Prima-1 a APR-246 v léčbě nádorových onemocnění

Súhrn

Východiska:

Nejčastěji mutovaným proteinem u nádorových onemocnění je p53 a jednou z možností protinádorové terapie je reaktivace jeho neaktivní mutované formy. Cílem reaktivací je nastartování apoptózy a potlačení maligního fenotypu. Látkou schopnou reaktivovat mutantní p53 je Prima-1 nebo její metylovaná forma Prima-1^Met (označovaná také jako APR-246). Jedná se o nízkomolekulární látky, které byly testovány u řady nádorových buněčných linií, ale i na samotných nádorech nesoucích mutantní p53.

Cíl:

Cílem článku je shrnout dosavadní poznatky o mechanizmu působení Prima-1 a APR-246, popsat jejích využití v protinádorové terapii a zároveň shrnout výsledky klinických studií, jimiž APR-246 aktuálně prochází.

Závěr:

Z dosavadních experimentů vzešla řada protichůdných výsledků upozorňujících na fakt, že mechanizmus účinku látek není stále zcela objasněn. S určitostí jen víme, že Prima-1 i APR-246 indukuje apoptózu nádorových buněk. Specificita látek k mutantnímu p53 je však velmi variabilní a odvíjí se především od použitého buněčného modelu a typu mutace. Kromě samotné reaktivace p53 jsou pravděpodobně ovlivněny i další buněčné mechanizmy, které cytotoxický účinek látek modifikují.

Klíčová slova:

Prima-1 (MET) – APR-246 – Prima-1 – reaktivace p53 – apoptóza

Úvod

Protein p53 je nádorový supresor, jehož klíčovou funkcí je regulace buněčného cyklu a apoptózy v odpovědi na různé druhy buněčného stresu. Jako „strážce genomu“ zamezuje kumulaci mutací, a tím přispívá k omezení vzniku maligního fenotypu. U téměř poloviny nádorových onemocnění dochází k mutacím TP53. Sekvenováním exomů více než 3 000 vzorků u 12 nejčastěji se vyskytujících lidských nádorů byla zjištěna přítomnost mutace TP53 u 42 % analyzovaných vzorků, nejčastěji pak u karcinomu vaječníku a endometria, nejméně naopak u karcinomu ledvin [1]. U nádorů s velmi špatnou prognózou, jako jsou „high-grade“ serózní karcinom vaječníku, triple negativní karcinom prsu, nádor jícnu či plic se uvádí přítomnost mutované formy p53 (p53mut) dokonce až v 80 % případů [2]. Nádory s p53mut jsou obvykle charakterizovány horší prognózu, zvýšenou invazivitou a metastazováním.

Nejčastějším typem mutací TP53 jsou bodové mutace, které mění smysl kodonu a jejichž výsledkem je substituce jedné aminokyseliny za jinou. Téměř 90 % z nich je lokalizováno v DNA vazebné doméně p53 [3], kde přispívají k nesprávnému sbalování proteinu, znemožňují jeho vazbu na DNA cílových genů a omezují tak jeho nádorově supresorovou funkci v buňce [4]. Nemutovaná forma p53 (p53wt) se v normálních buňkách vyskytuje ve velmi nízkých hladinách, a to z důvodu regulované degradace E3-ubikvitin ligázou MDM2. Naopak v případě p53mut je interakce s MDM2 narušená a vede k jeho omezené degradaci a kumulaci v buňkách [5]. p53mut může navíc získat nové onkogenní vlastnosti přispívající k přežití nádorových buněk nebo ke vzniku rezistence k chemoterapii [6].

V současné době je vyvíjeno značné úsilí získat nové látky specificky se vázající na p53mut, schopné vyvolat buněčnou apoptózu či podpořit další mechanizmy potlačující růst a proliferaci buněk nebo alespoň zvýšit citlivost buněk k chemoterapeutikům. Mezi látky, které byly již v minulosti testovány a jejichž antiproliferativní účinek je spojen s reaktivací p53, patří např. MIRA-1 [7], CP 31398 [8], PhiKan083 [9], ale také Prima-1 (p53 reactivation and induction of massive apoptosis)  a APR-246 [10,11].

Mechanizmus působení Prima-1 a APR-246

Prima-1 byla identifikována v roce 2002 v rámci screeningu knihovny nízkomolekulárních látek amerického Národního onkologického institutu (National Cancer Institute – NCI). Jeho cílem bylo nalézt látky schopné změnit nefunkční konformaci p53mut na funkční p53wt a tím reaktivovat funkci p53 jako nádorového supresoru schopného potlačit růst nádorů [12]. Chemicky se jedná o 2,2-bis (hydroxymethyl) -1-azabicyklo[2,2,2]oktan-3-on (obr. 1) [10,12]. Analýzou strukturních analogů byla poté odhalena metylovaná forma označující se jako Prima-1^Met neboli APR-246, chemicky 2-hydroxymethyl-2-methoxymethyl-aza-bicyklo[2,2,2]oktan-3-on (obr. 1). Biologická aktivita obou sloučenin je dána konverzí na methylen quinuclidinon (MQ), ke které dochází spontánně při fyziologickém pH (obr. 1) [13]. Jeho struktura obsahuje dvojnou vazbu udělující MQ slabé elektrofilní vlastnosti a umožňující mu fungovat jako Michaelův akceptor, tzn. preferenčně interagovat se slabými nukleofily. Slabé nukleofily jsou v buněčném prostředí zastoupeny zejména thiolovými skupinami na cysteinech obsažených ve strukturách proteinů či redoxních regulátorů. V případě p53 se MQ kovalentně váže na centrální část proteinu, která obsahuje 10 cysteinových reziduí [13]. Počítačovou analýzou strukturních modelů p53 byla identifikována vazebná kapsa obsahující cysteiny Cys124, Cys135 a Cys141 [14]. In vitro studie pak prokázaly, že primární roli při reaktivaci p53mut pomocí Prima-1 hraje alkylace Cys124 [14], která je spouštěčem alkylací ostatních cysteinů destabilizovaného p53, které jej nakonec termodynamicky uvězní v transkripčně aktivní konformaci [15] a navrátí mu schopnost transaktivovat cílové geny. Vazbou MQ na Cys277 a Cys124 dochází k reaktivaci p53 nesoucího mutaci v R175H. Alkylace pouze Cys277 zvyšuje termostabilitu p53wt a p53 nesoucích mutace R175H a R273H [16]. Dále bylo zjištěno, že Prima-1 zvyšuje expresi chaperonu Hsp90α, který také může napomáhat správnému sbalování p53 [17].

In vitro a in vivo studie u různých nádorových modelů prokázaly schopnost Prima-1 i APR-246 indukovat apoptózu [18–20] a zástavu buněčného cyklu [19,20]. Větší cytotoxicitu obecně vykazuje APR-246, a to především díky vyšší lipofilitě a schopnosti lépe penetrovat buněčnou membránou [11,21]. Reaktivace p53 pomocí Prima-1 či APR-246 byla studována především v souvislosti s bodovými mutacemi měnícími smysl kodonu. Reaktivační efekt obou látek byl ale také prokázán u buněčných linií s TP53 nesoucích bodové mutace vedoucí ke vzniku zkrácených forem proteinu či mutace způsobující posun čtecího rámce [22]. V současné době se objevují studie upozorňující na cytotoxický efekt obou látek u buněčných linií s deletovanou či nemutovanou formou p53, tzn. na cytotoxický efekt nezávislý na mutaci v p53 [22–24].

Reaktivace p53 způsobuje indukci apoptózy prostřednictvím vnitřní mitochondriální dráhy, a to regulaci pro-apoptotických a anti-apoptotických proteinů rodiny Bcl-2. Řada publikací popsala reaktivaci apoptózy indukovanou Prima-1 nebo APR-246, avšak s rozdílnými výsledky v expresi pro-apoptotických proteinů PUMA, BAX a APAF-1. U plicních buněčných linií APR-246 indukovala zvýšení aktivace kaspázy-2 a zvýšení exprese PUMA a BAX [25]. V jiné studii bylo prokázáno, že APR-246 indukuje expresi proteinů APAF-1 a PUMA, nikoli však BAX [26]. Naopak indukce apoptózy po expozici Prima-1 nebo APR-246 nebyla zjištěna u nemalobuněčného karcinomu plic (non-small-cell lung cancer – NSCLC) [27], rakoviny prostaty [28] nebo sarkomu měkkých tkání [29]. V této souvislosti nebyly u p53wt ani p53mut detekovány změny buněčného cyklu [27,28], přítomnost apoptotických tělísek [28] ani nedocházelo ke štěpení PARP [27,29], které by jinak poukazovalo na aktivaci apoptotických mechanizmů. U nádorových linií sarkomu měkkých tkání bylo zjištěno, že APR-246 aktivuje signální dráhu JNK [29] a tím spouští apoptózu v závislosti na mutantním stavu p53 u buněčných linií odvozených od nádorů tlustého střeva [30]. V protikladu k těmto studiím bylo ovšem také publikováno, že indukce apoptózy je podmíněná inhibicí signální dráhy JNK u linií odvozených od nádorů prsu [31]. Rozdílné výsledky tedy upozorňují na nejasnosti v mechanizmu účinku Prima-1 i APR-246 a poukazují na možnou přítomnost dalších elementů či mechanizmů, které by mohly ovlivňovat jejich cytotoxickou aktivitu.

Procesy indukované Prima-1 nebo APR-246 nezávislé na přítomnosti p53mut

Jak bylo zmíněno výše, cytotoxicita APR-246 i Prima-1 se může projevit bez ohledu na přítomnost p53mut. Mimo reaktivaci p53mut mají Prima-1 i APR-246 schopnost aktivovat procesy vedoucí k indukci apoptózy, které jsou však na p53 proteinu nezávislé (schéma 1). APR-246 je inhibitorem thioredoxin reduktázy (TrxR1), enzymu katalyzujícího redukci thioredoxinu. MQ se váže na selenocysteiny obsažené ve struktuře TrxR1, čímž mění jeho funkci z reduktázy na NADPH oxidázu vedoucí ke zvýšené produkci reaktivních forem kyslíku (reactive oxygen species – ROS) a tím k indukci apoptózy [23]. Inaktivace TrxR1 může být podpořená společným použitím APR-246 a inhibitorů PARP-1 [32]. MQ se také může vázat na cysteiny glutationu a tím snížit jeho intracelulární hladinu a podpořit vznik ROS [33]. Zvýšená hladina ROS následně indukuje autofagii, jak bylo prokázáno u nádorových buněk exprimujících p53mut i p53wt [34]. Dále bylo zjištěno, že p53 vykazuje modulační efekt na autofagii vyvolanou Prima-1 u buněk s p53wt. Prima-1 omezuje autofagii, zatímco v přítomnosti p53mut autofagii spouští a podporuje [34]. Proteomická analýza navíc ukázala, že kromě proteinů vnitřní mitochondriální apoptotické dráhy jsou do mechanizmu působení Prima-1 zapojeny také proteiny anaerobní glykolýzy [35], které naopak můžou napomáhat nádorovým buňkám bránit se apoptotickým signálům.

Dalším mechanizmem přispívajícím k cytotoxicitě Prima-1 je stres endoplazmatického retikula, tzv. UPR (unfolded protein response) (schéma 1). K aktivaci UPR dochází při kumulaci chybně sbalených proteinů. Buňka se snaží obnovit normální stav tím, že degraduje tyto proteiny a zároveň zvyšuje expresi molekulárních chaperonů. V případě selhání těchto regulačních mechanizmů je spuštěna apoptóza. Prima-1 zvyšuje expresi chaperonů, a to zejména proteinů teplotního šoku Hsp70 [24] a Hsp90 [17]. Zvyšuje expresi CHOP [24], který spouští apoptózu indukovanou UPR [36]. Navíc bylo potvrzeno, že deplece CHOP výrazně snižuje cytotoxicitu Prima-1 [24].

Přestože je APR-246 nejčastěji zmiňovaná v souvislosti s reaktivací p53, její efekt byl prokázán rovněž u ostatních členů proteinové rodiny p53 (p63 a p73). Proteiny rodiny p53 sdílejí stejnou organizační strukturu zahrnující N-terminální transaktivační doménu, DNA-vazebnou doménu a C-terminální oligomerizační doménu. Díky částečné homologii v oligomerizační doméně mohou tvořit heterotetramery a vysoká homologie v DNA-vazebné doméně indikuje jejich schopnost vázat se také na stejné cílové geny. Všechny geny kódující proteiny rodiny p53 exprimují řadu izoforem. Díky existenci alternativních promotorů či počátků translace vznikají N-koncově zkrácené izoformy, díky různým místům sestřihu pak C-koncově zkrácené izoformy. N-koncově nezkrácené izoformy TAp63 a TAp73 pak vykazují největší homologii s p53 a rovněž se uplatňují v indukci apoptózy a zástavě buněčného cyklu [37]. Na rozdíl od TP53 hrají TP63 a TP73 roli zejména v ontogenezi a v nádorech jsou mutovány jen velmi zřídka [38]. Mutace v TP63 jsou např. hlavní příčinou EEC (ectrodactyly-ectodermal dysplasia-clefting) syndromu, charakteristického ektrodaktylií, ektodermální dysplazií a rozštěpy rtu nebo patra. APR-246 je schopná reaktivovat R240W a R304W mutantní formy TAp63γ, které odpovídají hot-spot mutacím R175H a R273H p53, a to u keratinocytů [39] a také u indukovaných pluripotentních buněk pacientů s EEC syndromem [40]. Dále bylo zjištěno, že APR-246 je schopná obnovit pro-apoptotickou funkci mutantních forem TAp63γ a TAp73β u nádorových buněk [41]. APR-246 může navíc indukovat p73-dependentní apoptózu bez ohledu na mutaci p53 [42].

Cytotoxicita a terapeutické využití Prima-1 a APR-246

Distribuce látky do jednotlivých orgánů byla testována pomocí intravenózní aplikace radioaktivně značené Prima-1. Bylo zjištěno, že Prima-1 není schopná překonávat hemoencefalickou bariéru, akumuluje se ale v ledvinách a je vylučována močí [43].

Prima-1 i APR-246 byly testovány u řady lidských malignit a cytotoxický účinek se lišil v závislosti na použité nádorové linii či nádoru (IC₅₀ v rozmezí 0,75–200 µl) [44]. Rozdílná cytotoxicita APR-246 byla pozorovaná u buněčných linií nesoucích stejnou mutaci v p53, ale i u vzorků získaných ze stejného nádoru, ale v různých fázích histopatologické diferenciace (odlišný „grading“) [18]. Cytotoxický účinek APR-246 se neprojevil u vzorků získaných od pacientů s chronickou B lymfocytární leukemií (B CLL) nesoucích hemizygotní delece v TP53 [45]. Omezený nebo téměř žádný cytotoxický efekt Prima-1 nebyl pozorován u nenádorových buněk krve [42,45] a fibroblastů [11,46].

Cytotoxická aktivita APR-246 byla testovaná in vitro a ex vivo v rámci mnoha studií, a to samostatně nebo v kombinaci s běžně používanými cytostatiky. V léčbě řady karcinomů se uplatňují sloučeniny platiny, které vytvářejí kovalentní vazby s purinovými bázemi v DNA, čímž omezují její replikaci a aktivují signální dráhu p53. Bylo zjištěno, že APR-246 obnovuje citlivost k cisplatině u buněk získaných z high-grade serózních ovariálních (HGSO) karcinomů nesoucích rezistenci k cisplatině [47,48]. Synergický efekt APR-246 a cisplatiny byl pozorován u nádorových buněk získaných z ascitu HGSO karcinomů nesoucích v DNA-vazebné doméně mutaci v p53 měnící smysl kodonu, ale i u vzorků nesoucích p53wt nebo zkrácenou formu p53 [48]. Synergický efekt Prima-1 anebo APR-246 s cisplatinou byl dále zjištěn u buněčných linií kolorektalního karcinomu [11], adenokarcinomu plic [11], karcinomu hlavy a krku [46] a karcinomu slinivky břišní [49]. Na xenogenním modelu in vivo karcinomu plic [7], jícnu [22] a vaječníku [47] byl také potvrzen synergický účinek Prima-1 nebo APR-246 a cisplatiny. Další látkou znemožňující replikaci DNA vazbou na oba řetězce (interkalací) nebo inhibicí topoizomerázy II je doxorubicin. Synergický efekt s Prima-1 nebo APR-246 in vitro a ex vivo byl pozorován u karcinomu vaječníku [47,48], štítné žlázy [50], slinivky břišní [49], prsu [17] a mnohočetného myelomu [42]. V současné době je APR-246 testovaná v kombinaci s karboplatinou a pegylovaným lipozomálním doxorubicinem v klinické studii fáze Ib/II u HGSO karcinomu (NCT02098343, NCT03268382). V klinické studii NCT0299989 fáze Ib/II je APR-246 testovaná v kombinaci s cisplatinou a 5-fluorouracilem při léčbě pokročilého a metastazujícího karcinomu jícnu s mutací v p53.

Další látkou testovanou v kombinaci s APR-246 je olaparib, který se řadí do skupiny inhibitorů PARP regulujících reparaci poškozené DNA. Vyřazením mechanizmu opravy dochází ke zvýšení citlivosti nádorových buněk k léčbě. Silný synergický efekt s APR-246 byl pozorován u NSCLC, a to bez ohledu na přítomnost mutace v p53 [51]. APR-246 navíc zvýšila citlivost k olaparibu u buněk s p53mut, které byly k olaparibu rezistentní [51]. Synergický efekt s olaparibem byl pozorován i u prsních nádorových linií s p53mut [52].

p53mut se příliš často nevyskytuje v kožních nádorech (cca v 17 %) a pravděpodobně nehraje výraznější roli při rozvoji maligního melanomu (MM). Přesto byl zjištěn synergický efekt u kombinovaného použití APR-246 a vemurafenibu. Vemurafenib je specifický inhibitor mutace BRAF^V600E, která má za následek zvýšení aktivity BRAF kinázy vedoucí k nekontrolovanému buněčnému růstu [53]. K mutaci BRAF dochází přibližně u 50 % kožních melanomů, z nichž právě mutace V600E je nejčastější [54]. Pokud není gen BRAF mutovaný, není ani vemurafenib účinný. APR-246 v kombinaci s vemurafenibem potlačuje přirozenou i získanou rezistenci k tomuto léčivu. APR-246 zvyšuje citlivost nádorových buněk k vemurafenibu bez ohledu na přítomnost mutace v p53, což bylo potvrzeno u buněk MM nesoucích  BRAF^V600E, v 3D kultuře, ale i na xenogenním modelu in vivo [26,55]. Dalším kompetitivním inhibitorem mutace BRAF, který selektivně inhibuje kinázu BRAF^V600E, je dabrafenib. V současné době probíhá klinická studie NCT03391050 fáze Ib/II, jejímž cílem je posoudit bezpečnost a léčebné účinky APR-246 v kombinaci s dabrafenibem u pacientů s neresekovatelným a/nebo metastazujícím melanomem s pozitivní mutací BRAF.

Kombinovaný účinek byl testován u APR-246 a bortezomibu. Jedná se o inhibitor proteazomu, ve kterém dochází k odbourávání nepotřebných proteinů. Inhibicí proteazomu dochází k omezení proteolýzy proteinů podílejících se na regulaci buněčného cyklu a apoptózy. Kombinovaný účinek obou látek byl prokázán u mnohočetného myelomu bez závislosti na přítomnosti mutace v p53 [24].

V první ukončené klinické studii (NCT00900614) byla APR-246 podávána v monoterapii s eskalací dávky pacientům s hematologickými malignitami (n = 15) a pacientům s karcinomem prostaty (n = 7), tedy typem solidního nádoru s vysokým zastoupením p53mut. Studie prokázala klinicky dobrou toleranci k léku a příznivý farmakokinetický profil. Maximální tolerovaná dávka byla stanovená na 60 mg/kg. Vedlejší negativní účinek toxicity limitující dávku představovala zvýšená aktivita jaterních transamináz ALT/AST, která u jednoho pacienta dosahovala stupně 3–4. Nejčastějšími limitujícími toxickými účinky pak byly poruchy centrální nervové soustavy jako únava, dezorientace, závrať a bolest hlavy dosahující stupně 1 nebo 2. K projevům docházelo již v průběhu či krátce po infuzi, ale poruchy se jevily jako reverzibilní. Farmakokinetika látky vykazovala rozdíly mezi jednotlivými pacienty a nebyla závislá na dávce ani čase, biologický poločas rozpadu (t_1/2) byl stanoven na 4–5 hod [56].

Poslední probíhající klinická studie NCT03072043 fáze Ib/II je zaměřená na léčebné účinky APR-246 v kombinaci s azacitidinem. Cílem je zjistit, zda tato kombinovaná terapie zlepšuje celkové přežití pacientů s hematologickými maligními onemocněními, jako jsou akutní a chronická myeloidní leukemie, myelodysplastický syndrom a myeloproliferativní choroby.

APR-246 byla také testovaná v kombinaci s radioterapií. Bylo zjištěno, že záření senzitizuje nádorové buněčné linie prostaty nesoucí p53mut a linie s deletovaným p53. Žádný účinek neměla APR-246 v kombinaci se zářením na nádorové linie nesoucí p53wt a na lidských fibroblastech [28].

Závěr

Prima-1 a APR-246 jsou látky vykazující protinádorový účinek u řady nádorových onemocnění. Hlavním mechanizmem účinku v buňce je indukce apoptózy. Obě látky zvyšují expresi genů zapojených do kontroly buněčného cyklu a apoptózy v nádorových buňkách nesoucích p53mut i p53wt. V posledních letech se ukazuje, že mohou účinně indukovat procesy, které jsou na aktivitě p53 nezávislé, čímž se rozšiřují možnosti jejich klinického využití. Cytotoxická aktivita látek byla testovaná in vitro u řady nádorových linií a na xenogenních modelech in vivo, a to v monoterapii nebo v kombinaci s běžně používanými cytostatiky. V kombinaci s jinými léčivy byl velmi často zjištěn synergický účinek. Látky navíc zvyšují citlivost nádorových buněk k danému cytostatiku, dokonce napomáhají překlenout rezistenci k použitému léčivu, jejíž vznik velmi často přispívá k selhání protinádorové léčby. V kombinaci s chemoterapií či ionizujícím zářením by obě tyto látky v budoucnosti mohly nabídnout nové možnosti pro léčbu agresivnějších typů nádoru.

Práce byla podpořena projektem MŠMT – NPU I – LO1413.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Pavlína Zatloukalová, Ph.D.

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7 656 53 Brno

e-mail: pavlina.zatloukalova@mou.cz

Přijato: 16. 07. 2018