Laboratorní diagnostika COVID-19

Súhrn

Pandemie vyvolaná virem SARS-CoV-2 je provázena velkým množstvím informací zabývajících se také laboratorní diagnostikou onemocnění, které virus vyvolává a které bylo pojmenováno COVID-19. Cílem tohoto sdělení je přispět k tomu, jak indikovat a interpretovat výsledky laboratorních vyšetření prováděných v rámci diagnostiky COVID-19.

Klíčová slova:

SARS-CoV-2 – COVID-19 – laboratorní diagnostika.

Laboratorní diagnostiku COVID-19 můžeme rozdělit na:

-    přímý průkaz viru v daném materiálu, který je prováděn převážně metodami molekulární biologie, nejčastěji RT-PCR

-    nepřímý průkaz viru v daném materiálu pomocí detekce a stanovení protilátek proti různým komponentám viru

-    stanovení řady dalších analytů a markerů provázejících toto onemocnění.

Abychom mohli racionálně indikovat laboratorní vyšetření v diagnostice a monitorování  COVID-19 a interpretovat jejich výsledky, musíme si nejprve ujasnit subjekty, které spolu interagují: Na jedné straně je to člověk a na druhé virus, který jej napadá. Infekcí SARS-CoV-2, jím vyvolaným onemocněním COVID-19 a jejich laboratorní diagnostikou se zabývá řada dobře dostupných přehledných článků. V české literatuře jsou to např. práce Trojánka [1], Friedeckého [2] a Lochmana [3]. V následujícím textu se budeme zabývat jen jejich doplněním a komentářem. Přehledně a výstižně je tato problematika zpracována např. také Pützem a Vabretem a spol. [4, 5].

Budeme-li mluvit o člověku, musíme si ujasnit, o jakém subjektu vůbec mluvíme a zaměřit se nejen na jeho eukaryotickou část, kterou máme většinou na mysli, když o něm hovoříme, ale začít ho chápat jako superorganismus (holobiont), který se skládá nejen z této eukaryotické části, ale i z jeho viromu, mikrobiomu a dalších symbiontů, které jej osídlují [6, 7, 8]. I když není možné zabývat se zde podrobněji popisem člověka jako holobiontu a mechanismy, jakými tento superogranismus při zajišťování homeostázy funguje, jen při takovémto chápání člověka budou zřejmé závěry, které níže vyslovíme. Mluvíme-li o imunitním systému, který je jedním z homeostatických systémů, máme na mysli většinou jen imunitní systém eukaryotické části člověka. Jeho součástí jsou imunokompetentní buňky včetně T-lymfocytů a plasmatických buněk produkujících protilátky. Avšak také bakterie, které jsou součástí člověka jako holobiontu, mají svůj imunitní systém založený na CRISPR-Cas mechanismech a i viry mají mechanismy, které jim umožňují přežívat uvnitř pro ně životně důležitých buněk, ať už bakteriálních (prokaryo-tických) nebo eukaryotických, které napadají. Vše je nutno dát také do kontextu s fylogenetickým vývojem živých organismů (strom života) a uvědomit si, že i některé složky eukaryotické části organismu člověka, podílející se na udržování jeho homeostázy, jsou velmi staré, a to až stovky miliónu let. Porušení homeostázy je provázeno vždy změnou metabolismu a produkty které tuto změnu provázejí, nejsou produkty specializovaných imunokompetentních buněk. Jsou řazeny mezi složky přirozené imunity, která není sice tak specifická a účinná jako adaptivní imunita realizovaná specializovanými imunokompetentními buňkami a produkty eukaryotické části organismu člověka. Zato je rychlá a dokáže většinou zlikvidovat menší poruchy homeostázy včetně těch způsobených invadujícími viry a mikroby, aniž by to postižený jedinec zaznamenal jako onemocnění a aniž by se nastartovaly specializované mechanismy adaptivní imunity. Příkladem takovýchto agens může být CRP a C3 složka komplementu, které jsou syntetizovány v játrech [9, 10]. Vše závisí nejen na výskytu a přítomnosti homeostázu porušujících agens, ale také na jejich množství, délce jejich působení a aktuálním stavu postiženého jedince.

Invadující SARS-CoV-2 je poměrně velký jednovláknový RNA virus (30 kB), jehož virion má průměr cca 50-200 nm a obsahuje, stejně jako ostatní coronaviry, čtyři proteiny: strukturální (S, spike), obalové (E, envelope), membránové (M, membrane) a nukleokapsidové (N nucleocapsid). N proteiny nesou RNA genom a S, E a M proteiny vytvářejí spolu obal. SARS-CoV-2 tak, jako další respirační viry, vstupují do organismu člověka jako neživé částice, neschopné přežívat a množit se, dýchacími cestami, a to nejen nosem a ústní dutinou, ale také okem a porušenou kůží. Aby mohl virus přežívat a množit se, musí se dostat do hostitelských buněk, kde využívá jejich aparát a energetické zdroje pro syntézu vlastních komponent, poněvadž sám takovéto prostředky nemá. SARS-CoV-2 využívá k zachycení na buňky především tzv. „spike“ proteiny (S1 a S2), které jsou součástí jeho koruny a které jsou komplementární s angiotenzin konvertujícím enzymem 2 (ACE2) exprimovaným na napadaných hostitelských buňkách a váží se na něj [11]. ACE2 je exprimován na řadě buněk ve většině orgánů, a to v různé míře. ACE2 je přítomen ve velkém množství v buněčné membráně alveolárních plicních buněk typu II, enterocytech tenkého střeva, endoteliálních buňkách tepen a žil, i na buňkách hladkých svalů artérií většiny orgánů. Produkce mediátorové (informační) ribonukleové kyseliny, která slouží jako předpis pro produkci ACE2 (mRNA) byla nalezena rovněž v mozkové kůře, striatu, hypothalamu a mozkovém kmeni. Je produkována také makrofágy, dendritickými buňkami a neutrofily [5, 12, 13, 14-18].

Pomocí proteáz přítomných v nucleocapsidu virionu se dostává jeho RNA dovnitř buněk ve formě endosomů (ORF – open reading frames), které ji mj. chrání před ochrannými mechanismy cytosolu napadených buněk [19]. Buňky mají své mechanismy, jak rozpoznat virovou mRNA nutnou pro vytváření nových virových částic uvnitř napadených buněk od své vlastní a zabránit virové mRNA, aby po přepisu do tRNA ribozómů byla spuštěna syntéza potřebných proteinů invadujících virů [20]. Na druhé straně viry mají také své mechanismy, které způsobují, že buňky ztrácejí schopnost rozlišovat vlastní a virovou mRNA, a tak umožňují virům, aby se mohly v buňkách nekontrolovatelně množit. Buňky tak na ně ztrácejí svou imunologickou paměť [5, 15, 21].

Viry jsou vlastně parazity, ale paraziti obecně nemají zájem svého hostitele zničit. Tak dokážou některé viry v organismu přežívat v dormantních (neaktivních) formách a k jejich masivní aktivaci dochází až při porušení homeostázy napadené buňky. Pak dojde k nekontrolovatelnému množení viru, destrukci buňky a vylití velkého množství virionů do okolního prostředí. To je známo a popsáno např. u herpesvirů.  U coronavirů tyto mechanismy dnes ještě nejsou dobře popsány nebo nejsou známy vůbec.

Výše zmíněné procesy probíhají na úrovni buňky mimo aktivity klasického imunitního systému, a to jak jeho přirozené, tak adaptivní složky. Klasický imunitní systém je ovšem o těchto aktivitách napadenými buňkami informován produkcí různých metabolitů a expresí typických znaků na těchto buňkách, snaží se s touto situací vyrovnat a připravuje se na to, že k invazi parazita, v našem případě viru, a porušení homeostázy může opět dojít.

SARS-CoV-2, stejně jako většina jiných virů, bakterií, pylů a jiných částic a organismů vstupujících do superorganismu člověka přes primární ochranné barié-ry, jsou samozřejmě rozpoznávány jako cizorodé nejprve přirozenou složkou imunitního systému přítomnou na těchto ochranných bariérách. Tu představují jak buňky, tak jimi produkované sekrety. V našem případě se jedná především o buňky a sekrety respiračního (RT) a gastrointestinálního (GIT) traktu. Pokud je však množství invadujícího agens porušujícího nastavenou homeostázu velmi nízké, nemusí na ně imunitní systém reagovat (tolerance z nízké dávky). Přirozená složka IS je dána částečně geneticky, ale z velké části se vytváří a adaptuje podle prostředí, ve kterém daný jedinec žije (epigenetika). Ukazuje se, že pro její formování je u člověka rozhodující období zhruba mezi 2. – 12. rokem života. Virom jedince se však z části utváří již během jeho intrauterinního vývoje. Ve většině případů dokáže přirozená složka imunity zlikvidovat invadující agens, které rozpozná jako cizí, sama. Adaptivní imunita, která zefektivňuje imunitní odpověď, nemusí být vůbec v této fázi zapojena, i když je o poruše homeostázy informována. V každém případě výsledná reakce vždy záleží na množství invadujícho agens, době, po kterou toto agens invaduje a na stáří a stavu organismu, do něhož invaduje.  Je samozřejmě podmíněna také vrozeným genetickým vybavením, jak již bylo řečeno, a aktuálním stavem postiženého organismu.

T-lymfocyty, které jsou řídícími buňkami imunitního systému a protilátky, které jsou součástí adaptivní imunitní odpovědi, vstupují do hry až v dalším kroku reakce na invadující agens. Celá imunitní odpověď směřuje k obnovení porušené homeostázy, a to s určitým zpožděním. Podaří-li se imunitnímu systému invadující agens eliminovat již nástroji přirozené imunity na jeho vstupních cestách (v našem případě epitelech sliznic RT a GIT, oku, porušené kůže), nemusí být adaptivní složka imunity, jejíž součástí jsou i protilátky, vůbec aktivována. To se děje zřejmě především při infekci nízkými dávkami infekčního agens. Tak se stává, a je zřejmě dost běžné, že SARS-Cov-2 je prokázán v nasopharyngeálních stěrech (pacient je infekční, poněvadž může šířit volné virové částice dechem do okolí), ale sám postižený nemusí mít žádné příznaky onemocnění, ani si nemusí vybudovat adaptivní imunitní paměť založenou na paměťových lymfocytech a protilátkách a dokonce ani přirozenou imunitní paměť [22-24]. Při opakovaném styku s antigenem, byť v nízkých dávkách, však dochází postupně i k aktivaci adaptivní imunity včetně její paměti realizované také IgG protilátkami.

Lidská populace je zřejmě v různých regionech promořena také minimálně několika dalšími kmeny coronavirů, které ale nezpůsobují žádná závažnější onemocnění, a proto není u nás běžně prováděn jejich PCR průkaz ani nepřímá sérologická identifikace jimi způsobené infekce. Čtyři běžné lidské kmeny coronaviru (HKU1, NL63, OC43 and E229) jsou přítomny na všech kontinentech a způsobují celosvětově 10-20 % respiračních infekcí. Jejich mortalita za leden a únor 2020 v zemích OECD byla 0,8 % a u SARS-CoV-2  pak 1,3 %. Rozdíl je statisticky nevýznamný [21, 25].

Při průkazu virového agens ze stěrů nosohltanu je jistě klíčovou záležitostí správné provedení odběru. Je zapotřebí uvědomit si, že řada jedinců nedýchá převážně nosem, ale významná část dýchání je realizována také ústy. Výsledky vyšetření mohou být a jsou samozřejmě ovlivněny také výběrem pro SARS-CoV-2 specifických, resp. charakteristických segmentů RNA a celou metodikou stanovení. Výsledky by měly být vydávány v kvantitativním formátu udávajícím cyklus, v němž se objevila pozitivita (ct), aby šlo odhadnout, jak masivně byl jedinec virem infikován. Záleží také na tom, jak je nastavena hranice pozitivity. V každém případě si je nutno uvědomit, že toto vyšetření ukazuje stav v okamžiku odběru. Při interpretaci výsledku z hlediska prognózy testovaného jedince záleží na tom, v jakém prostředí se bude jedinec po provedení odběru pohybovat. Bude-li se pohybovat v prostředí, v němž se virus bude nacházet, vyšetření provedené o několik hodin později může přinést u negativních vzorků z prvního vyšetření pozitivní výsledek z odběru následujícího. Stejně tak, byl-li jedinec nakažen jen nízkou dávkou viru, která nemusí vyvolat žádné následné příznaky onemocnění a výsledek vyšetření je v těchto případech jen slabě pozitivní, v odběru následujícím, provedeném již záhy po tomto odběru, nemusí být již virus prokázán. Nezanedbatelné jsou pravděpodobně i genetické predispozice (vnímavost) vyšetřovaného jedince vůči infekci SARS-CoV-2, jak již bylo řečeno.

Co se týče sérologického vyšetření, je pro správnou interpretaci výsledků nutné znát, zda několik dní před odběrem krve, popř. i dříve, měl vyšetřovaný jedinec některé příznaky objevující se u infekce COVID-19, zda a kdy bylo u něj provedeno vyšetření RT-PCR na SARS-CoV-2 ze stěrů z nosohltanu nebo z jiného materiálu (krev, stolice, moč) a s jakým výsledkem. Bohužel ne všichni výrobci testovacích souprav pro detekci a stanovení protilátek proti SARS-CoV-2 (především rychlotestů), specifikují dostatečně přesně nebo vůbec cílové antigeny, na které je přítomnost protilátek testována. Rychlotesty nedovolují navíc kvantifikaci těchto protilátek. To, a také různě nastavená klinická citlivost testů, přispívá také k dosahování různých výsledků různými diagnostiky. Potvrzuje se, že protilátky (především IgG) se budou tvořit jen u onemocnění s vleklejším a těžším průběhem onemocnění, u bezpříznakových jedinců, nebo u jedinců s jen lehkým průběhem onemocnění nemusí k jejich tvorbě vůbec dojít. Probíhá-li infekce přes sliznice, a to je i případ respiračních infekcí, budou v prvních fázích infekce tvořeny nejen IgM protilátky, ale v hojné míře především IgA protilátky. Ty se budou realizovat na sliznicích ve formě dimeru sekrečního IgA (sIgA). Jejich stanovování v séru je jen odrazem této tvorby a důvodů jejich produkce. IgM protilátky jsou protilátky tvořené v časné fázi infekce realizované 
uvnitř organismu. K tomu může docházet při porušení slizničních epiteliálních povrchů na vstupních cestách viru jak v respiračním, tak gastrointestinálním traktu. O tom, zda stanovované protilátky mohou skutečně virus i neutralizovat, se je však nutno přesvědčit funkčním virus-neutralizačním testem [4, 20, 25, 26, 27, 28]. Tvorba protilátek ukazuje na to, že se virus dostal dovnitř organismu a může se realizovat na všech buňkách, které pro něj obsahují receptory. Exprese ACE2 širokou paletou různých tkání a orgánů vysvětluje, proč mohou být projevy COVID-19 tak různorodé a nemusejí se vztahovat jen na respirační trakt [12, 13].

Nezvládaná infekce SARS-Cov-2 je provázena silným zánětem. Proto se v ní vyskytují ve zvýšené míře silně koncentrace analytů charakteristických pro zánět, ať již to je CRP (protein reagující s karbohydráty), prokalcitonin, presepsin, interleukin 6 (IL-6), komplement (nejlépe stanovením jeho terminálního komplexu - TCC) aj. Ty u běžných viróz tak zvýšené nebývají. Pokud virus napadá epiteliální buňky cévního systému, bývají zvýšené také koncentrace analytů spojených se systémem krevního srážení, jako jsou D-dimery. Řada těchto analytů a znaků může pomoci i při prognózování pacientů 
[29, 30]. Aby je mělo smysl vyšetřovat, je nezbytné získat výsledky co nejdříve, a proto je zapotřebí odebrané vzorky vyšetřit také co nejdříve po odběru, nejlépe individuálně a statimově. Proto jsou pro jejich stanovení vhodné metody realizované na analyzátorech nebo rychlotesty. Klasické ELISA testy prováděné na mikrotitračních destičkách v sériích jsou většinou ekonomicky a pracovně pro statimový režim zpracovávající navíc individuální nebo jen malé série vzorků nevýhodné. Dostupné se stávají také sérologické testy pro stanovení antigenů SARS-CoV-2. Je zapotřebí si uvědomit, že tyto testy jsou a zřejmě vždy budou méně citlivé než testy založené na průkazu virové DNA amplifikačními metodami molekulární genetiky.

Co říci závěrem? Klíčová pro indikaci a interpretaci testů pro diagnostiku COVID-19 je vždy znalost příznaků, které by měly onemocnění provázet, data jejich nástupu, jakož i vymizení a průběh onemocnění ve vztahu k datu odběru vzorků pro vyšetření a komorbidity, kterými aktuálně vyšetřovaný jedinec trpí [31-33]. 

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.

Do redakce došlo 18. 6. 2020.

Adresa pro korespondenci

RNDr. Ivo Lochman, CSc.

SPADIA LAB, a.s.

Dr. Martínka 7

700 30 Ostrava

e-mail: ivo.lochman@spadia.cz