadovom článku prinášame sumár aktuálnych vedomostí o HPV-asociovanom SCC orofaryngu ako aj HPV-asociovaných SCC ostatných non-orofaryngeálnych oblastí. Diskutovaná je úloha HPV testovania v diagnostike metastáz SCC z neznámeho origa v oblasti hlavy a krku.

Kľúčové slová:
skvamocelulárny karcinóm – HPV – hlava a krk – orofaryngeálny karcinóm – nazofaryngeálny karcinóm – sinonazálny karcinóm

Ľudský papillomavírus (human papillomavirus, HPV) patrí medzi najdôležitejšie onkogénne vírusy u človeka. V súčasnosti je pomerne presne klasifikovaných približne 170 HPV typov, a je predpoklad, že počet nových typov, podtypov a variánt ďalej porastie vďaka využitiu nových techník molekulovej biológie (1,2). Perzistentná infekcia mukozálnnymi high-risk HPV typmi (HR-HPV) je príčinou vzniku väčšiny skvamocelulárnych karcinómov (SCC) a adenokarcinómov krčka maternice a veľkej časti karcinómov vulvy, pošvy, penisu a análnych karcinómov (3-5). Existujú čoraz presvedčivejšie dôkazy, že HPV sa spolu s UV žiarením podieľa aj na vzniku kožných malignít, aj keď úloha HPV (predovšetkým kožných β-HPV typov) pri vzniku pre-malígnych a malígnych lézií kože nie je úplne presne pochopená a je stále predmetom diskusií (6,7).

Na možnú úlohu HPV v etiopatogenéze karcinómov oblasti hlavy a krku po prvý krát poukázal Syrjänen a spol. v roku 1983 (8). Následne mnohé štúdie dokázali asociáciu medzi HPV a SCC hlavy a krku, najmä u orofaryngeálnych SCC (OP-SCC) (9-13). HPV-asociovaný OP-SCC  (HPV⁺ OP-SCC) je v súčasnosti považovaný za samostatnú klinickú jednotku. Tieto karcinómy sú charakterizované nižším vekom výskytu (< 60 rokov), asociáciou so sexuálnym správaním, často negatívnou fajčiarskou anamnézou a, čo je najdôležitejšie, signifikantne lepšou prognózou v porovnaní s HPV-negatívnymi OP-SCC a to napriek častým metastázam v lymfatických uzlinách a vyššiemu N štádiu (14-17). Okrem OP-SCC možno HPV detekovať aj v časti non-orofaryngeálnych SCC. Udávaný výskyt je však značne variabilný a je závislý od anatomickej lokalizácie, etnicity študovanej populácie a predovšetkým od metodiky použitej na detekciu HPV (18). Prognostický význam prítomnosti HPV v non-orofaryngeálnych SCC je však prinajmenšom sporný. V nasledujúcom prehľade prinášame aktuálne poznatky o HPV asociovaných SCC hlavy a krku s praktickými odporúčaniami pre prax.

HPV-ASOCIOVANÝ SKVAMOCELULÁRNY KARCINÓM OROFARYNGU

Orofarynx je časť hltana, ktorá je ohraničená rovinou hornej plochy mäkkého podnebia a hornou plochou os hyoideum, respektíve spodinou vallecula epiglottica. SCC orofaryngu zahŕňa nádory, ktoré sú lokalizované na (i) na zadnej tretine (koreni) jazyka a na vallecula epiglottica; (ii) podnebných mandliach, fossa tonsillaris a sliznici podnebných oblúkov; (iii) spodnej strane mäkkého podnebia, vrátane uvuly a (iv) na zadnej stene orofaryngu (19).

Prevalencia HPV⁺ OP-SCC je relatívne vysoká predovšetkým na koreni jazyka (jazyková mandľa) a podnebných mandliach, v porovnaní s ostatnými časťami orofaryngu (12,13). Podľa prác zo Spojených štátov je  s HPV asociovaných až ~ 70 - 80 % OP-SCC (10,20,21). Prevalencia HPV⁺ OP-SCC v Európe je vo všeobecnosti nižšia (v rozmedzí 3 % - 79 %) (22,23), pričom výrazne závisí od študovanej populácie, časového obdobia štúdie a úspešnosti implementácie programov na zníženie fajčenia v konkrétnej krajine (všeobecne vyšší podiel HPV⁺ OP-SCC v krajinách s klesajúcim počtom fajčiarov). Aj v populáciách, kde je stále výrazný podiel fajčiarov je však zaznamenaný signifikantný nárast HPV⁺ OP-SCC (11,24). Metaanalýzou štúdií týkajúcich sa európskych krajín (roky 2002-2012) bola zistená celková prevalencia HPV v karcinómoch hlavy a krku na úrovni 40%, pričom najvyššia prevalencia bola zistená v karcinómoch tonzily a bázy jazyka (66,4% a 47,2%) (13).

V českej a slovenskej populácii sú za hlavné rizikové faktory OP-SCC tradične považované fajčenie a konzumácia alkoholu. Dáta o prevalencii HPV v OP-SCC v českej populácii sú limitované malým počtom vyšetrených pacientov, naznačujú však možnosť signifikanej úlohy HPV v patogenéze OP-SCC. Klozar a spol. dokázali prítomnosť HPV v 50 zo 71 (70%) OP-SCC, pričom najvyšší výskyt HPV bol dokázaný v karcinómoch tonzily (41/51 prípadov; 80%) a bázy jazyka (5/10 prípadov; 50%) (25). V ďalšej českej štúdii Laco a spol. dokázali prítomnosť HPV pomocou DNA in situ hybridizácie v 21 z 22 OP-SCC (26). Podľa našich vedomostí, podobná štúdia týkajúca sa slovenských pacientov nebola doteraz publikovaná.

Morfológia typického HPV-asociovaného orofaryngeálneho skvamocelulárneho karcinómu

V drvivej väčšine prípadov HPV⁺ OP-SCC morfologicky rekapituluje morfológiu epitelu tonzilárnych krýpt, teda miesta, kde tieto karcinómy najčastejšie vznikajú. HPV⁺ OP-SCC má typický „bazaloidný“ vzhľad nekeratinizujúceho SCC (NKSCC), charakterizovaný bunkami oválneho až vretenitého tvaru s vysokým nukleocytoplazmatickým pomerom, syncyciálnym spôsobom rastu, bez identifikovateľných intercelulárnych mostíkov (obr. 1). Častá je centrálna nekróza, niekedy až cystická degenerácia. Cytoplazmatická alebo extracelulárna keratinizácia chýba alebo ju možno zastihnúť iba v malom rozsahu (<10% buniek). V prípade, že je keratinizácia extenzívnejšia (>10% plochy tumoru), možno takýto tumor klasifikovať ako nekeratinizujúci SCC s maturáciou, alebo ako hybridný SCC (obr. 2) (27). Kolonizácia povrchového epitelu tonzily je sekundárny fenomén, prechod medzi karcinómom a normálnym epitelom je abruptný, bez prechodov alebo jednoznačnej prekurzorovej intraepitelovej in situ lézie. Karcinóm často invaduje v podobe hniezd s „pushing“ okrajmi, s nejasnou hranicou medzi epitelom a strómou, ktorá je často prekrytá lymfocytmi. Dezmoplastická reakcia na inváziu je často minimálna, alebo úplne chýba. Preto je takmer nemožné spoľahlivo posúdiť moment, kedy je už karcinóm invazívny. Tonzilárny epitel navyše nemá kontinuálnu bazálnu membránu, ktorú by malígne bunky museli prerušiť a je dobre známe, že aj veľmi malé a klinicky okultné karcinómy, veľké často iba niekoľko milimetrov, ktoré sa histologicky javia ako „in situ“, môžu mať uzlinové metastázy. Pre vyššie uvedené skutočnosti sa v praxi nedoporučuje tieto lézie diagnostikovať ako in situ lézie, ale vždy ako karcinóm (28,29).

Grading a staging HPV-asociovaného orofaryngeálneho skvamocelulárneho karcinómu

Grade nádoru je semikvantitatívne vyjadrenie stupňa diferenciácie, t.j. ako sa tumor podobá na normálne tkanivo, z ktorého vzniká. Podľa klasických kritérií používaných na grading keratinizujúcich SCC (podľa Brodersa), je väčšina HPV⁺ OP-SCC klasifikovaná ako nízko diferencovaný/nediferencovaný SCC, keďže sa vôbec nepodobajú na povrchový skvamózny epitel. Pretože však väčšina HPV-asociovaných OP-SCC vzniká v morfologicky odlišnom epiteli tonzilárnych krýpt, ktorého morfológiu HPV⁺ OP-SCC väčšinou rekapituluje, nekeratinizujúci HPV⁺ OP-SCC môže byť považovaný za dobre diferencovaný tumor (28). Informácia o „nízkom stupni diferenciácie“ podľa tradičného gradingu je navyše v rozpore s klinickým správaním väčšiny týchto nádorov. Preto viacerí autori doporučujú nevykonávať formálny grading nekeratinizujúceho HPV⁺ OP-SCC, ale ani ďalších podtypov HPV⁺ OP-SCC, keďže prítomnosť HPV až na malé výnimky signifikantne zlepšuje prognózu aj inak klinicky agresívnych podtypov SCC (viď nižšie) (28,29). Keďže je HPV⁺ OP-SCC asociovaný s dobrou prognózou, v súčasnosti prebieha množstvo štúdií, ktoré týmto pacientom ponúkajú deintezifikovanú terapiu s cieľom znížiť výskyt postterapeutických komplikácií, ktoré sú asociované s tradičnou kombinovanou chemoradioterapiou. Na druhej strane je dôležité identifikovať pacientov s vysokým rizikom, u ktorých by deintenzifikovaná liečba bola nedostatočná. Je napríklad známe, že fajčenie znižuje prognostický význam HPV pozitivity OP-SCC (30,31), spoľahlivé biomarkery agresivity HPV⁺ OP-SCC však v súčasnosti nie sú známe. Podľa zatiaľ jedinej štúdie prítomnosť anaplázie (≥ 3 jadrá nádorových buniek s priemerom ≥ 5 jadier lymfocytov, t.j. ~ 25 µm, v ktoromkoľvek zornom poli x40) alebo mnohojadrových nádorových buniek (≥ 3 nádorové bunky s viacerými jadrami v ktoromkoľvek zornom poli x40) bola asociovaná s horším prežívaním, nezávisle od ostatných faktorov, vrátane prítomnosti HPV (32). Podobne zatiaľ iba v experimentálnej rovine zostáva pokus o identifikáciu klinicky agresívnej podskupiny HPV⁺ OP-SCC pomocou kvantitatívnej morfometrie digitálnych obrazov (33). Alternatívou pre stratifikáciu rizika a výber vhodnej terapie by mohla v budúcnosti byť molekulárna subklasifikácia OP-SCC (34).

Aktuálne platný TNM systém pre orofaryngeálny karcinóm bol odvodený z výsledkov liečby OP-SCC asociovaného s fajčením a bez asociácie s HPV. Existujú čoraz presvedčivejšie dôkazy, že tento stagingový systém je nevhodný na spoľahlivé predpovedanie prognózy HPV⁺ OP-SCC (35). Nedávno bol navrhnutý nový/aktualizovaný TNM systém, špecifický pre HPV⁺ OP-SCC, ktorý okrem anatomických faktorov zohľadňuje aj neanatomické faktory (vek a fajčenie) a omnoho spoľahlivejšie predpovedá prognózu (35). Je pravedpodobné, že HPV-asociovaný a HPV-negatívny orofaryngeálny karcinóm budú mať v budúcnosti samostatný TNM staging systém. 

Morfologické varianty HPV-asociovaného orofaryngeálneho skvamocelulárneho karcinómu

Menej často má HPV⁺ OP-SCC inú morfológiu ako NKSCC/hybridný SCC. Varianty HPV⁺ OP-SCC zahŕňajú keratinizujúci, papilárny, bazaloidný, adenoskvamózny, lymfoepiteliálny, vretenobunkový (sarkomatoidný) a malobunkový karcinóm (36).

Keratinizujúci skvamocelulárny karcinóm (KSCC) je kompletne tvorený vyzrievajúcimi skvamóznymi bunkami bez prítomnosti nekeratinizujúcich oblastí (obr. 3). Aj keď drvivá väčšina KSCC orofaryngu nie je asociovaná s HPV, v malej časti prípadov možno dokázať prítomnosť transkripčne aktívnej HPV infekcie (37). V doposiaľ najväčšej štúdii KSCC orofaryngu, sedem z 54 prípadov difúzne exprimovalo proteín p16. HPV E6/E7 RNA bola dokázaná v piatich zo šiestich vyšetrených p16-pozitívnych prípadov, ale iba v jedinom p16-negatívnom prípade. Aj keď išlo iba o malý súbor pacientov, expresia p16 v KSCC bola asociovaná so signifikantne lepšou prognózou (37).

Papilárny skvamocelulárny karcinóm (PSCC) je charakterizovaný exofytickým papilárnym spôsobom rastu a excelentnou prognózou, najmä ak nie je prítomná invazívna komponenta SCC (obr. 4). Väčšina HPV⁺ PSCC je lokalizovaná v orofaryngu, laryngu alebo sinonazálnom trakte, raritne v ústnej dutine alebo hypofaryngu (38-40). Nádorové bunky majú v typickom prípade imatúrny „bazaloidný“ vzhľad NKSCC, vzácne vykazujú rôzny stupeň keratinizácie (38-40). Vo všeobecnosti je PSCC oblasti hlavy a krku asociovaný s dobrou prognózou a nie je isté, či prítomnosť HPV signifikantne mení prognózu, aj keď jedna štúdia dokázala trend k lepšiemu prežívaniu v HPV⁺ prípadoch (40).

NKSCC je často zamieňaný za bazaloidný skvamocelulárny karcinóm (BSCC). Aj keď sa BSCC čiastočne podobá na NKSCC, predstavuje samostatnú klinicky agresívnu high grade variantu SCC oblasti hlavy a krku. Najčastejšie sa BSCC vyskytuje v laryngu a hypofaryngu, v orofaryngu je vzácny. BSCC je charakterizovaný solídnym alebo lobulárnym („jigsaw puzzle“) spôsobom rastu, niekedy s periférnym palisádovaním buniek, abruptnými fókusmi keratinizácie alebo prítomnosťou ťažkej dysplázie povrchového epitelu, častým výskytom komedo-nekróz, malých cystických priestorov s materiálom pozitívnym vo farbení PAS alebo Alciánovou modrou a prítomnosťou stromálnej hyalinizácie alebo myxoidného bazofilného materiálu, pripomínajúceho mucín. Nádorové bunky nie sú na rozdiel od NKSCC pretiahnutého až vretenitého tvaru ale sú prevažne okrúhle, s hyperchrómnymi jadrami (obr. 5) (28,29). Väčšina (~ 75%) orofaryngeálnych BSCC je HPV-pozítívnych a v porovnaní s HPV negatívnymi BSCC orofaryngu ako aj BSCC iných oblastí, ktoré sú iba vzácne HPV-pozitívne, majú signifikantne lepšiu prognózu (41,42).

Adenoskvamózny karcinóm (AdSC) je vzácny a vo všeobecnosti agresívny podtyp SCC, charakterizovaný bifázickou proliferáciou keratinizujúceho SCC a adenokarcinómu, pričom jednotlivé zložky sú morfologicky oddelené, nie premiešané, bez prítomnosti intermediárnych buniek (na rozdiel od mukoepidermoidného karcinómu). Je častejší v laryngu a ústnej dutine ako v orofaryngu (43,44). Komponenta SCC je v podobe in situ karcinómu alebo invazívneho SCC, zložka adenokarcinómu býva prítomná v hlbších častiach tumoru a je charakterizovaná tubulárnou/duktálnou diferenciáciou, typicky s intra- alebo extracelulárnou produkciou mucínu (43). V jednej z najväčších publikovaných sérií, Masad a spol. vyšetrili prítomnosť HPV v 18 prípadoch AdSC oblasti hlavy a krku (16 AdSC laryngu a hypofaryngu, 4 ústnej dutiny, 3 orofaryngu a 3 sinonazálne AdSC) (43). Prítomnosť replikačne aktívnej HPV infekcie dokázali v dvoch orofaryngeálnych a jednom AdSC z nosovej dutiny. Obaja pacienti  s orofaryngeálnym HPV⁺ AdSC boli nažive a bez známok ochorenia 103 a 24 mesiacov od stanovenia diagnózy. Tieto dáta sú značne limitované nízkym počtom pacientov, naznačujú však lepšiu prognózu orofaryngeálnych HPV⁺ AdSC.

Radkay-Gonzales a spol. nedávno popísali zvláštny podtyp HPV-asociovaného adenoskvamózneho karcinómu s riasinkovými bunkami (45). Išlo o sedem prípadov morfologicky unikátneho tumoru (4 orofaryngeálne, 3 s neznámym origom v oblasti hlavy a krku), ktoré sa líšili od klasického AdSC prítomnosťou zložky blandne vyzerajúceho prevažne nekeratinizujúceho SCC s mikrocystickým/kribriformným usporiadaním, premiešaného s bunkami produkujúcimi mucín (pripomínajúc tak mukoepidermoidný karcinóm) (obr. 6A), alebo s prítomnosťou tubuloglandulárnych formácií s luminálnymi kolumnárnymi bunkami bez mucínprodukcie a abluminálnymi nekeratinizujúcimi skvamóznami elementami. Vo všetkých prípadoch boli minoritne v glandulárnej komponente prítomné bunky s riasinkami (obr. 6B) (45). Všetky prípady mali multilokulárne alebo makrocystické metastázy v lymfatických uzlinách. Na základe malého počtu pacientov nemožno zo štúdie vyvodiť definitívne závery týkajúce sa prognózy tohoto podtypu AdSC, ale zdá sa, že HPV⁺ AdSC s riasinkami môže mať relatívne dobrú prognózu, keďže ochoreniu podľahol jediný pacient s metastázami v pľúcach.

Nediferencovaný (lymfoepiteliálny) karcinóm (LELC) orofaryngu je vzácny tumor, morfologicky podobný nekeratinizujúcemu nediferencovanému nazofaryngeálnemu karcinómomu (NPCa). Je charakterizovaný bunkami s vezikulárnymi jadrami s nápadnými jadierkami a objemnou cytoplazmou s nejasnými kontúrami, syncyciálnym spôsobom rastu v pruhoch, menších solídnych hniezdach alebo po jednotlivých bunkách a zápalovým pozadím tvoreným lymfocytmi a plazmatickými bunkami (36,48). Dôležitú úlohu v patogenéze NPCa hrá Epstein-Barrovej vírus (EBV), najmä v endemických oblastiach a NPCa nekeratinizujúceho typu (47-49). Na rozdiel od NPCa, LELC orofaryngu sú konzistentne EBV-negatívne a ~ 90 % je asociovaných s infekciou HPV (50,51). Napriek „nediferencovanému“ vzhľadu sa zdá, že HPV⁺ LELC orofaryngu majú dobrú prognózu, porovnateľnú s inými HPV⁺ OPSCC.

Vretenobunkový (sarkomatoidný) skvamocelulárny karcinóm (SSCC) je vzácna varianta SCC, charakterizovaná bifázickou  proliferáciou konvenčného SCC a vretenobunkovej komponenty, ktorá na jednom konci spektra môže pripomínať reaktívnu fibroblastickú proliferáciu alebo, na opačnom konci spektra, môže imitovať naozajstný sarkóm (28,36). V prípade, že je zastúpená iba vretenobunková zložka (až 1/3 prípadov), ktorá navyše pomerne často stráca expresiu keratínov, môže byť odlíšenie SSCC od benígnych a malígnych mezenchymálnych lézií problematické (52). Bishop a spol. zistili prítomnosť HPV16 v troch z desiatich orofaryngeálnych SSCC. Žiaden z 27 non-orofaryngeálnych SSCC nebol HPV-pozitívny (52). Naopak, Watson a spol. nedokázali prítomnosť HPV ani v jednom z piatich orofaryngeálnych SSCC a zistili prítomnosť HPV v jednom z dvanástich SSCC dutiny ústnej a jednom prípade z hypofaryngu/laryngu (53). Na základe malého počtu HPV⁺ SSCC orofaryngu sa nemožno vyjadriť k prognóze tejto varianty. Vo všeobecnosti má však SSCC oblasti hlavy a krku prognózu podobnú konvenčnému SCC. Keďže je však infekcia HPV viazaná na epitelové bunky, dôkaz prítomnosti HPV (je prítomný v konvenčnej ako aj vretenobunkovej zložke SSCC) môže slúžiť ako diagnostická pomôcka pri odlišovaní SSCC od mezenchymálnych lézií orofaryngu (52,53).

Malobunkový karcinóm orofaryngu je extrémne vzácny tumor, morfologicky identický s malobunkovými karcinómami iných lokalít (t.j. ide o nízko diferencovaný neuroendokrinný karcinóm). Bishop a Westra zistili prítomnosť HPV v piatich z deviatich prípadov, pričom v štyroch prípadoch mal karcinóm prítomnú zložku konvenčného HPV⁺ nekeratinizujúceho karcinómu (54). Kraft a spol. popísali osem prípadov malobunkového karcinómu orofaryngu, z ktorých bolo sedem HPV-pozitívnych; jeden prípad mal zachytenú zložku konvenčného skvamocelulárneho karcinómu a jeden prípad zložku stredne diferencovaného neuroendokrinného karcinómu (55). Klinicky sa jednalo o agresívne tumory, často so vzdialenými metastázami v čase prezentácie. HPV⁺ malobunkový karcinóm orofaryngu sa teda prognosticky nelíši od malobunkového karcinómu v typickejších lokalitách. Rozpoznanie malobunkovej zložky je preto dôležité, aj keď z hľadiska morfológie nie vždy jednoduché. Imunohistochemicky malobunková komponenta vždy vykazuje pozitivitu neuroendokrinných markerov (synaptofyzín, chromogranín) a stratu markerov skvamóznej diferenciácie (CK5/6, p63) (28).    

HPV V NON-OROFARYNGEÁLNYCH KARCINÓMOCH HLAVY A KRKU

Aj keď sa HPV⁺ SCC vyskytujú aj v iných podoblastiach hlavy a krku mimo orofaryngu, skutočná incidencia non-orofaryngeálnych HPV-asociovaných SCC je pravdepodobne nadhodnotená (28). Podľa nedávno publikovaného prehľadu literatúry (18) bola publikovaná prevalencia detekcie HPV v karcinómoch ústnej dutiny 20 %, v karcinómoch laryngu 24 %, v karcinómoch sinonazálneho traktu 30 %, v nazofaryngeálnych karcinómoch 31 % a v kontrolách od zdravých jedincov 7 %, pričom jednotlivé publikácie udávali hodnoty v rozmedzí 0 - 100 %. Za nadhodnotenie úlohy HPV v non-orofaryngeálnych SCC je pravdepodobne zodpovedných viacero faktorov. Napríklad, HPV-asociovaný nazofaryngeálny karcinóm v niektorých prípadoch predstavuje iba šírenie HPV⁺ SCC z orofaryngu (56). Na druhej strane, počet HPV-asociovaných non-orofaryngeálnych SCC nadhodnocuje použitie vysoko citlivých PCR metód, ktoré nie sú schopné odlíšiť biologicky relevantnú HPV infekciu od inaktívnej infekcie alebo kontaminácie vzorky. Pri použití špecifickejších metód, ktoré detekujú iba transkripčne aktívnu infekciu HPV (viď nižšie) a po vylúčení nádorov, ktoré infiltrujú viaceré anatomické oblasti je skutočné zastúpenie HPV⁺ SCC v oblasti ústnej dutiny, hypofaryngu a laryngu na úrovni 0% až 5,9% (55-58), v oblasti sinonazálneho traktu ~ 20% (56,59-64) a v oblasti nazofaryngu 5-30% (66-69). V retrospektívnej štúdii 62 slovenských a českých pacientov s nazofaryngeálnym karcinómom (NPCa) sme dokázali prítomnosť HPV iba u jedinej pacientky (70). Zdá sa teda, že v našej populácii HPV nehrá signifikantnú úlohu v patogenéze NPCa, aj keď je počet vyšetrených pacientov limitovaný. Naopak, až v 86% prípadov (53/62) sme dokázali prítomnosť EBV. Metaanalýzou štúdií, ktoré súčasne zisťovali prítomnosť HPV ako aj EBV v NPCa u pacientov kaukazkej rasy sme zistili, že zastúpenie HPV⁺ NPCa je ~ 36 % (ak bol HPV detekovaný pomocou PCR), respektíve ~ 32 % (HPV detekovaný pomocou p16/in situ hybridizácie), kým prevalencia EBV pozitivity je ~42 %. Naša populácia pacientov s NPCa sa teda z hľadiska zastúpenia HPV a EBV viac podobá populáciám v endemických oblastiach (70).

Na záver možno skonštatovať, že na rozdiel od OP-SCC, prítomnosť HPV v non-orofaryngeálnych SCC hlavy a krku je relatívne obmedzená a vo všeobecnosti nie je asociovaná s lepšou prognózou, aj keď sú dáta značne limitované a budú potrebné ďalšie štúdie (18,70,71). Jedinou výnimkou môžu byť HPV⁺ karcinómy sinonazálneho traktu. Podľa dvoch štúdií (63,64) by mohla byť prítomnosť transkripčne aktívnej infekcie HPV v sinonazálnych karcinómoch asociovaná s lepšou prognózou, aj keď je tento záver značne limitovaný nízkym počtom pacientov, veľkou heterogenitou histologických podtypov a rozličnými metódami použitými na liečbu pacientov. Rutínne testovanie non-orofaryngeálnych SCC hlavy a krku na prítomnosť HPV v súčasnosti nie je doporučované.

DIAGNOSTICKÁ APLIKÁCIA HPV TESTOVANIA – METASTÁZY Z NEZNÁMEHO ORIGA

Veľkú časť malignít oblasti hlavy a krku tvoria metastázy v lymfatických uzlinách z neznámého origa. Predstavujú 3 - 9 % všetkých malignít tejto oblasti (69-71) a vo väčšine prípadov (53 - 90 %) sa histologicky jedná o SCC (72,73,75). Väčšina cervikálnych metastáz je solídnych, SCC Waldayerovho prstenca však často vytvárajú objemné cystické metastázy, ktoré klinicky, radiologicky a dokonca aj histomorfologicky môžu napodobovať branchiogénnu (lymfoepiteliálnu) cystu. Podľa dvoch veľkých štúdií boli cystické metastázy karcinómov z oblasti Waldayerovho prstenca identifikované v 20 % a 61,3 % prípadov (76,77). Z opačného pohľadu, vo väčšine prípadov cystických metastáz SCC je identifikované origo v orofyryngu, najmä v podnebnej mandli a na koreni jazyka (76-82). Je známe, že HPV⁺ OP-SCC si v metastázach zachováva prítomnosť transkripčne aktívnej infekcie HPV, ako aj overexpresiu proteínu p16 (76,83-85) a mnohé štúdie dokázali, že prítomnosť HPV v p16-pozitívnej solídnej alebo cystickej metastáze s vysokou pravdepodobnosťou predpovedá origo v orofaryngu (85-89).

Tu je nutné zdôrazniť, že nie všetky cystické metastázy v oblasti hlavy a krku majú origo v orofaryngu (77,81). Vzácne môžu cystické metastázy vytvoriť karcinómy nazofaryngu, hypofaryngu, laryngu, ústnej dutiny, prínosových dutín alebo pažeráka (80-82,90). V retrospektívnej štúdii cystických metastáz SCC s neznámym origom z plzeňského registra až 30 % (6/20) pochádzalo z non-orofaryngeálnej oblasti, pričom v troch prípadoch sa jednalo o metastázu EBV-asociovaného nazofaryngeálneho karcinómu. Pridanie testu na prítomnosť EBV (EBV in situ hybridizácia) v p16/HPV-negatívnych prípadoch môže v časti prípadov odhaliť nazofaryngeálne origo a ušetriť pacientov od zbytočných diagnostických procedúr (napr. diagnostická bilaterálna tonzilektómia) (obr. 7) (91).

Ako náhradný marker HR-HPV infekcie v cervikálnych ako aj orofaryngeálnych karcinómoch je často používaná imunohistochemická detekcia proteínu p16 (92,93). Aj keď má expresia p16 takmer 100% senzitivitu pre detekciu HR-HPV v OP-SCC, špecificita je iba na úrovni ~ 80% (tj. cca 20% p16-pozitívnych OPSCC je HPV negatívnych) (94). Napriek tomu, že konkordancia medzi expresiou p16 a prítomnosťou HR-HPV nie je dokonalá, imunohistochemické vyšetrenie expresie p16 niektorí autori navrhujú ako samostatný a jediný test na detekciu HR-HPV a klinickú stratifikáciu OP-SCC (21,95). Senzitivita a špecificita samotného imunohistochemického vyšetrenia p16 v prípade metastáz z neznámého origa však nie je známa. Pri diagnostike metastáz z neznámého origa je nutné pamätať na skutočnosť, že overexpresia p16 bola popísaná okrem HPV⁺ OP-SCC aj v iných benígnych a malígnych léziách, ktoré môžu byť v diferenciálnej diagnóze. Cao a spol. popísali pozitivitu p16 v 43% (16/37) benígnych lymfoepiteliálnych cýst, ako aj v 5/12 cytologických vzoriek z týchto cýst. Žiadna z týchto lézií však nebola HPV-pozitívna (95). V zhode s vyššie uvedenou prácou, sme fokálnu imunohistochemickú pozitivitu p16 dokázali v 9 z 11 (81,8 %) prípadov benígnych lymfoepiteliálnych cýst (2015, nepublikované dáta). Na rozdiel od HPV⁺ metastáz OP-SCC, ktoré majú difúznu expresiu p16 (> 70 %, viď nižšie), expresia p16 v benígnych cystách nikdy nebola prítomná vo viac ako 50 % buniek. Expresia p16 je ďalej bežná v pľúcnych malobunkových karcinómoch (97), ktoré však nebývajú HPV-pozitívne (98) ako aj orofaryngeálnych malobunkových karcinómoch, ktoré sú ale takmer vždy HPV-pozitívne (viď vyššie) (54,55). Difúzna a silná pozitivita p16 bez asociácie s HPV bola zistená v piatich prípadoch sinonazálneho nediferencovaného karcinómu (99). Signifikantná pozitivita p16 (> 50 % nádorových buniek) bola popísaná v 6/20 ezofageálnych SCC, 7/20 pľúcnych SCC a 8/20 SCC kože, pričom HR-HPV bol detekovaný iba v jedinom ezofageálnom prípade (100). Podobne, časť uroteliálnych karcinómov a uroteliálnych karcinómov so skvamóznou diferenciáciou vykazuje p16-pozitivitu bez asociácie s HR-HPV (101).

Pretože je špecificita p16-pozitivity vo vzťahu k diagnostike HPV-pozitívnych nádorov relatívne nízka, na podporenie klinicky najpravdepodobnejšieho orofaryngeálneho origa p16-pozitívnej metastázy SCC z neznámeho origa je vždy nutné vykonať špecifický dôkaz prítomnosti HPV. Ako bolo diskutované vyššie, HPV-pozitívne SCC sa vzácne vyskytujú aj v iných podoblastiach hlavy a krku, najpravdepodobnejšie origo p16/HPV⁺ metastázy je však v klinicky okultnom karcinóme orofaryngu.

METÓDY DETEKCIE RELEVANTNEJ (TRANSKRIPČNE AKTÍVNEJ) INFEKCIE HPV

HPV status v OP-SCC poskytuje dôležitú prognostickú informáciu a je pravdepodobné, že v blízkej budúcnosti bude rozhodovať aj o spôsobe liečby, napr. o použití deintezifikovanej chemo/radioterapie. HPV testovanie OP-SCC je v súčasnosti nevyhnutnou podmienkou pre zaradenie pacientov do klinických štúdií. HPV-pozitivita v metastázach z neznámého origa navyše umožňuje zacielenie  diagnostických a chirurgických postupov na oblasť orofaryngu a vo vybraných prípadoch umožňuje obmedziť ožarovanie iba na túto oblasť aj v prípade, že sa primárne ložisko nenájde. Ide o vyšetrenie, ktoré je zahrnuté vo viacerých významných klinických a patologických odporúčaniach (napr. College of American pathologists, the Royal college of pathologists, NCCN guidelines). Napriek zjavnému významu a dôležitosti HPV testovania, neexistuje všeobecný konsenzus akú stratégiu a ktoré z viacerých dostupných metód na dôkaz HPV treba použiť (102,103). Výber metodiky by mal vychádzať zo zistení, že klinicky dobrá prognóza HPV⁺ OP-SCC je limitovaná iba na nádory s transkripčne aktívnou HPV infekciou (102,103). Ideálny test by mal mať vysokú senzitivitu a špecificitu, primeranú cenu a mal by byť dostatočne jednoduchý na rutínne použitie.

V HPV⁺ karcinómoch vírusové onkoproteíny E6 a E7 HR-HPV typov funkčne inaktivujú proteín p53 a pRb (retinoblastoma protein), čo následne vedie k overexpresii tumor supresorového proteínu p16. Niektorí autori preto navrhujú použiť na detekciu HR-HPV a klinickú stratifikáciu OP-SCC samotné imunohistochemické vyšetrenie expresie proteínu p16, ktoré je najlacnejšou a najdostupnejšou alternatívou (21,95). Najlepšia korelácia expresie p16 a prítomnosti HPV v OP-SCC (neplatí to pre NOP-SCC) je v prípade ak sa za pozitívny výsledok považuje jadrová a cytoplazmatická expresia ≥ 70 % nádorových buniek (94). Samotná imunohistochemická expresia p16 však môže byť považovaná za zástupný „surrogate“ marker aktívnej HPV infekcie iba v prípade, ak má karcinóm charakteristickú morfológiu, t.j. ide o NKSCC alebo hybridný SCC. V prípade, že sa jedná o p16-pozitívny karcinóm s variantnou morfológiou (viď vyššie) alebo v prípade imunohistochemickej negativity v nekeratinizujúcom OP-SCC, je nutné doplniť HPV špecifický test. 

Za „zlatý štandard“ dôkazu biologicky aktívnej infekcie je považovaný dôkaz E6/E7 mRNA metódou reverznej transkripcie a polymerázovej reťazovej reakcie (RT-PCR). Toto vyšetrenie je však technicky náročné a problémom môže byť kvalita mRNA v parafínovom materiáli; na dosiahnutie optimálnych výsledkov je nutné čerstvo zmrazené tkanivo (102,103).

PCR dôkaz HPV DNA fylogeneticky konzervatívnych génov L1/E1 (prípadne doplnené o vyšetrenie typovo špecifických génov E6/E7) je metodódou s vysokou senzitivitou, ktorá je všeobecne a relatívne jednoducho použitelná aj na parafínovom materiáli (101). Samotná detekcia HVP DNA je však pomerne nešpecifická, keďže neodlíši aktívnu infekciu od inaktívnej infekcie (tzv. „passenger“ HPV), prípadne kontamináciu vzorky. V kombinácii s imunohistochemickým vyšetrením expresie p16 je však HPV DNA najpoužívanejším spôsobom detekcie aktívnej HPV infekcie; iba p16 IHC+/HPV PCR+ tumory môžu byť považované za HPV-asociované (102).

Vysoko špecifický dôkaz relevantnej HPV infekcie, navyše s priamou vizualizáciou v nádorovom tkanive poskytuje DNA in situ hybridizácia (ISH). Problémom DNA ISH je však relatívne nízka senzitivita, ktorá je na úrovni iba ~ 70% (102,103) Relatívne  časté sú aj problémy s interpretáciou pre prítomnosť artefaktov; z vlastnej skúsenosti vieme, že na dosiahnutie optimálych výsledkov je nutná dokonalá fixácia a spracovanie tkaniva.

Nádejnou alternatívou k DNA ISH je vyšetrenie pomocou metódy RNA ISH (obr. 8) (57,58,65). Senzitivita a špecificita vyšetrenia sa blížia „zlatému štandardu“. Nevýhodami sú zatiaľ malé skúsenosti s metodikou, relatívna technická náročnosť a vyššia cena.

ZÁVER

HPV-asociovaný orofaryngeálny skvamocelulárny karcinóm je v súčasnosti považovaný za samostatnú klinickú jednotku so signifikantne lepšou prognózou v porovnaní s HPV-negatívnymi karcinómami. V typickom prípade má HPV⁺ OP-SCC charakteristickú morfológiu nekeratinizujúceho SCC, v malej časti prípadov má však variantnú „high grade“ morfológiu, ktorá však v prípade HPV-pozitivity väčšinou nie je asociovaná s horšou prognózou. Dôkaz biologicky aktívnej HPV infekcie v OP-SCC je preto v súčasnosti nenahraditeľným vyšetrením, ktoré poskytuje dôležitú prognostickú informáciu a je kľúčovým kritériom pre zaradenie pacienta do klinickej štúdie. Dôkaz HPV v p16-pozitívnej metastáze SCC z neznámeho origa v oblasti hlavy a krku môže efektívne nasmerovať diagnostiku a cielenú lečbu na oblasť orofaryngu. Aj keď je s HPV infekciou asociovaná aj časť non-orofaryngeálnych SCC hlavy a krku, rutínne HPV testovanie týchto nádorov nie je vzhľadom na nedostatok dôkazov o prognostickom význame vyšetrenia v súčasnosti odporúčané. Vo všeobecnosti neexistuje konsenzus týkajúci sa optimálnej metodiky na dôkaz transkripčne aktívnej HPV infekcie. Jedným z najpraktickejších a najpoužívanejších spôsobov je skríningové imunohistochemické vyšetrenie expresie proteínu p16 (cut-off ≥ 70% pozitívnych buniek) doplnené vysoko senzitívnym HPV DNA PCR vyšetrením. Novým „zlatým štandardom“ by sa však v blízkej budúcnosti mohla stať metóda HPV RNA ISH.    

PREHLASENIE

Autor práce prehlasuje, že v súvislosti s témou, vznikom a publikácií tohto článku nie v konflikte záujmov a vznik ani publikácia článku neboli podporené žiadnou farmaceutickou firmou. Toto prehlasenie sa týka i všetkých spoluautorov.

Adresa pre korešpondenciu:

MUDr. Marián Švajdler

Bioptická laboratoř, s.r.o.

Mikulášske nám. 4

326 00 Plzeň, Česká republika

tel.: +420 737220036

e-mail: svajdler@yahoo.com