Využití sekvenování nové generace v analýze cirkulujících mikroRNA jako prediktivních biomarkerů u pacientů s lokálně pokročilým karcinomem rekta

Souhrn

Východiska: MikroRNA (miRNA) jsou krátké nekódující RNA podílející se na posttranskripční regulaci genové exprese. Jsou esenciálními regulátory fyziologických procesů, podílejí se na patogenezi mnoha onemocnění a jejich deregulace byla prokázána u řady nádorových onemocnění vč. karcinomu rekta. Cirkulující miRNA přítomné v krevní plazmě by mohly být vhodnými kandidáty na neinvaziní prediktivní biomarkery odpovědi na neoadjuvantní chemoradioterapii u pacientů s lokálně pokročilým karcinomem rekta. Předkládaná pilotní studie se zabývá využitím sekvenování nové generace k analýze cirkulujících miRNA.

Materiál a metody: K analýze miRNA expresních profilů byly použity vzorky RNA izolované z krevní plazmy pacientů odebrané v době TNM restagingu po neoadjuvantní chemoradioterapii, a párové vzorky RNA z plazmy odebrané před zahájením neoadjuvantní chemoradioterapie. K přípravě sekvenčních knihoven bylo využito kitu, který do knihoven implementuje univerzální molekulární index, jenž napomáhá citlivějšímu oddělení biologického šumu při analýze dat. Sekvenční data byla zpracována multidimenzionálními biostatistickými přístupy.

Závěr: Byl stanoven expresní profil miRNA u pacientů s karcinomem rekta, který umožňoval odlišit pacienty s různou léčebnou odpovědí na neoadjuvantní chemoradioterapii.

Klíčová slova:

karcinom rekta – prediktivní biomarker

Východiska

Kolorektální karcinom je třetí nejčastější nádorové onemocnění celosvětově a druhá nejčastější příčina úmrtí spojená s nádorovým onemocněním dospělé populace. ČR se bohužel řadí mezi státy s nejvyšší incidencí kolorektálního karcinomu a karcinomu rekta a rektosigmoideální junkce (dále již jen jako karcinom rekta) tvoří přibližně 40 % všech případů kolorektálního karcinomu [1,2]. Zhruba polovina pacientů s karcinomem rekta je diagnostikována v lokálně pokročilém stadiu onemocnění, které představuje tumory v klinickém stadiu II a III definované jako cT3 a cT4 a/nebo tumory s metastatickým postižením regionálních uzlin. Na rozdíl od karcinomů lokalizovaných v tlustém střevě karcinomy lokalizované v oblasti rekta obecně vykazují vyšší invazivitu a častější relaps po chirurgickém zákroku. Tudíž tato onemocnění vyžadují rozdílné léčebné postupy [3]. Podání neoadjuvantní chemoradioterapie (NCHRT) před chirurgickým výkonem významně zlepšilo prognózu pacientů a jejich celkovou dobu přežívání. Cílem NCHRT je pokud možno co nejvíce zmenšit rozsah samotného nádoru, a tím pádem umožnit co nejvíce záchovnou operaci. Bohužel odpověď na léčbu se mezi jednotlivými pacienty výrazně liší. Zatímco někteří pacienti dosáhnou kompletní patologické odpovědi na léčbu nebo alespoň výrazného zmenšení tumoru, část pacientů vykazuje primární rezistenci vůči NCHRT a je tak zbytečně vystavována toxickým účinkům léčby. Stav postižení pacientů po NCHRT a před operací je v dnešní době založen výhradně na zobrazovacích metodách. Ty ale nedosahují dostatečné citlivosti. Proto je komplikované přesně určit TNM stadium v době restagingu [4]. Přídavný biomarker by mohl výrazně zpřesnit ycTNM klasifikaci či příp. již předem určit, zda pacient z léčby bude profitovat či ne. MikroRNA (miRNA) jsou krátké nekódující RNA schopné posttranskripční regulace genové exprese. Jejich přítomnost byla prokázána i v tělních tekutinách, což je předurčuje k využití jako neinvazivních biomarkerů. MiRNA navíc vykazují výjimečnou stabilitu v tělních tekutinách a je možné je studovat pomocí konvenčních metod molekulární biologie [5,6]. Nicméně studium expresních profilů z tělních tekutin je technologicky náročné a přináší mnoho výzev. Tato studie se zabývá využitím metody sekvenování nové generace pro stanovení globálního miRNA profilu krevní plazmy pacientů s karcinomem rekta, kteří profitovali z NCHRT, a pacientů, kteří neměli z léčby dostatečný benefit.

Materiál a metody

TNM klasifikace nádoru byla stanovována v období před terapií (klinický staging TNM – cTNM), po neoadjuvantní terapii (ycTNM) a po samotné resekci nádoru (patologický staging TNM – pTNM). Všichni pacienti zařazení do studie podepsali informovaný souhlas. Z odebraných vzorků krevní plazmy byla izolována celková RNA obohacená o frakci krátkých RNA pomocí miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen). Čistota a kvantita získané RNA byly stanoveny spektrofotometricky a fluorimetricky. K analýze miRNA expresních profilů krevní plazmy byly použity vzorky RNA z plazmy odebrané pacientům v době ycTNM restagingu (56), a párové vzorky RNA z plazmy odebrané pacientům před zahájením NCHRT v době cTNM (40). K analýze miRNA expresních profilů byl použit Qiaseq miRNA Library Kit (Qiagen), který umožňuje přípravu miRNA obohacených cDNA knihoven, a tudíž daleko citlivější analýzu globálního miRNA profilu. Příprava tímto způsobem zahrnuje použití univerzálních molekulárních indexů, které také umožňují odstranění problému s extrémní abundancí miR-486-5p ve vzorcích krevní plazmy. Ta je běžným kontaminantem, s nímž se dnešní sekvenování nové generace krevního séra a plazmy potýká. Kvalita cDNA knihoven byla stanovována pomocí přístroje TapeStation 2200 System (Agilent) a Qubit^® 2.0 Fluorimeter (Life Technologies). Sekvenování nové generace bylo provedeno za použití přístroje NextSeq 500/550 (Illumina) a chemie High Output Kit v2, 75 cycles (Illumina). Expresní data byla analyzována pomocí online nástroje Chimira a získaná data byla statisticky zhodnocena pomocí nástroje Bioconductor edgeR a balíčku DESeq2.

Výsledky

Byly srovnány expresní profily získané sekvenováním nové generace RNA izolované z krevní plazmy odebrané před terapií. Pacienti byli rozděleni do skupin s dobrou odpovědí na léčbu (stupeň regrese nádoru [tumor regression grade – TRG] 3 + 4) a špatnou nebo žádnou odpovědí na léčbu (TRG 0 + 1 + 2). Pomocí statistické analýzy bylo takto identifikováno 52 miRNA s významně deregulovanou expresí (p < 0,05). Celkem 21 miRNA vykazovalo zvýšenou expresi (např. hsa-miR-450a-1-3p, hsa-miR-511-5p, hsa-miR-937-3p, hsa-miR-1233-5p) a 31 miRNA vykazovalo sníženou expresi (např. hsa-miR-320d, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-10a-3p, hsa-miR-206, hsa-miR-200a-5p) ve vzorcích krevní plazmy pacientů s TRG 0 + 1 + 2 oproti vzorkům pacientů s TRG 3 + 4. Při srovnání profilů vzorků plazmy odebraných po terapii v době ycTNM restagingu a rozdělených do skupin pacientů s metastatickým postižením uzlin (pN+) a pacientů bez postižení uzlin (pN−) bylo identifikováno 65 miRNA s významně rozdílnou expresí (p < 0,05), 37 se zvýšenou (např. hsa-miR-192-5p, hsa-miR-143-3p, hsa-miR-196a-5p, hsa-miR-217-5p) a 28 se sníženou (např. hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-383-5p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-509-3p) ve vzorcích pacientů pN+ oproti vzorkům pacientů pN−. Při analýze expresních profilů vzorků plazmy odebraných po terapii a rozdělených do skupin pacientů s pT3 a pT1 + pT2 bylo nalezeno 58 miRNA s rozdílnou expresí (p < 0,05), 37 miRNA se zvýšenou expresí (např. hsa-miR-508-3p, hsa-miR-187-5p, hsa-miR-512-3p, hsa-miR-214-5p) a 21 miRNA se sníženou expresí (např. hsa-miR-378e, hsa-miR-92a-1-5p, hsa-miR-96-5p, hsa-miR-106a-5p) ve vzorcích pacientů s pT3 na rozdíl od pacientů s pT1 + pT2.

Diskuze a závěr

V současné době není k dispozici žádný prediktivní biomarker odpovědi pacientů s karcinomem rekta na NCHRT i přesto, že se již několik studií zabývalo deregulací miRNA v plazmě pacientů s karcinomem rekta v závislosti na jejich odpovědi na NCHRT a metastatickém postižení uzlin [7–9]. Námi získané výsledky odhalily deregulovanou expresi miRNA ve vzorcích krevní plazmy pacientů vykazujících patologickou odpověď na léčbu oproti pacientům s nízkou či žádnou odpovědí. Po validaci výsledků na vzorcích nezávislé skupiny pacientů by mohla být identifikována cirkulující miRNA či panel cirkulujících miRNA, které by sloužily jako neinvazivní prediktivní biomarker odpovědi na NCHRT. Rozdíly v expresních profilech cirkulujících miRNA byly navíc prokázány i mezi pacienty s metastatickým postižením lokálních uzlin a bez metastatického postižení. Nakonec byla zjištěna deregulace miRNA v závislosti na patologickém rozsahu nádoru. MiRNA deregulované u pacientů s pN+ a u pacientů s pT3 na rozdíl od pacientů s pN− a pT1 + pT2 by mohly sloužit jako přídatný ukazatel při určování ycTNM a tím výrazně napomoci plánování chirurgického zákroku a dalších léčebných postupů.

Tento projekt byl uskutečněn z podpory grantu Ministerstva zdravotnictví České republiky č. 16-31765A.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

prof. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D.

CEITEC – Středoevropský technologický institut Masarykova univerzita

Kamenice 753/5 625 00 Brno

e-mail: on.slaby@gmail.com

Obdrženo: 22. 2. 2019

Přijato: 27. 2. 2019