Metody detekce molekulárních prognostických a prediktivních markerů v diagnostice adenoidně cystického karcinomu slinných žláz

Souhrn

Adenoidně cystický karcinom slinných žláz (AdCC) je druhým nejčastějším salivárním karcinomem charakteristickým častými recidivami, perineurálním šířením a vysokou mortalitou v dlouhodobém horizontu. V léčbě AdCC je metodou volby chirurgická resekce s adjuvantní radioterapií, ale léčba velkých, invadujících a recidivujících karcinomů je zpravidla paliativní. AdCC charakterizuje vysoká incidence nádorově specifického onkogenu MYB-NFIB, který je v současné době diagnostickým markerem, ale mohl by v budoucnu sloužit jako cíl pro biologickou léčbu.

Ve studiu a diagnostice AdCC je využívána imunohistochemie a mnoho molekulárně-genetických metod. Některé metody, jako např. reverzně-transkripční PCR či fluorescenční in-situ hybridizace významnou měrou přispěly k identifikaci translokace t(6;9)(q22-23;p23-24) resultující ve fúzi transkripčních faktorů MYB a NFIB, která je pro AdCC mezi salivárními karcinomy unikátní a slouží při diagnostice histopatologicky obtížných případů. Komplexnější metody jako např. masivně paralelní sekvenování pak detekovaly další změny na molekulární úrovni a tím umožnily lepšímu pochopení vzniku a patogeneze tohoto v dlouhodobém horizontu často fatálně končícího onemocnění.

Tento přehledový článek shrnuje základní poznatky o tomto onemocnění, kterých bylo dosaženo použitím právě imunohistochemických a molekulárně-genetických metod, to je na úrovni genomu, transkriptomu či epigenomu.

Klíčová slova:

adenoidně cystický karcinom – salivární karcinom – MYB-NFIB – FISH – aCGH – NGS

Nádory slinných žláz jsou vzácné, představují jen asi 1 % všech lidských neoplázií. Jsou velmi variabilní, jak v mikroskopickém obraze a imunoprofilu, tak klinickým chováním. Adenoidně cystický karcinom (AdCC) je druhým nejčastějším maligním nádorem malých i velkých slinných žláz a představuje asi 10 % všech salivárních karcinomů. Jedná se o nejčastější karcinom hlavy a krku infiltrující nervy, s peri- a intraneurálním šířením až v 80 % případů (1). AdCC slinných žláz je charakteristický svým pomalým růstem, a přestože se histologicky jedná u většiny pacientů o dobře diferencovaný low-grade karcinom, jeho typickým projevem je prolongovaný klinický průběh trvající zpravidla roky, opakované recidivy, a variabilní riziko vzniku pozdních vzdálených metastáz. Klinický průběh onemocnění u pacientů postižených AdCC slinných žláz se často zdánlivě jeví indolentní, ale z dlouhodobého hlediska se jedná o jeden z nejagresivnějších a nejméně předvídatelných nádorů hlavy a krku. AdCC je také spojen s vysokou mortalitou (2). V individuálním případě je však velmi obtížné až nemožné predikovat klinický průběh nádorového onemocnění jen na základě histomorfologických nálezů.

Pro AdCC slinných žláz je typická chromozomální translokace t(6;9)(q22-23;p23-24), která generuje fúzní transkript MYB-NFIB (3). MYB–NFIB fúzní onkogen byl poprvé popsán u AdCC Martou Persson a kol. v roce 2009 (4). Gen MYB, lokalizovaný v oblasti 6q22-23, kóduje transkripční faktor, který hraje zásadní roli v regulaci buněčné proliferace, diferenciace a apoptózy, a tím pravděpodobně i v tumorigenezi AdCC. MYB je vysoce exprimován v nezralých a proliferujících epiteliálních, endoteliálních a hematopoetických buňkách a naopak down-regulován v době, kdy se tyto buňky stanou diferencovanými (3,5). Gen NFIB (Nuclear Factor I/B), lokalizovaný v oblasti 9p23-24, patří do rodiny dimerních DNA-vazebných proteinů fungujících jako buněčný transkripční faktor. Vznik fúzního onkogenu MYB-NFIB vede ke ztrátě 3´ konce MYB genu (od exonu 15 dále), místa, kde dochází k negativní regulaci MYB exprese (4). Následná zvýšená exprese fúzního transkriptu a tím proteinu pak aktivuje transkripci MYB cílových genů, které mají zásadní roli v onkogenní transformaci. MYB-NFIB fúze nebo přestavba MYB genu, které vedou k jeho aktivaci, a tím ke zvýšené expresi MYB–NFIB fúzního proteinu nebo MYB onkoproteinu, byly dosud ze salivárních karcinomů i jiných karcinomů hlavy a krku prokázány pouze u AdCC (3,6). Jedná se tudíž o charakteristický znak těchto maligních sialomů, který se dá využít jako diagnostický marker, s výhodou především u vzdálených metastáz. Zjištěné četnosti fúze MYB-NFIB u AdCC se však v různých studiích liší a závisí především na použité metodice (tab. 1).

V diagnostice AdCC se využívají imunohistochemické a molekulárně-genetické metody od relativně jednoduchých, jako jsou karyotypování, reverzně-transkripční PCR (RT-PCR), reverzně-transkripční PCR v reálném čase (Real-Time RT-PCR), fluorescenční in-situ hybridizace (FISH) až po ty komplexní, mezi které se řadí například komparativní genomová hybridizace na čipu (array comparative genomic hybridization - aCGH), či masivně paralelní sekvenování (Next Generation Sequencing - NGS).

IMUNOHISTOCHEMIE

V diagnostice AdCC lze využít jako nespecifickou skríningovou metodu detekci MYB proteinu (protilátka firmy AbCam v ředění 1:100), (obr. 1). Imunopozitivita na průkaz MYB proteinu se však vyskytuje i u některých AdCC případů, u kterých nebyl detekován zlom MYB genu, což naznačuje i jiné mechanismy aktivace MYB signální dráhy. Slabá až střední pozitivita barvení je také detekována až u 14 % jiných typů salivárních nádorů, což, na rozdíl od molekulárně-genetických technik, snižuje specifitu metody (7-9).

REVERZNĚ-TRANSKRIPČNÍ PCR

K detekci přítomnosti fúzního transkriptu v cDNA (reverzně přepsaná RNA) je využívána RT-PCR. Jedná se o metodu, kdy pomocí PCR za použití kombinace primerů nasedajících k jednomu i druhému fúznímu partnerovi dochází v přítomnosti fúzního transkriptu k jeho amplifikaci a tím možnosti jeho vizualizace, tj. detekce pomocí elektroforézy (obr. 2)(4). Vzhledem k variabilitě zlomových míst genů MYB a NFIB a faktu, že většina identifikovaných AdCC je dostupná ve formě parafinových bloků obsahujících více či méně degradovanou nukleovou kyselinu, je tato metoda zatížena rizikem falešně negativních výsledků. Studie provedená za použití této techniky detekovala přítomnostMYB-NFIB fúzního transkriptu v cca 30 % AdCC (10), což je výrazně méně než v případě detekce pomocí FISH metody (tab. 1).

Variantu RT-PCR, tzv. Real Time RT-PCR lze využít k relativní kvantifikaci exprese mRNA genu MYB. Pomocí této metody bylo zjištěno, že overexprese MYB mRNA byla detekována u většiny případů AdCC (89 %) s tím, že u případů pozitivních na fúziMYB-NFIB je tato overexprese signifikantně vyšší, než u případů bez této translokace (8,10).

FLUORESCENČNÍ IN-SITU HYBRIDIZACE

V současnosti nejčastěji využívanou metodou v diagnostice AdCC je FISH analýza cílená na translokaci t(6;9)(q22-23;p23-24). Oproti konvenčním RT-PCR metodám není třeba znát přesnou nukleotidovou pozici zlomových míst, neboť FISH próba, zahrnující kompletní sekvenci studovaných genů a přilehlých oblastí, obsáhne celé široké spektrum možných aberací. Jako sondy se dříve hojně využívaly bakteriální arteficiální chromosomy (BAC). Jejich nevýhodou byly velmi často slabé signály na hůře fixovaném materiálu. V současnosti je dosahováno lepších výsledků s použitím polynukleotidových sond certifikovaných pro in-vitro diagnostiku či oligonukleotidových necertifikovaných sond. Přítomnost fúzního genu pak lze prokazovat přímo - použitím kombinované fúzní sondy (jedna část sondy je cílena na MYB gen a druhá na gen NFIB) či nepřímo - detekcí zlomů jednotlivých zúčastněných genů s použitím tzv. break-apart sond (obr. 3).

Vedle analýzy translokace MYB-NFIB lze FISH použít i ke studiu dalších změn nalezených v AdCC, jako jsou např. numerické aberace genů. Takto byly popsány například relativně raritní amplifikace genu KIT (9) a genu CCND1 (12).

Výše zmíněné metody jsou většinou cílené na jednu konkrétní oblast (například na fúzi MYB-NFIB). K detailnějšímu studiu nádorů je nutné využití komplexnějších analýz.

ARRAY-KOMPARATIVNÍ GENOMOVÁ HYBRIDIZACE

V případě studia početních chromosomálních změn je metodou volby komparativní genomová hybridizace na čipu založená na kompetitivní hybridizaci různě fluorescenčně značené (např. Cy3 a Cy5) nádorové a nenádorové DNA jednoho vzorku na čipu, který obsahuje obvykle 25-70 nt dlouhé oligonukleotidy (sondy) se známou přesnou genomickou lokalizací. Po hybridizaci je čip skenován pro zjištění intensit fluorescencí, kdy z případné převahy intenzity konkrétní barvy lze usuzovat na zisk nebo ztráty jednotlivých regionů korespondujících k daným sondám (13).

V práci Bernheima a kol. (14) byly pomocí aCGH detekovány rekurentní numerické aberace u bronchiálních a salivárních AdCC. Šlo o parciální ztráty v oblastech 1p35, 6q22-25, 8q12-13, 9p21, 12q12-13, 17p11-13 a zisky (gain) v oblastech 7p15.2, 17q21-25, 22q11-13. Do minimálních oblastí vykazujících deleci se řadily oblasti obsahující tumor-supresorové geny CDKN2A/CDKN2B, TP53 a LIMA1. Minimální oblast s amplifikací byla oblast HOXA genového clusteru (14). V jiných studiích však byla nalezena řada dalších změn v genomu (tab. 2).

EXPRESNÍ ANALÝZA

Komplexnější alternativou k měření exprese pomocí Real-Time RT-PCR je cDNA expresní čip schopný analýzy míry exprese mRNA až celého transkriptomu. Jde o variantu aCGH, kdy jsou na čip, obsahující oligonukleotidy z kódujících oblastí genomu, nahybridizovány fluorescenčně značené cDNA tumoru a zdravé tkáně k detekci rozdílů exprese (15). Touto metodou byla u AdCC například potvrzena zvýšená exprese genu SOX10 (16,17) a obecně upregulace genů ze SOX, NOTCH a WNT genových rodin (18).

MASIVNĚ PARALELNÍ SEKVENOVÁNÍ

V současnosti zřejmě nejkomplexnější metodou s nejvyšší informační výtěžností je masivně paralelní sekvenování nebo také sekvenování nové generace (anglicky next-generation sequencing – NGS).

NGS je schopna nejen prosté analýzy sekvencí nukleotidů v kompletním genomu či jeho vybrané části, ale může detekovat i případné strukturální varianty. Tímto v sobě zahrnuje mimo jiné i jistou náhradu aCGH, Real-Time RT-PCR či expresních arrayí. V případě celogenomového či RNA (transkriptomového) sekvenování je izolována DNA či RNA, která se přepíše do cDNA. Takto připravená DNA je pak různými metodami fragmentována na kratší úseky vhodné pro další zpracování. U cíleného sekvenování vybraných částí genomu či transkriptomu se po izolaci DNA či RNA (přepsané do cDNA) nejprve vychytávají hybridizací či obohacují amplifikací konkrétní oblasti zájmů. Pak již, pro oba přístupy společně, následuje ligace adapterů a amplifikace produktu s použitím primerů nasedajících ke komplementárním sekvencím na adapterech. Po přečištění amplifikátu je vzniklý produkt – knihovna připraven k vlastnímu sekvenování a následně k analýze dat. V současné době jsou nejrozšířenějšími postupy „Sequence-by-synthesis“ metody využívající fluorescenční značení a metody využívající analýzu změny pH (19,20).

NGS metody se také významně zapsaly do molekulární charakterizace AdCC. V roce 2016 byl celogenomovým sekvenováním odhalen gen MYBL1 jako alternativní fúzní partner NFIB u 5 z 12 MYB-NFIB negativních případů (21). Přibližně ve stejné době pak Brayer a kol. získali obdobnou informaci pomocí RNA sekvenování (22). Mimo to bylo těmito skupinami identifikováno několik nových vzácně se vyskytujících fúzí – genů YTHDF3 a RAD51B s MYBL1 genem, dále genů XRCC4, NKAIN2, PTPRD a AIG1 genů s genem NFIB.

Tyto studie, stejně jako některé další, také potvrdily nízkou frekvenci genových mutací (substitucí, krátkých delecí, inzercí apod.) u AdCC. Pokud již byly mutace nalezeny, jako ve studii Stephens a kol. (23), zasahovaly především geny z NOTCH signální dráhy. Příkladem je gen SPEN mutovaný u 20,8 % pacientů. Gen SPEN je lokalizovaný na lokusu 1p36. Kóduje represor transkripce s RNA SPOC (Spen paralog and ortholog C-terminal) vazebnými doménami, regulující především NOTCH signální dráhu. Všechny nalezené mutace vyústily ve zkrácený protein s chybějící regulační SPOC doménou. Ve stejné studii byla v 8,3 % případů také identifikována aktivující mutace FGFR2 analogická k mutacím nalezeným u ovariálních a endometriálních nádorů, poukazující na možnosti léčebného využití u této podskupiny pacientů (23). Ve studii Ho a kol. (24) byly použitím kombinace celogenomového a exomového sekvenování na kohortě 60 případů detekovány mutace zasahující chromatin remodelující geny, dále i geny z FGF/IGF/PI3K, PKA a NOTCH signálních drah. V malém procentu případů negativních na MYB-NFIB fúzi pak byly pozorovány pravděpodobně aktivující mutace genu MYB (24).

Expresní studie využívající jak čipovou, tak NGS technologii přinesly další vhled do karcinogeneze AdCC. Prokázaly například, že u tumorů s fúzemi MYB-NFIB a MYBL1-NFIB nejsou signifikantní rozdíly v expresích analyzovaných genů. Naproti tomu, klastrová analýza expresních profilů odlišila vzorky s translokacemi zasahujícími exon 11 nebo vyšší v MYB, popř. MYBL1 genu od vzorků s translokacemi zasahujícími exony 8 nebo 9 těchto genů (21). Bell a kol. (25) pak zkoumali transkriptom AdCC se zaměřením na rozdíly mezi epiteliálně (E-AdCC) a myoepiteliálně (M-AdCC) dominantními AdCC. Nalezli 430 transkriptů specifických pro E-AdCC, 392 pro M-AdCC a 424 transkriptů, které byly společné pro oba typy. Jejich detailní analýza pak ukázala na možné použití DLX-6 genu jako biomarkeru pro E-AdCC a KRT16, SOX11 a MYB genů pro M-AdCC (25).

METODY PRO DETEKCI METYLACÍ PROMOTORŮ GENŮ

Výše zmíněné studie se zabývaly strukturou vlastní nukleové kyseliny, popř. mírou její exprese. Významnou funkci v karcinogenezi má však též epigenetika, tj. ovlivnění exprese genů beze změny nukleotidové sekvence. Toto se na úrovni DNA děje nejčastěji prostřednictvím metylací promotorových oblastí genů vyúsťujících v potlačení exprese daných genů a je tedy logicky dalším předmětem zájmu při charakterizaci nádorových onemocnění.

Metylační status promotorů genů lze zjišťovat řadou odlišných způsobů. Nejčastěji používaným způsobem je metylačně sensitivní PCR (MSP), při které se metylované cytosiny v DNA nejprve konvertují bisulfidovou reakcí na uracil a takto konvertovaný templát je pak amplifikován pomocí PCR za použití primerů specifických jak k metylované tak nemetylované sekvenci. V pozitivním případě vzniká v reakci obsahující primery pro metylovaný promotor elektroforeticky či fluorescenčně detekovatelný produkt amplifikace.

Maruya a kol. (26) pomocí MSP detekovali metylaci promotoru E-cadherinu (CDH1) u 70 % případů AdCC. V obdobné studii Zhang a kol. (27) identifikovali metylovaný promotor CDH1 u 57 % pacientů, zde však, na rozdíl od výše zmíněné studie, metylační status promotoru CDH1 koreloval s pokročilejším stádiem tumoru a také perineurálním šířením AdCC. V dalších studiích využívajících MSP pak byla zjištěna zvýšená metylace promotorů genů p16 u 49,1 % (28) a 46,7 % (29) pacientů, dále genů RASSF1A celkem u 33,8 % pacientů, DAPK u 20,9 %, MGMT u 5,8 % (29,30), RARβ2 u 3,8 % (30) a genu RUNX3 u 75 % pacientů, jehož nízká exprese korelovala s vyšší agresivitou AdCC (31). Ve studii Shao a kol. (32) byla studována metylace genu MYB s negativním výsledkem u všech 18-ti analyzovaných případů AdCC. V práci Tan a kol. (33) pak byla detekována hypometylace Aquaporinu-1 u 75,3 % AdCC pacientů, avšak nekorelující s klinickými parametry.

Další metodou, použitou ke studiu metylačního profilu AdCC byla Metylated CpG Island Amplification (MCIA), která je založena na štěpení DNA 2 různými metylačně sensitivními restrikčními enzymy s následnou amplifikací PCR. Nádorová a kontrolní DNA jsou poté označeny Cy3 a Cy5 a hybridizovány na čipu. Porovnáním intensity výsledných barev (princip aCGH) lze zjistit míru metylace daných promotorů.

Ve studiích jež používali MCIA metody pak bylo identifikováno 32 hypermetylovaných genů, mezi nimi např. EN1, FOXE1, GBX2, FOXL1 a 7 hypometylovaných genů, jako např. FBXO17, PHKG1, LOXL1, DOCK1 a PARVG. Nejvýznamnějším z těchto výsledků byla hypermetylace EN1 – genu ovlivňujícím vývoj CNS, která koreluje se stádiem, lokalizací a klinickým chováním nádoru (34,35).

ZÁVĚR

Na základě našich zkušeností s detekcí translokací MYB-NFIB,popř. MYBL1-NFIB lze říci, že především FISH analýza za použití break-apart a fúzních sond představuje spolehlivý diagnostický nástroj u jinak obtížně diagnostikovatelných AdCC různých tkání. Oproti tomu RT-PCR dává často falešně negativní výsledky kvůli využívání parafinových bločků a tím degradované RNA, či pro možný výskyt alternativních zlomových míst. Jako slibný prognostický marker AdCC se dle našich závěrů jeví delece lokusu 1p36, která výrazně koreluje s nižším přežíváním pacientů.

Adenoidně cystický karcinom je druhým nejčastějším maligním nádorem slinných žláz, je diagnosticky obtížný, neúprosně progredující a v mnoha případech fatálně končící nádor. Metody molekulární biologie, vedle histopatologie a imunoprofilu, významně pomáhají lepšímu pochopení vzniku, chování a vývoji tohoto onemocnění, což v budoucnu může vyústit v objev nové, účinnější léčby.

PODĚKOVÁNÍ

Tato práce byla z části podpořena grantem SVV-2017-260 391.

PROHLÁŠENÍ

Autor práce prohlašuje, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku není ve střetu zájmu a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou. Toho prohlášení se týká i všech spoluautorů.

Adresa pro korespondenci:

Mgr. Petr Šteiner

Bioptická laboratoř s.r.o.

Mikulášské náměstí 4, 326 00, Plzeň

tel: +420 732 961 886

e-mail.: steiner@biopticka.cz