Srovnání citlivosti spor Bacillus subtilis a spor českých kmenů Clostridium difficile vůči dezinfekčním prostředkům

Souhrn

V prevenci nozokomiálních epidemií vyvolaných Clostridium difficile ribotyp 027 je důležitá kromě jiného dezinfekce okolí nemocného spolehlivě sporicidními dezinfekčními přípravky. Sporicidní aktivita konkrétních přípravků se zkouší na sporách Bacillus subtilis. Vyskytují se dotazy, zda přípravek, který účinkuje na spory B. subtilis, bude stejně dobře působit i na spory C. difficile. Proto jsme porovnali účinek pěti přípravků, jež jsou na českém trhu k dispozici, na spory sbírkových kmenů obou mikrobů a na spory deseti terénních kmenů C. difficile izolovaných ze stolice hospitalizovaných pacientů. Účinnými látkami byly: přípravek č. 1 chloramin B, č. 2 oxid chloričitý, č. 3 formaldehyd a ethan-2-dion, č. 4 kyseliny peroctová a octová a peroxid vodíku, č. 5 ethanol a propan-2-ol. K testování byla použita ředicí neutralizační metoda podle ČSN EN 13704, za sporicidní byl považován přípravek snižující počet spor o více než 3 řády. Kromě standardního času 60 minut byla použita 15minutová expozice a účinek byl testován rovněž při bílkovinné zátěži. Přípravek č. 1 účinkoval na spory C. difficile lépe než na spory B. subtilis, a to i v nižší (1%) koncentraci. Rovněž vůči přípravkům č. 2 a č. 3 byly spory C. difficile o něco citlivější než spory B. subtilis. Přípravek č. 4 byl natolik sporicidní, že redukoval počet spor všech kmenů již za 15 minut o více než 4 řády; případný rozdíl v citlivosti spor nebyl patrný. Zatímco na spory B. subtilis přípravek č. 5 spolehlivě nepůsobil, vůči klinickým kmenům C. difficile překvapivě vykázal sporicidní účinek. Uzavíráme, že spory zejména terénních kmenů C. difficile se ukázaly být citlivější k dezinfekčním přípravkům než spory sbírkového kmene B. subtilis.

Klíčová slova:
Clostridium difficile – Bacillus subtilis – spory – dezinfekce.

V r. 2003 byly nejprve v severoamerických nemocnicích a poté zejména ve Velké Británii i v dalších evropských zemích popsány nozokomiální epidemie vyvolané vysoce virulentním kmenem Clostridium difficile ribotypu 027 [13, 16]. Do června 2008 byl zaznamenán v 16 zemích, z toho v 9 vyvolal epidemie [9, 12]. Onemocnění vyvolané C. difficile (C. difficile-associated disease, CDAD) se přenáší jako typická nozokomiální infekce, probíhá jako pseudomembranózní kolitida, je provázeno průjmem a v případě typu 027 se vyznačuje těžším průběhem a vyšší mortalitou [1, 2].

Epidemiologicky závažná je rychlá kontaminace okolí průjmujícího pacienta sporami. C. difficile se v nemocničním prostředí velmi rychle šíří a jeho spory v něm přežívají po řadu měsíců. Mezi opatření, která omezují výskyt infekcí vyvolaných C. difficile, patří kromě jiného denní dezinfekce okolí nemocného spolehlivě sporicidními dezinfekčními přípravky [11, 21]. Mezi ně patří obecně činidla alkylační (hlavně glutaraldehyd) a oxidační (např. kyselina peroctová) včetně halogenů (pro běžnou dezinfekci především preparáty na bázi chlornanu sodného) [14].

Výběr vhodného dezinfekčního prostředku je zcela zásadní, některé přípravky nemající sporicidní aktivitu mohou dokonce zvýšit tvorbu spor. Je-li C. difficile vystaveno účinkům takových dezinfekčních přípravků, ocitá se ve stresu, a proto intenzivněji sporuluje [24].

Sporicidní aktivita konkrétních dezinfekčních přípravků se podle normy ČSN EN 13704 [6] zkouší na sporách kmene Bacillus subtilis ATCC 6633. Ze strany výrobců se nyní stále častěji setkáváme s dotazem, jestli přípravek, který účinkuje na spory B. subtilis, bude stejně dobře působit i na spory C. difficile. Proto jsme se rozhodli srovnat účinek různých dezinfekčních přípravků, které jsou k dispozici v České republice, na spory obou druhů a zjistit, zda B. subtilis je tím správným modelovým mikroorganismem ke zjišťování sporicidní aktivity i vůči sporám C. difficile.

Materiál a metody

Použité mikroorganismy

• a) Sbírkové kmeny: Bacillus subtilis ATCC 6633 a Clostridium difficile CCM 3593.
• b) Terénní kmeny C. difficile:C. difficile 1 (N438053/1), 2 (N440820), 3 (N450803), 4 (N449415/1), 5 (N448876), 6 (N446248/1), 7 (N434201), 8 (N417138), 9 (N412277/2) a 10 (N406658/1). Všech 10 kmenů bylo izolováno ze stolice pacientů Nemocnice Na Homolce v Praze. Tři nemocní byli z Prahy, ostatní pocházeli ze šesti různých okresů v Čechách.

Testované dezinfekční přípravky

Přehled zkušebních koncentrací a druh účinné látky uvádí tab. 1. Všechny přípravky byly určeny k dezinfekci ploch a povrchů, příp. předmětů. Sporicidní účinnost výrobci deklarovali u přípravků č. 2 a 4. Testovací roztoky přípravků byly připraveny v tvrdé vodě, a to ve dvou koncentracích. Protože během testu dochází přidáním suspenze spor a zátěžových podmínek ke zředění přípravku, vycházelo se z 1,25násobku požadované zkušební koncentrace. Přípravek č. 5 bylo možno vzhledem ke zmíněnému zředění testovat nejvýše jako 80%.

Zkouška sporicidní aktivity

Postup vycházel z normy ČSN EN 13704 Chemické dezinfekční přípravky – Kvantitativní zkouška s použitím suspenze ke stanovení sporicidního účinku chemických dezinfekčních přípravků používaných pro potraviny, průmysl, domácnosti a veřejné prostory – Zkušební metoda a požadavky (fáze 2/stupeň 1) – což je metoda ředicí neutralizační [6].

Testovací podmínky. Teplota: 20 °C ± 1 °C. Doba kontaktu: 15 min ±10 s a 60 min ±10 s. Bílkovinná zátěž: 0,3 g/l bovinního albuminu (čisté podmínky) a 3 g/l bovinního albuminu a 3 ml/l praných ovčích erytrocytů (nečisté podmínky).

Příprava ingrediencí a provedení. Příprava tvrdé vody a zásobní a testovací suspenze spor B. subtilis probíhala podle citované normy [6]. Analogicky, ovšem za podmínek anaerobní kultivace, se připravovaly zásobní a testovací suspenze spor kmenů C. difficile.

Vlastní zkouška. Všechna činidla byla vytemperována na teplotu testování. Do zkumavky byl přenesen 1 ml bílkovinné zátěže a 1 ml bakteriální suspenze spor příslušné denzity. Směs byla promíchána. Poté se přidalo 8 ml testovaného přípravku a směs byla opět promíchána. Po uplynutí požadované zkušební doby byl přenesen 1 ml směsi do 9 ml neutralizátoru obsahujícího tween 80, lecithin a cystein a obsah zkumavky byl zamíchán. Suspenze byla ponechána 2 minuty odstát. Po promíchání se z každé zkumavky přeneslo do dvou Petriho misek o průměru 9 cm po 0,5 ml suspenze a zalilo 15 ml tryptonosójového agaru ochlazeného na 45 °C ± 5 °C. Kultivace probíhala po 3 dny při 30 °C ±°C pro B. subtilis a anaerobně při 37 °C ± 1 °C pro C. difficile.

Vyhodnocení testu. Byly spočítány kolonie (CFU) ze všech inkubovaných misek. Hodnoty N a N_d, tedy počty spor v testovací suspenzi ve vodě a testovací suspenzi po vystavení působení dezinfekčního přípravku, byly stanoveny jako průměry počtu CFU vždy ze dvou Petriho misek po přepočtu na 1 ml.

Poté byly obě hodnoty (N a N_d) zlogaritmovány a byl získán rozdíl těchto logaritmů R = logN – logN_d.

Požadavky normy. Podle normy ČSN EN 13704 má sporicidní účinnost přípravek, který je schopen při 20 °C a za čistých podmínek po 60 minutách kontaktního času redukovat počet spor B. subtilis o více než 3 řády (R>3). Přitom se počty CFU v testovací suspenzi s vodou (N) mají nacházet v intervalu 1,5×10⁶ – 5×10⁶ [6].

Pokusy jsme rozšířili o doplňující kontaktní čas 15 minut a o nečisté podmínky (3 g/l bovinního albuminu a 3 ml/l erytrocytů), o sbírkový kmen C. difficile a o deset kmenů C. difficile izolovaných z klinického materiálu.

Výsledky

1. Sporicidní účinnost dezinfekčního přípravku č. 1 (účinná látka chloramin B)

Testovaný přípravek č. 1 v 1% koncentraci v časech působení 15 a 60 minut za podmínek nižšího i vyššího znečištění metodou ředicí neutralizační titr spor B. subtilis o více jak 3 řády neredukoval. Za stejných podmínek ale snižoval titr spor sbírkového kmene i všech 10 kmenů C. difficile izolovaných z klinického materiálu o více než 4 řády (obr. 1).

Ve 2% koncentraci přípravek č. 1 během 15 minut titr spor B.subtilis o více jak 3 řády ještě neredukoval, po 60 minutách však již sporicidní účinnost prokázal. Titr spor všech kmenů C. difficile ale snížil i během pouhých 15 minut o více než 4 řády.

Na spory C. difficile tedy přípravek č. 1 účinkoval lépe než na spory B. subtilis, a to i v nižší (1%) koncentraci.

2. Sporicidní účinnost dezinfekčního přípravku č. 2 (účinná látka oxid chloričitý generovaný in situ)

V nižší koncentrací (0,075%) přípravek č. 2 redukoval počet spor B. subtilis o více než 3 řády až po 60 minutách, a to jen za podmínky nižšího znečištění (požadavkům normy tedy ale vyhověl). S výjimkou sbírkového kmene a terénního kmene č. 3 však v této koncentraci redukoval počet spor C. difficile o více než 3 řády již během 15 minut, a to i za nečistých podmínek. Za 60 minut byl i pro zmíněné dva kmeny spolehlivě sporicidní.

V 0,15% koncentraci přípravek č. 2 selhal jen v případě spor B. subtilis při 15minutové expozici za vyššího znečištění, kdy redukoval počet spor jen o 2 řády. V ostatních případech u B. subtilis vyhověl požadavku normy na redukci počtu spor o více než 3 řády a titr spor C. difficile snižoval dokonce o více než 4 řády.

Z uvedeného plyne, že vůči přípravku č. 2 byly spory C. difficile o něco citlivější než spory B. subtilis.

3. Sporicidní účinnost dezinfekčního přípravku č. 3 (účinné látky formaldehyd a glyoxal)

V nižší koncentraci (0,25 %) snížil testovaný přípravek č. 3 titr spor standardního kmene B. subtilis o více než 3 řády až po 60minutové expozici. Pokud jde o spory C. difficile, u sbírkového kmene a čtyř terénních kmenů se jejich titr snížil o 3 řády již po 15 minutách i v podmínkách vyššího znečištění. Titr spor dalších tří kmenů byl po 15 minutách redukován o 3 řády jen za čistých podmínek, titr zbývajících tří terénních kmenů se za vyššího znečištění podařilo snížit o 3 řády až po 60 minutách.

I  osmkrát koncentrovanější (2%) přípravek č. 3 snížil titr spor B. subtilis o 3 řády až po 60 minutách. U sbírkového kmene C. difficile a tří terénních kmenů se redukce počtu spor po 15 minutách blížila 3 řádům, ale nepřesáhla je. Šedesátiminutová expozice vedla spolehlivě ke snížení titru spor u všech klostridiových kmenů o více než 4 řády.

I vůči přípravku č. 3 se spory C. difficile jevily citlivější než spory B. subtilis.

4. Sporicidní účinnost dezinfekčního přípravku č. 4 (účinné látky peroxid vodíku a kyseliny peroctová a octová)

V obou testovaných koncentracích (0,2 a 0,3 %) a za obou podmínek znečištění snižoval přípravek č. 4 počet spor jak B. subtilis, tak všech kmenů C. difficile již za 15 minut o více než 4 řády a prokázal tedy spolehlivou sporicidní účinnost. Případný rozdíl v citlivosti spor obou bakteriálních druhů nebyl patrný.

5. Sporicidní účinnost dezinfekčního přípravku č. 5 (účinné látky ethanol a isopropanol)

Přípravek č. 5 (přidáním suspenze spor a bílkovinné zátěže zředěný na 80 %) neredukoval počet spor B. subtilis ani sbírkového kmene C. difficile o 3 řády ani za 60 minut. Překvapivě však snižoval počet spor všech klinických kmenů C. difficile o více než 3 řády po 60 minutách, z toho u 3 kmenů již během 15 minut i za podmínek vyššího znečištění. Zatímco na spory B. subtilis přípravek č. 5 spolehlivě nepůsobil,u klinických kmenů C. difficile se projevil v různém stupni jako sporicidní.

Diskuse

Jedním z hlavních rezervoárů spor C. difficile mohou být předměty, podlahy a povrchy, které jsou kontaminovány sporami této bakterie od kolonizovaného pacienta nebo asymptomatického přenašeče. Proto je výběr vhodného způsobu dezinfekce nemocničního prostředí jedním ze stěžejních prvků prevence. Nejčastěji se k běžné dezinfekci používají chlorové preparáty, jsou levné a spolehlivě účinkují na spory [10, 11, 21]. Bylo prokázáno, že počet pacientů s CDAD klesl o více než 60 % po výměně přípravku založeného na kvarterní amoniové soli za dezinfekční prostředek na chlornanové bázi [15]. Po zavedení komplexního přístupu včetně dezinfekce nemocničního prostředí 10% roztokem chlornanu sodného se podařilo dosáhnout 66% snížení počtu nozokomiálních infekcí C. difficile [23]. V souvislosti s dezinfekcí prostředí jsou důležité dva nálezy – jednak nedostatečné koncentrace některých dezinfekčních, resp. čisticích prostředků mohou sporulaci C. difficile zesilovat [24], jednak epidemicky závažné kmeny mají sklon ke zvýšené tvorbě spor [cit. dle 11 a 21].

V porovnávání látek uvolňujících chlor jako účinnou látku měl největší sporicidní aktivitu na spory B. subtilis chlornan sodný. Nižší aktivitu vykázal dichlorisokyanurát sodný a nejnižší chloramin T [4]. V naší studii přípravek č. 1, který je na chloraminové bázi, dokázal v 1% koncentraci inaktivovat spory všech kmenů C. difficile již během 15 min, ale počet spor B. subtilis redukoval dostatečně jen ve dvojnásobné koncentraci a až po 60 min.

Lepší účinnost než samotný chlornan sodný měly na spory B. subtilis jeho směsi s methanolem, jako nejúčinnější se ukázala směs obsahující 50 % methanolu a chlornanu (2000 mg volného chloru/l) [5]. Protože však chlornan ve vyšších koncentracích způsobuje korozi, v navazující studii autoři testovali směsi s nižší koncentrací, ale upraveným pH. Srovnatelnou aktivitu jako výše uvedená směs prokázal 1% methanol s chlornanem (100 mg chloru/l) v rozmezí pH 7,6 – 8,1 [7].

Další studie [17]srovnávala účinek běžného chlornanového přípravku pro domácnost jednak samotného, jednak okyseleného octem, dále roztoku vyvíjejícího oxid chloričitý a přípravku se 7% peroxidem vodíku na spory B. subtilis, C. sporogenes a C. difficile zaschlé na nosičích. Nejrychleji (během 10 minut) snížily počet spor všech tří druhů o 6 řádů chlornan (s 5000 mg volného Cl₂/l) a okyselený chlornan, přípravek s peroxidem jen u C. difficile. Oxid chloričitý inaktivoval spory B. subtilis a Clostridium sporogenes do 15 minut, spory C. difficile do 30 min. Relativní citlivost spor C. difficile kromě typu přípravku závisela i na kultivačním médiu, v němž se jejich suspenze připravovala, jednoznačné závěry ale z výsledků nevyplynuly.

Superoxidovaná voda obsahující směs 1,44% kyseliny chlorné a volných chlorových radikálů inaktivovala spory C. difficile během 10 minut o více než 6 řádů, ovšem v přítomnosti 5 % koňského séra jen o 4 řády [20].

V naší studii přípravek č. 2 generující oxid chloričitý in situ redukoval počet spor všech testovaných mikroorganismů o 3 řády až během 60 minut. V čase 15 minut v přítomnosti vyšší bílkovinné zátěže ale signifikantně snížit počet spor B. subtilis nedokázal. Spory C. difficile byly vůči přípravku č. 2 asi o jeden řád citlivější než spory B. subtilis.

Účinky glutaraldehydu, formaldehydu, peroxidu vodíku, peroctové kyseliny, chlornanu sodného a fenolu na spory B. subtilis srovnává studie z r. 1996 [19]. Sporicidní aktivita těchto látek klesala od peroxidu vodíku přes glutaraldehyd ke kyselině peroctové, která působila srovnatelně jako chlornan sodný; nižší aktivitu měl formaldehyd a zcela nejnižší fenol. I v naší práci přípravek č. 4 s kyselinou peroctovou a peroxidem vodíku byl účinnější než přípravek č. 3 obsahující formaldehyd. Glutaraldehyd v různých koncentracích testovali na sporách C. difficile Rutala et al. [18]. Dospěli k závěru, že pro expozice 10 až 30 minut nesmí účinná koncentrace glutaraldehydu klesnout pod 2 % a aniž uvádějí konkrétní data, citují [8], že vůči glutaraldehydu jsou spory C. difficile citlivější než spory mikroorganismů doporučovaných ve sporicidním testu americké Association of Official Analytical Chemists, totiž B. subtilis a C. sporogenes.

Účinek 2% glutaraldehydu, 1,6% kyseliny peroctové, 70% isopropanolu a okyseleného dusitanu na spory C. difficile zkoumala Wulltová et al. [25]. Peroctové ionty redukovaly titr spor o více než 4 řády již ve velmi krátkých kontaktních časech, 2% glutaraldehyd a okyselený dusitan až v průběhu 30 minut. I v další studii prokázala výborný sporicidní účinek kyselina peroctová: snižovala počet spor C. difficile již během 10 minut o 6 řádů, kdežto dichlorisokyanurát sodný jen o 1,5 řádu [3]. To jsme si ověřili i my, přípravek č. 4, jenž kyselinu peroctovou obsahoval, účinkoval spolehlivě bez ohledu na stupeň znečištění v obou časech, v nižší i vyšší koncentraci na spory všech testovaných kmenů. Naproti tomu autoři, kteří srovnávali účinek kyseliny peroctové a dichlorisokyanurátu na spory epidemického kmene C. difficile 027 [22], pozorovali, že za čistých podmínek snížil komerční preparát s dichlorisokyanurátem počet spor o 3 řády již za 3 minuty, zatímco přípravek s kyselinou peroctovou až za 30 min, ovšem v přítomnosti organické zátěže nebyl mezi oběma přípravky podstatný rozdíl.

Účinek kyseliny monopercitronové (MPCA), která na rozdíl od kyseliny peroctové nepáchne, na spory různých klostridií testovali Wutzler et al. [26]. Nejodolnější byly spory Clostridium septicum, které 1% MPCA zničila během minuty, 0,1% během 30 minut. Méně odolné byly spory Clostridium novyi a Clostridium perfringens, nejméně pak spory Clostridium tetani. Zajímavé je, že autoři tvrdí, že spory druhů rodu Bacillus jsou méně odolné než spory klostridií.

Zatímco alkoholový přípravek č. 5 na spory B. subtilis a sbírkového kmene C. difficile spolehlivě nepůsobil,což se očekávalo, u všech 10 klinických kmenů C. difficile překvapivě vykázal sporicidní účinek – u tří kmenů snížil počet spor o 3 řády dokonce již za 15 minut, u zbytku po 60 minutách. Přípravek obsahoval 45 % ethanolu a 30 % isopropanolu. Vzhledem ke krátké době, po níž se nechávají alkoholové přípravky určené k dezinfekci rukou působit, nemá ale naše zjištění praktický význam.

Ve zmíněné švédské studii [25] byla sporicidní účinnost 70% isopropanolu během 5 až 30 minut „nepatrná nebo žádná“. I zde autoři použili několik terénních kmenů, rozdíl ale spočíval v tom, že spory připravovali v mozko-srdcové infuzi, kdežto my jsme postupovali podle normy ČSN EN 13704 a užívali tryptózosójový bujon. Závislost výsledků na kultivační půdě zaznamenali u C. difficile Perez et al. [17]. Zjistili, že spory vyrostlé v mozko-srdcové infuzi byly odolnější např. vůči oxidu chloričitému, okyselenému chlornanu a peroxidu vodíku.

Cílem naší studie bylo ověřit, zda jsou spory C. difficile citlivější či odolnější vůči různým dezinfekčním přípravkům než spory sbírkového kmene B. subtilis a zjistit, zda tak B. subtilis je či není tím správným referenčním kmenem.

Zjistili jsme, že na spory C. difficile přípravek č. 1 obsahující chloramin B účinkoval lépe než na spory B. subtilis, a to i v nižší koncentraci. Rovněž vůči přípravku č. 2, který generuje oxid chloričitý in situ, byly spory C. difficile o něco citlivější než spory B. subtilis.Totéž platilo pro přípravek č. 3 s účinnými látkami formaldehydem a glyoxalem. Pouze u přípravku č. 4 s kyselinou peroctovou a peroxidem vodíku případný rozdíl v citlivosti spor obou bakteriálních druhů nebyl patrný, ovšem jen proto, že tento preparát redukoval o více než 3 řády spory veškerých testovaných kmenů během 30 i 15 minut, za podmínek vyššího i nižšího znečištění a v obou zkoumaných koncentracích. Jako jediný tak prokázal sporicidní aktivitu za všech podmínek testování. Zatímco na spory B. subtilis alkoholový přípravek č. 5 spolehlivě nepůsobil, překvapivým zjištěním bylo, že u klinických kmenů C.difficile vykázal – ovšem většinou až po 60 minutách a bez bílkovinné zátěže – zřetelný sporicidní účinek.

Uzavíráme, že sporyzejména terénních kmenů C. difficile se ukázaly být citlivější k dezinfekčním přípravkům než spory sbírkového kmene B. subtilis. B. subtilis tedy je tím správným referenčním kmenem k testování sporicidní účinnosti i vůči C.difficile. Nakolik jsou vůči dezinfekci odolné spory hypervirulentního kmene C. difficile ribotyp 027, zůstává zatím otázkou, první publikované výsledky [22] ale na případnou vyšší rezistenci vůči dezinfekčním látkám ani v nejmenším neukazují.

Poděkování

Autoři děkují prim. MUDr. Vlastimilu Jindrákovi a RNDr. Zuzaně Zemanové z Oddělení klinické mikrobiologie a antibiotické stanice Nemocnice Na Homolce za poskytnutí terénních kmenů C. difficile, paní Zuzaně Matuškové z vedení fy Chemila Hodonín za cenné rady a možnost použití metodiky, materiálů a prostoru k experimentům a Mgr. Radku Přikrylovi, Ph.D., proděkanu Fakulty chemické Vysokého učení technického v Brně, za svolení k publikaci výsledků bakalářské práce autorky B. Š.

Do redakce došlo 11.8.2008

Prof. MUDr. Miroslav Votava, CSc.

Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně

Pekařská 53

656 91 Brno

e-mail: mvotava@med.muni.cz