HPV 16 v patogenéze nádorov horného aerodigestívneho traktu

Súhrn

Úvod: Ľudský papilomavírus (human papillomavirus – HPV) je celosvetovo najrozšírenejšie pohlavne prenosné ochorenie. V etiopatogenéze karcinómov hlavy a krku, predovšetkým orofaryngu, sa v posledných rokoch pripisuje významná úloha aj HPV infekcii.

Materiál a metodika: Prospektívna štúdia 236 pacientov so skvamocelulárnym karcinómom (squamous cell carcinoma – SCC) horného aerodigestívneho traktu (dutina ústna, orofarynx, hypofarynx, larynx). Sledovali sme výskyt p16 pozitivity v nádorovom tkanive a súvislosť k lokalizácii, výskytu rizikových faktorov (fajčenie, alkohol, sexuálne správanie), histopatologickému nálezu a štádiu ochorenia.

Výsledky: Fajčenie a pravidelnú konzumáciu alkoholu sme zaznamenali u 72 % pacientov so SCC horného aerodigestívneho traktu. Rizikové sexuálne správanie bolo prítomné iba v skupine pacientov s SCC orofaryngu (42 %). Na základe imunohistochemického vyšetrenia sme p16 detegovali v 20 % nádorov horného aerodigestívneho traktu, najčastejšie v resekátoch z orofaryngu (30 %). Pacienti s p16 pozitívnym SCC orofaryngu boli mladší, rizikové sexuálne správanie priznalo 94 % z nich. Fajčenie a pravidelná konzumácia alkoholu sa častejšie vyskytovali u pacientov s p16 negatívnym SCC orofaryngu (90 %).

Záver: Infekcia HPV 16 má vplyv prioritne na vznik karcinómu orofaryngu. V ostatných lokalizáciách horného aerodigestívneho traktu je hlavným rizikovým faktorom fajčenie a nadmerné užívanie alkoholu. Stanovenie HPV v nádorovom tkanive z orofaryngu je neoddeliteľnou súčasťou histopatologického vyšetrenia. Imunohistochemické vyšetrenie expresie proteínu p16 v nádorovom tkanive predstavuje dostačujúcu metódu na stratifikáciu pacientov do HPV pozitívnej/negatívnej skupiny karcinómov orofaryngu.

Klíčová slova:

karcinómy hlavy a krku – orofaryngeálny karcinóm – etiopatogenéza – HPV infekcia – rizikové faktory

Úvod

Infekcia ľudským papilomavírusom (human papillomavirus – HPV) je celosvetovo najrozšírenejšie pohlavne prenosné ochorenie. HPV sú malé DNA vírusy, ktoré postihujú obe pohlavia. Doteraz bolo identifikovaných približne 120 genotypov. Podľa onkogénneho potenciálu sa HPV delia na dve skupiny – vysoko rizikové (high-risk – HR) a nízko rizikové (low-risk – LR). Z HR HPV ide predovšetkým o HPV 16 a 18, ktoré spôsobujú malígne nádory urogenitálnej oblasti (krčok maternice, vulva, vagína, konečník, penis). Z LR HPV sa najčastejšie identifikuje typ 6 a 11, ktorý spôsobuje kožné a genitálne bradavice ako aj papilómy slizníc. V hornom aerodigestívnom trakte sa uplatňujú podobné typy HPV ako v urogenitálnej oblasti [1,2].

HPV spolu s Helicobacter pylori a vírusmi hepatitídy B a C patria k najčastejším infekčným príčinám malignít. Odhaduje sa, že v dôsledku HPV infekcie vzniká celosvetovo asi 5 % malignít. Z celkového množstva 12,8 miliónov nových karcinómov na svete v roku 2008 asi 700 000 vzniklo v lokalizáciách, ktoré sú spájané s HPV asociovanými karcinómami a 610 000 ich skutočne vzniklo v dôsledku HPV infekcie [2].

Aj keď ide o tumory s blízkou anatomickou lokalizáciou, nádory hlavy a krku predstavujú heterogénnu skupinu nádorov. V klinickej praxi, vrátane klinických štúdií, termín „nádory hlavy a krku“ označuje nádory horného aerodigestívneho traktu, tj. pery a dutiny ústnej, orofaryngu, hypofaryngu a laryngu. Histologicky vo > 90 % prípadov ide o skvamocelulárne karcinómy (squamous cell carcinoma – SCC). Osobitne sa vyčleňujú nádory nosohltana, nosovej dutiny, prinosových dutín a slinných žliaz, ktoré sa svojou incidenciou zaraďujú medzi zriedkavé nádory tejto oblasti. Etiológia, histopatológia aj liečba týchto nádorov sa odlišujú od „klasickej skupiny nádorov hlavy a krku“.

SCC horného aerodigestívneho traktu tvoria 4 % novodiagnostikovaných malignít ročne. Ide o siedmu najčastejšiu malignitu u mužov a trinástu u žien [3]. V etiopatogenéze nádorov horného aerodigestívneho traktu zohráva dôležitú úlohu fajčenie a pravidelná nadmerná konzumácia alkoholu. Z ďalších rizikových faktorov je to žuvanie tabaku, malnutrícia, avitaminóza, zlá hygiena ústnej dutiny a extraezofageálny reflux. U väčšiny pacientov sa rizikové faktory kombinujú. V posledných rokoch sa významná úloha pripisuje aj HPV infekcii, predovšetkým HR HPV 16, ktorý je zodpovedný za celosvetový nárast incidencie karcinómu orofaryngu [3,4]. Výskyt HPV pozitívneho karcinómu orofaryngu je okolo 50 % v Severnej Amerike, Japonsku a Austrálii, o niečo nižší (38 %) je v severnej, západnej a východnej Európe. V južnej Európe sa udáva podiel HPV pozitívnych orofaryngeálnych karcinómov iba v 17 % [2,3].

Materiál a metodika

Dizajn štúdie

Do prospektívnej štúdie bolo zaradených 236 pacientov, ktorým bol na oddelení otorinolaryngológie (ORL) Fakultnej nemocnice s poliklinikou (FNsP) F. D. Roosevelta v Banskej Bystrici v rokoch 2016–2018 diagnostikovaný SCC horného aerodigestívneho traktu (dutina ústna, oropharynx, hypopharynx, larynx).

Zo súboru boli vyradení pacienti:

• s iným histopatologickým typom nádoru horného aerodigestívneho traktu;
• so zriedkavými nádormi hlavy a krku (tj. nosohltan, nosová dutina, prinosové dutiny, ušné nádory, slinné žľazy);
• s metastázou (MTS) do lymfatických uzlín krku pri neznámom primárnom tumore, MTS do lymfatických uzlín krku pri tumore mimo ORL oblasť;
• s kožnými nádormi, nádormi štítnej žľazy a lymfoproliferatívnym ochorením;
• bez úplnej dokumentácie.

V sledovanom súbore sme sledovali výskyt rizikových faktorov, histopatologický nález a štádium ochorenia.

Všetci pacienti boli informovaní o charaktere štúdie a podpísali informovaný súhlas. Štúdia bola schválená etickou komisiou FNsP F. D. Roosevelta v Banskej Bystrici.

Rizikové faktory

Z rizikových faktorov sme sa zamerali na fajčenie, konzumáciu alkoholu a sexuálne správanie. Rizikové faktory sme zisťovali pomocou dotazníka.

Za fajčiara bol považovaný jedinec, ktorý fajčí 20 cigariet denne najmenej 10 rokov.

Za nadmernú konzumáciu alkoholu sme považovali u žien konzumáciu > 3 nápojov denne alebo 7 nápojov týždenne, a u mužov > 4 nápoje denne alebo 14 nápojov týždenne. Jeden alkoholický nápoj (1 drink) predstavuje 12–15 g alkoholu, tj. 0,5 l piva, 0,2 l vína alebo 0,05 l destilátu.

Zo sexuálnej anamnézy sme zisťovali vek koitarché (zahájenie sexuálneho života) a počet sexuálnych partnerov. Za rizikové sme považovali počet sexuálnych partnerov > 15.

Rozsah ochorenia

Všetkým pacientom bolo realizované endoskopické vyšetrenie v celkovej anestézii, pri ktorom sme určili lokálny rozsah ochorenia a odobrali vzorku nádorového tkaniva na histopatologické vyšetrenie. Všetkým pacientom bolo doplnené vyšetrenie krku a hrudníka výpočtovou tomografiou a vyšetrenie brucha výpočtovou tomografiou/ultrasonografiou. Podľa výsledkov vyšetrení sme následne určili rozsah ochorenia. Štádium choroby sme stanovili na základe platnej TNM (tumor-nodes-metastasis) klasifikácie (7. vydanie pre nádory diagnostikované do 31. 12. 2017 a 8. vydanie pre nádory diagnostikované od 1. 1. 2018).

Histopatologické vyšetrenie

Vzorky nádorového tkaniva odobratého počas endoskopického vyšetrenia v celkovej anestézii boli ihneď fixované roztokom 10% formaldehydu a zaliate parafínom. Z každej vzorky boli pripravené 4–5 μm hrubé rezy. Všetky rezy boli kontrastne zafarbené Weigertovým hematoxylínom (Bamed).

Stupeň diferenciácie SCC sme stanovili na základe klasifikácie Svetovej zdravotníckej organizácie tumorov hlavy a krku z roku 2017 [5]: grade I (GI, dobre diferencovaný); grade II (GII, stredne diferencovaný); grade III (GIII, zle diferencovaný).

Proteín 16 v tkanive nádoru sme určovali imunohistochemicky. Na imunohistochemické stanovovanie p16 sme použili myšiu monoklonálnu protilátku, klon E6H4®, namierená proti ľudskému p16^INK4a proteínu (Roche). Výsledok sme kvantifikovali percentuálne na základe pozitivity imunohistochemického vyšetrenia pre p16 v bunkách nádoru.

Štatistická analýza

Charakteristiku súboru pacientov a sledované dáta sme vyhodnotili pomocou frekvenčnej sumarizácie a deskriptívnej štatistiky (priemer, medián, smerodajná odchýlka, kvartil minima a maxima). Rozdiely medzi sledovanými parametrami sme vyhodnotili použitím testov – Pearsonov χ²-test s Yatesovou koreláciou, Mann-Whitneyho U test, Kruskal-Wallisov test a dvojfaktorová ANOVA s post hoc Duncan testom. Za štatisticky významné sme v rámci všetkých použitých testov považovali hodnoty hladiny významnosti p < 0,05. Na štatistickú analýzu sme použili program STATISTICA Cz 10.

Výsledky

Do súboru bolo zaradených 236 pacientov, ktorým bol novodiagnostikovaný SCC horného aerodigestívneho traktu na ORL oddelení FNsP F. D. Roosevelta v Banskej Bystrici v období 1/2016–12/2018. V súbore bolo 208 (88 %) mužov, vek 62 ± 8 rokov a 28 (12 %) žien, vek 60 ± 9 rokov. SCC ústnej dutiny sa zistil v 4 %, orofaryngu v 51 %, hypofaryngu v 11 % a hrtana v 34 %. Charakteristika primárneho tumoru horného aerodigestívneho traktu je uvedená v tab. 1.

Typické rizikové faktory – fajčenie a pravidelná nadmerná konzumácia alkoholu – boli prítomné u 72 % pacientov, rizikové sexuálne správanie sa vyskytovalo u 23 %. Rizikové faktory boli častejšie prítomné u pacientov s orofaryngeálnym karcinómom (fajčenie, alkohol p = 0,007, resp. rizikové sexuálne správanie p < 0,0001). Vek zahájenia sexuálneho debutu bol 17 ± 2 roky, bez významnejších rozdielov medzi lokalizáciou primárneho tumoru (p = 0,266) (tab. 1).

Nádory horného aerodigestívneho traktu sa diagnostikovali v pokročilom štádiu ochorenia (štádium III a IV) u 149 (63 %) pacientov, bez významnejších rozdielov medzi jednotlivými lokalitami (p = 0,081) (tab. 1).

Histopatologickým vyšetrením sa častejšie diagnostikovali dobre a stredne diferencované SCC (GI a GII; 46 a 33 %; p = 0,003 a p = 0,005). Zle diferencovaný SCC (GIII) sa častejšie detegoval v nádoroch lokalizovaných v hypofaryngu (48 %; p = 0,008) a orofaryngu (25 %; p = 0,031) (tab. 1).

Na základe imunohistochemického vyšetrenia sme p16 detegovali v 20 % nádorov horného aerodigestívneho traktu, najčastejšie v resekátoch z orofaryngu (30 %; p = 0,018) (tab. 1, obr. 1).

Vzhľadom na nízky počet p16 pozitívnych nádorov v ostatných lokalitách ako aj negatívne rizikové sexuálne správanie sme ďalej sledovali rozdiely medzi p16 pozitívnymi a p16 negatívnymi nádormi iba pre orofaryngeálne SCC (tj. 120 pacientov, p16 pozitivita u 36). V obidvoch skupinách sa orofaryngeálny SCC vyskytoval častejšie u mužov, avšak v prípade p16 pozitívnych nádorov bol pomer muži: ženy nižší (graf 1). Pacienti s p16 pozitívnym karcinómom boli mladší (p16 pozitívny: 54 ± 9 rokov; p16 negatívny: 62 ± 8 rokov) (graf 2). Rizikové sexuálne správanie priznalo až 94 % pacientov, ktorým bol diagnostikovaný p16 pozitívny orofaryngeálny SCC (p < 0,0001). Fajčenie a pravidelná nadmerná konzumácia alkoholu sa zase častejšie vyskytovali u pacientov s p16 negatívnym SCC orofaryngu (90 %; p < 0,0001) (graf 3). P16 pozitívne nádory boli častejšie zle diferencované SCC (GIII) (69%; p = 0,004) (graf 4). Rozdiely v štádiách ochorenia sme nedetegovali (p = 0,733) (graf 5).

Diskusia

Epidemiológia nádorov horného aerodigestívneho traktu sa v posledných rokoch zmenila. Tieto nádory sú častejšie u mužov, pomer mužov a žien je viac než 3: 1, ale za posledné desaťročia incidencia všetkých oblastí rakoviny hlavy a krku u žien stúpa, čo úzko súvisí so zvyšujúcou sa konzumáciou tabaku a alkoholu u žien [3]. Aj v našom súbore sa signifikantne častejšie vyskytovali muži (88 %).

Doteraz bol typický ORL onkologický pacient muž vo veku 60 rokov, dlhoročný fajčiar, pravidelný konzument alkoholu, nižšieho vzdelania, často nezamestnaný, slobodný alebo rozvedený [6]. V poslednom období však narastá počet pacientov nefajčiarov, nepravidelných konzumentov alkoholu, vyššieho vzdelania a spoločenského postavenia, ktorým bol diagnostikovaný malígny nádor hlavy a krku. Vznik karcinómu sa tu pripisuje HPV infekcii. V etiopatogenéze HPV pozitívnych karcinómov hlavy a krku sa uplatňuje predovšetkým typ HPV 16, ktorý sa deteguje u 90–95 % HPV pozitívnych karcinómov horného aerodigestívneho traktu [3,4,6].

V oblasti hlavy a krku je výskyt HPV asociovaných nádorov najvyšší v orofaryngu, predovšetkým v podnebných mandliach a koreni jazyka. Metaanalýzou štúdií týkajúcich sa európskych krajín (roky 2002–2012) sa zistila celková prevalencia HPV v karcinómoch hlavy a krku 40 %, pričom najvyššia prevalencia bola v karcinómoch tonzily (66,4 %) a bázy jazyka (47,2 %) [7]. Táto skutočnosť sa dáva do súvisu s perzistenciou infekcie v tonzilárnych kryptách, ktoré predstavujú vhodné miesto na replikáciu vírusu. HPV infekcia sa deteguje aj u malého počtu karcinómov dutiny ústnej, hypofaryngu a laryngu, avšak na rozdiel od karcinómov orofaryngu je v neaktívnej forme, preto sa na kancerogenéze pravdepodobne nepodieľa [6,8,9]. Aj v našom súbore sme v porovnaní s ostatnými lokalizáciami horného aerodigestívneho traktu p16 pozitivitu detegovali signifikantne najčastejšie v nádorovom tkanive z orofaryngu (30 %).

HPV asociovaný karcinóm orofaryngu nie je spájaný s fajčením či abúzom alkoholu, ale s rizikovým sexuálnym správaním. Štatisticky významne vyššia incidencia orofaryngeálneho karcinómu bola zistená u osôb s vyšším počtom sexuálnych partnerov (> 26), orálnych sexuálnych partnerov (> 6), ak bol prvý pohlavný styk vo veku < 18 rokov. Sexuálne správanie je teda významný rizikový faktor, no HPV asociovaný karcinóm sa tiež vyskytuje aj u ľudí s konzervatívnejším sexuálnym správaním. Vyšší počet tonzilárneho karcinómu bol zistený napr. u manželov žien s karcinómom krčka maternice [3,4,9].

V sledovanom súbore sme zaznamenali typické rizikové faktory – fajčenie a pravidelnú nadmernú konzumáciu alkoholu u 72 % pacientov so SCC horného aerodigestívneho traktu. Rizikové sexuálne správanie (počet sexuálnych partnerov >15) bolo prítomné iba v skupine pacientov s karcinómom orofaryngu (42 %). Rozdiely vo veku koitarché a lokalizáciou primárneho tumoru sme nezistili.

HPV 16 asociovaný SCC orofaryngu bol častejší u mužov, avšak pomer muži: ženy bol v porovnaní s p16 negatívnym orofaryngeálnym SCC ako aj ostatnými SCC horného aerodigestívneho traktu nižší. Pacienti s p16 pozitívnym SCC orofaryngu boli tiež signifikantne mladší, rizikové sexuálne správanie priznalo až 94 % z nich. Fajčenie a pravidelná konzumácia alkoholu sa častejšie vyskytovali u pacientov s p16 negatívnym SCC orofaryngu (90 %).

Rozdiely sú aj v histopatologickom náleze – HPV pozitívne SCC sú typicky nízkodiferencované, nekeratinizujúce, často bazaloidného typu. Okrem toho sa u pacientov s HPV pozitívnym SCC často stretávame s objemnou, cystickou MTS na krku a malým primárnym nádorom, kdežto pri HPV negatívnych karcinómoch väčšinou koreluje T a N štádium ochorenia [3].

Aj v našej štúdii boli p16 pozitívne orofaryngeálne SCC častejšie zle diferencované (GIII). Rozdiely v štádiách ochorenia sme nedetegovali.

Detekcia HPV v nádore

Od 1. 1. 2018 je HPV status potrebný na určenie TNM štádia orofaryngeálnych karcinómov, preto je v súčasnosti stanovenie HPV v nádorovom tkanive neoddeliteľnou súčasťou histopatologického vyšetrenia [10]. Okrem toho poskytuje dôležitú prognostickú informáciu a je pravdepodobné, že v blízkej budúcnosti bude rozhodovať aj o spôsobe liečby, napr. o použití deintenzifikovanej chemo/rádioterapie. Určenie HPV statusu sa odporúča aj v rámci manažmentu pacientov s MTS SCC z neznámeho origa do lymfatických uzlín krku. Dôkaz HPV môže efektívne nasmerovať diagnostiku a cielenú liečbu na oblasť orofaryngu. Aj keď je s HPV infekciou asociovaná aj časť non-orofaryngeálnych SCC hlavy a krku, rutinné HPV testovanie týchto nádorov nie je vzhľadom na nedostatok dôkazov o prognostickom význame vyšetrenia v súčasnosti odporúčané [11].

Napriek zjavnému významu a dôležitosti HPV testovania neexistuje všeobecný konsenzus, akú stratégiu a ktoré z viacerých dostupných metód na dôkaz HPV treba použiť. Výber metodiky by mal vychádzať zo zistení, že klinicky dobrá prognóza HPV pozitívnych orofaryngeálnych SCC je limitovaná iba na nádory s transkripčne aktívnou HPV infekciou [11–13]. Ideálny test by mal mať vysokú senzitivitu a špecificitu, primeranú cenu a mal by byť dostatočne jednoduchý na rutinné použitie. Jedným z najpraktickejších a najpoužívanejších spôsobov je screeningové imunohistochemické vyšetrenie expresie proteínu p16 [11]. Túto metodiku sme zvolili aj v našej štúdii. V súčasnosti sa táto metóda považuje za dostačujúcu na stratifikáciu pacientov do HPV pozitívnej/negatívnej skupiny karcinómov orofaryngu. Za pozitívny výsledok sa považuje jadrová a cytoplazmatická expresia ≥ 70 % nádorových buniek [11,14]. Na druhej strane nemožno zabúdať ani na nevýhody imunohistochemickej detekcie p16, predovšetkým nižšiu citlivosť a neschopnosť rozlíšiť jednotlivé kmene HPV. Samotná imunohistochemická expresia p16 sa môže považovať za marker aktívnej HPV infekcie iba v prípade, ak má karcinóm charakteristickú histopatologickú morfológiu. V prípade, že sa jedná o p16 pozitívny karcinóm s variantnou morfológiou alebo v prípade imunohistochemickej negativity v nekeratinizujúcom SCC orofaryngu, je nutné doplniť HPV špecifický test [11].

HPV infekciu v nádorovom tkanive je možné detegovať na základe dôkazu E6/E7 mRNA metódou reverznej transkripcie a polymerázovej reťazovej reakcie. Vysoko senzitívnym vyšetrením je detekcia HPV DNA vyšetrením polymerázovej reťazovej reakcie, stanovenia HPV DNA in situ hybridizáciou a najnovšie aj HPV RNA in situ hybridizáciou. Ide však o technicky, časovo aj finančne náročnejšie vyšetrenia [11].

Záver

V súlade s výsledkami iných štúdií aj v našej práci sme dokázali, že infekcia HPV 16, ktorý patrí medzi tzv. high-risk HPV, má vplyv prioritne na vznik karcinómu orofaryngu. V ostatných lokalizáciách horného aerodigestívneho traktu nemá HPV infekcia vplyv na vznik nádoru a v týchto lokalizáciách je hlavným rizikovým faktorom fajčenie a nadmerné užívanie alkoholu. HPV asociovaný karcinóm orofaryngu nie je spájaný s fajčením ani abúzom alkoholu, ale s rizikovým sexuálnym správaním.

HPV asociované karcinómy orofaryngu predstavujú novú skupinu nádorov, čo odzrkadľuje aj nová TNM klasifikácia (8. vydanie, platná od 1. 1. 2018). Stanovenie HPV v nádorovom tkanive z orofaryngu je neoddeliteľnou súčasťou histopatologického vyšetrenia. Imunohistochemické vyšetrenie expresie proteínu p16 v nádorovom tkanive sa v súčasnosti považuje za dostačujúcu metódu na stratifikáciu pacientov do HPV pozitívnej/negatívnej skupiny karcinómov orofaryngu.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

MUDr. Barbora Uhliarova, Ph.D.
Oddelenie otorinolaryngológie
Fakultná nemocnica s poliklinikou
F. D. Roosevelta
Nám. L. Svobodu 1
974 01 Banská Bystrica
Slovenská republika
e-mail:b.uhliarova@gmail.com
Obdržané: 19. 6. 2019
Prijaté: 31. 12. 2019