Alternativní metody kontroly radiofarmak v Českém lékopise 2017 – Doplňku 2021

Súhrn

Úvod: V Českém lékopise 2017 – Doplňku 2021 byla nově zařazena obecná stať Alternativní metody kontroly radiofarmak, kde je uvedena řada dalších metod pro stanovení radiochemické čistoty (RCHČ) radiofarmak, které je možno jako oficinální (lékopisné) přímo bez nutnosti validace oficiálně používat na pracovišti přípravy radiofarmak ve zdravotnickém zařízení. Účelem článku je seznámit pracovníky s uvedenými metodami a na příkladu frekventovaného radiofarmaka [^99mTc]-oxidronátu rovněž poukázat na důležitost použití lékopisem doporučené stacionární fáze pro chromatografii, aby bylo dosaženo odpovídajících výsledků.

Metoda: Tabelární uvedení chromatografických metod stanovení radiochemické čistoty pro jednotlivá radiofarmaka s doplněním požadovaných hodnot radiochemické čistoty a výpočtu radiochemické čistoty v případě více nečistot. Papírová radiochromatografie pomocí skeneru chromatografických proužků PT444R1. Radiofarmakum: [^99mTc]-oxidronát, mobilní fáze: 0,9% NaCl, stacionární fáze: TLC-SP, 3MM Chr, 1 Chr (9 x 1 cm), délka dráhy 7 cm. Vyvinutý a oskenovaný chromatogram byl vyhodnocen pomocí software skeneru.

Výsledky: Tabulky s přehledem chromatografických metod stanovení radiochemické čistoty radiofarmak včetně uvedení požadovaných hodnot radiochemické čistoty a výpočetních vzorců. Porovnání distribuce [^99mTc]-oxidronátu při chromatografii na TLC-SP, 3MM Chr, 1 Chr, kdy k řádnému chromatografickému dělení došlo pouze na lékopisem doporučeném chromatografickém papíru TLC-SP (Supelco™).

Závěr: Uvedené chromatografické metody stanovení radiochemické čistoty radiofarmak je možno přímo použít místo metod uvedených např. v souhrnech údajů o přípravcích (SPC), které nemusejí být na pracovišti dostupné, jako např. elektroforéza, membránová filtrace aj. Z příkladu chromatografie [^99mTc]-oxidronátu vyplývá důležitost použití konkrétního komerčního zdroje chromatografického nosiče, protože u jiného není zajištěna jeho vhodnost a odpovědná osoba zodpovídá za ověření vhodnosti jiné komerční značky odpovídající kvality.

Klíčová slova:

koloidní technecium-99m – technecistan-(99mTc) – vázané technecium-99m – radiochemická čistota – radiochemické nečistoty – [99mTc]technecium-oxidronát

Úvod

Podle § 27 vyhlášky č. 84/2008 Sb. o správné lékárenské praxi, bližších podmínkách zacházení s léčivy v lékárnách, zdravotnických zařízeních a u dalších provozovatelů a zařízení vydávajících léčivé přípravky v platném znění se před vydáním připraveného radiofarmaka ověří jeho jakost. ¹ To je dle § 23 uvedené vyhlášky možno podle Českého lékopisu (ČL), souhrnu údajů o přípravku (SPC) v případě registrovaných léčivých přípravků (kity pro radiofarmaka), postupu schváleného v rámci klinického hodnocení (KH) nebo specifického léčebného programu (SLP). Inspektoři Státního ústavu pro kontrolu léčiv (SÚKL) rovněž uznávají použití metod z Přehledu kontrolních metod pro kity dodávané firmou KC SOLID, spol. s r. o. – včetně alternativních provedení. ²

V SPC přípravků bývají uvedeny zjednodušené metody a nejsou předepsány všechny testy jako v článcích ČL. Metody uvedené v jiných zdrojích než v platném ČL, je potřeba při zavedení validovat, např. podle směrnice Evropské lékové agentury (EMA) pro validaci analytických metod používaných ve farmaceutickém průmyslu CPMP/ICH/381/95 Q2(R1) ³ – požadavek SÚKLu. Uvedená směrnice je nyní v revizi a letos bude vydána nová verze.

Požadavek validace platí i pro alternativní metody kontroly radiofarmak uvedené v Mezinárodním lékopise (Ph. Int.) vydávaném Světovou zdravotnickou organizací (WHO), protože tento lékopis není u nás právně závazný. Nyní je platné 10. vydání Ph. Int. z roku 2020 a alternativní metody kontroly radiofarmak prováděné ve zdravotnických zařízeních jsou uvedeny ve stati Testing – additional guidance. ⁴ V národní části ČL 2017 – Dopl. 2021 je nyní zařazena obecná stať Alternativní metody kontroly radiofarmak vycházející z uvedené stati Ph. Int. Jedná se o překlad a doplnění metod z Mezinárodního lékopisu, přičemž názvy radiofarmak jsou uváděny lékopisné (pokud existují) nebo v souladu s názvoslovím ČL a současně pomocí běžné zkratky, názvy mobilních fází jsou rovněž uváděny lékopisné. U radiofarmak, kde nejsou alternativní metody, jsou uvedené metody totožné jako v lékopisných článcích nebo SPC kitů pro radiofarmaka, aby tabulka obsahovala přehled všech v praxi běžně používaných radiofarmak. U stacionárních fází se na rozdíl od lékopisných článků uvádí i odkaz na komerční zdroje materiálu, u kterého se zjistilo, že je vhodný. V české verzi článku je oproti Mezinárodnímu lékopisu přidán stručný postup provedení tenkovrstvé a papírové chromatografie radiofarmak včetně potřebných výpočtů radiochemické čistoty a obsahu radiochemických nečistot. Jako každá nová stať ČL prošla i tato standardním recenzním řízením a uvedené alternativní metody kontroly připravovaných radiofarmak jsou nyní oficinální a tedy přímo bez nutnosti validace použitelné na pracovišti přípravy radiofarmak ve zdravotnickém zařízení. ⁵

Metoda

Jednotlivé kontrolní metody byly převzaty ze dvou tabulek stati Alternativní metody kontroly radiofarmak ČL. ⁵ Do tabulek byly oproti lékopisu přidány požadované hodnoty radiochemické čistoty, obsahu radiochemických nečistot a případné další nečistoty jiné než koloidní technecium-99m a technecistan-(^99mTc) převzaté především z článků ČL ⁵, SPC ⁶, u již nedostupných techneciových radiofarmak z publikace Technetium-99m Pharmaceuticals ⁷, u močoviny-(¹⁴C) z Lékopisu Spojených států amerických (USP-NF) ⁸ a z relevantních publikací u jomazenilu-(¹²³I) ⁹ a jodcholesterolu-(¹³¹I). ¹⁰ Bylo přidáno vysvětlení všech zkratek sloučenin, nejen vybraných jako v ČL. Značení kitu Technescan HDP se provádí dle pokynů v SPC. ⁶ Pro ověření závislosti distribuce [^99mTc]technecium-oxidronátu na použitém chromatografickém papíru byly použity hydrofilní mobilní fáze: 0,9% NaCl (Lach-Ner), 3 stacionární fáze: TLC-SP (Supelco™), 3MM Chr (Whatman), 1 Chr (Whatman) – 9 x 1 cm, délka dráhy 7 cm. Závislost distribuce v lipofilním butan-2-onu na použitém chromatografickém nosiči není potřeba provádět, jelikož hydrofilní [^99mTc]technecium-oxidronát zůstává na jakémkoli používaném nosiči vyvíjeném v lipofilním butan-2-onu na startu chromatogramu. Bylo nanášeno 5 µl vzorku, chromatogramy se vyvíjely ihned. Distribuce radioaktivity vyvinutých chromatogramů byla měřena a vyhodnocena pomocí skeneru chromatografických proužků PT444R1 (Lynax).

Výsledky

V Tab. 1 je přehled chromatografických systémů pro tenkovrstvou chromatografii (TLC, Thin Layer Chromatography) netechneciových radiofarmak.

V Tab. 2 je přehled chromatografických systémů pro tenkovrstvou chromatografii a papírovou chromatografii (PC, Paper Chromatography) techneciových radiofarmak.

Názvy radiofarmak jsou lékopisné nebo při neexistenci odpovídajícího lékopisného článku jsou vytvořeny v souladu s názvoslovím ČL a současně jsou v závorce uvedeny v praxi běžně používané zkratky. Mobilní fáze mají rovněž uvedeny lékopisné názvy (psány kurzívou) a jejich složení vyhovuje požadavkům kapitoly ČL 4.1.1 ZKOUMADLA. Nelékopisná zkoumadla jsou uvedena normálním písmem. Názvy stacionárních fází jsou většinou uvedeny zkratkou, upřesnění je pod tabulkou. U netechneciových radiofarmak je uveden retardační faktor (R_F) nevázaného radionuklidu a vázaného radionuklidu a v závorce požadovaný limit obsahu v procentech. U techneciových radiofarmak je uveden R_F koloidního technecia-99m (RH-Tc, nečistota A), technecistanu-(^99mTc) (nečistota B) a vázaného technecia-99m a v závorce příslušný limit v procentech. Případně jsou v tabulkách uvedeny v závorce další nečistoty nebo další upřesnění.

Přehled stacionárních a mobilních fází pro tenkovrstvou a papírovou chromatografii techneciových a netechneciových radiofarmak.

Lékopisné názvy jsou uvedeny kurzívou a obsahují označení R (zkoumadlo), RS (roztok zkoumadla) nebo RN (zkoumadlo použité v národní části neuvedené v evropské části ČL).

Stacionární fáze:

• ITLC-SA (Varian) = kyselina křemičitá na vrstvě skleněných vláken,
• ITLC-SG (Varian) = silikagel na vrstvě skleněných vláken,
• 3MM Chr = Whatman celulosový chromatografický papír 3MM Chr,
• 1 Chr = Whatman celulosový chromatografický papír 1 Chr,
• 31ET Chr = Whatman celulosový chromatografický papír 31ET Chr,
• TLC-SP (Supelco™) = papír pro chromatografii R,
• silikagel (Merck) = deska s vrstvou silikagelu pro TLC R o velikosti pórů 6 nm,
• oxid hlinitý (Merck) = deska s vrstvou oxidu hlinitého G pro TLC R,
• celulosa (Merck) = deska s vrstvou celulosy pro TLC R.

Mobilní fáze:

• butan-2-on R,
• roztok chloridu sodného R (9 g/l),
• roztok chloridu sodného 1 mol/l = roztok chloridu sodného R (58,4 g/l),
• chlorid sodný RS (obsahuje 200 g/l NaCl),
• chlorid sodný nasycený RS (1 díl chloridu sodného R se smíchá se 2 díly vody R, občas se protřepe a nechá se stát, před použitím se roztok dekantuje od nerozpuštěné látky a je-li třeba, zfiltruje se),
• roztok natrium-acetátu 1 mol/l = roztok natrium-acetátu bezvodého R (82 g/l) nebo roztok natrium-acetátu R (136 g/l) – jedná se o trihydrát,
• tlumivý roztok citrátový 0,1 mol/l o pH 5,0 = roztok natrium-citrátu R (29,4 g/l) - jedná se o dihydrát trisodné soli, jeho pH bylo upraveno kyselinou chlorovodíkovou R1 (obsahuje 250 g/l HCl, 70 g kyseliny chlorovodíkové R (je 35%) se zředí vodou R (odpovídá aqua purificata) na 100 ml) na hodnotu 5,
• roztok natrium-citrátu 0,1 mol/l = roztok natrium-dihydrogen-citrátu RN (21,4 g/l),
• roztok amonium-acetátu 1 mol/l = roztok amonium-acetátu R (77 g/l).

Směsi těkavých rozpouštědel by se měly připravovat čerstvé každý den.

Náhrady:

• ve většině případů může být aceton R nahrazen butan-2-onem R,
• ve většině případů může být roztok chloridu sodného R (9 g/l) nahrazen vodou R,
• ve většině případů může být Whatman 3MM Chr nahrazen Whatmanem 1 Chr,
• roztok natrium-citrátu 0,1 mol/l může být nahrazen antikoagulačním roztokem kyselina-citrát-glukosa (ACD).

Na Obr. 1 je porovnání distribuce [^99mTc]-oxidronátu při chromatografii na TLC-SP (Supelco™) – doporučeno ČL, 3MM Chr (Whatman), 1 Chr (Whatman).

K řádnému chromatografickému dělení došlo pouze na lékopisem doporučeném chromatografickém papíru TLC-SP (Supelco™) – horní chromatogram, kdy je vidět symetrický pík s poněkud delším náběhem. Na dalších dvou chromatografických nosičích – prostřední a dolní chromatogram, není pík [^99mTc]-oxidronátu symetrický a náběh zasahuje prakticky až k oblasti startu, kde se vyskytuje RH-Tc. Tím může docházet ke stanovení falešně vysokých a nevyhovujících hodnot nečistoty RH-Tc. Oranžová oblast se bere pro výpočet plochy píku [^99mTc]-oxidronátu, fialová oblast pro RH-Tc.

Diskuze

Tab. 1 a Tab. 2 uvádějí přehled chromatografických systémů pro TLC a PC netechneciových a techneciových radiofarmak. Oproti lékopisnému článku jsou v tabulce doplněny limity obsahu radiochemických nečistot a limity radiochemické čistoty. Výpočty radiochemické čistoty jsou oproti lékopisu naznačeny přímo v tabulce. Principiálně se při výpočtu radiochemické čistoty (RCHČ) používají následující vztahy.

Jednoproužková metoda (dvě měřené části):

Jednoproužková metoda (tři měřené části):

Dvouproužková metoda (nečistota A):

Dvouproužková metoda (nečistota B):

Dvouproužková metoda:

V některých případech se stanovuje pouze obsah jednotlivých radiochemických nečistot nebo jejich součet A + B. Pro účely měření radioaktivity se chromatografické proužky stříhají v polovině (R_F = 0,5) na dvě části. V případě, že je R_F analytu < 0,9, tak se proužek rozstřihne ve vzdálenosti od startu odpovídající polovině R_F analytu. V některých případech se chromatogram rozstřihne na tři části v místech odpovídajících R_F 0,25 a 0,75 (^99mTc-DMSA/ITLC-SA, ^99mTc(V)-DMSA/silikagel, ^99mTc-tetrofosmin/ITLC-SG). Aktivita každé části chromatogramu se změří pomocí vhodného detektoru záření. Alternativně se může použít skener radiochromatogramů a poloha radioaktivních skvrn se určí měřením aktivity podél celé délky radiochromatogramu. Poměry ploch jednotlivých píků k celkové ploše všech píků udávají relativní poměr příslušných radiochemických forem v procentech (vázaný radionuklid, nečistota A, nečistota B). Výpočet radiochemické čistoty se provádí automaticky softwarem skeneru pomocí obdobných vztahů jako při měření rozstříhaných částí chromatogramu.

V ČL je oproti Ph. Int., ze kterého stať v ČL vychází, přidán následující stručný postup provedení tenkovrstvé a papírové chromatografie radiofarmak.

1. Připraví se příslušná chromatografická deska (proužek) pro dané radiofarmakum (viz tabulky) o rozměrech např. 1 cm x 9 cm (start 1 cm od dolní ho okraje, čelo rozpouštědla 1 cm od horního okraje);
2. Do chromatografické komory se nalije příslušná mobilní fáze pro dané radiofarmakum (viz tabulky) do výšky 3 až 4 mm. Komora se zakryje a její prostor se nechá sytit parami mobilní fáze přibližně 10 min;
3. Nanese se 1 kapka (5 µl) roztoku radiofarmaka 2ml injekční stříkačkou s jehlou 25 G (oranžová);
4. Chromatografická deska se vyvíjí v zakryté komoře s mobilní fází do vzdálenosti 7 cm od místa nanesení (startu). Další zpracování chromatogramu (stříhání nebo skenování), měření aktivity a výpočty RCHČ byly popsány výše.

V tabulkách ČL jsou uvedena i netechneciová radiofarmaka, jejichž RCHČ je v případě hromadně vyráběných radiofarmak garantována výrobcem a na pracovišti se nemusí stanovovat, a některá již nedostupná radiofarmaka nebo v ČR nepoužívaná radiofarmaka, např. močovina-(¹⁴C) pro dechový test Helicobacter pylori, který se u nás provádí s neradioaktivní močovinou-(¹³C). ¹¹ Uvedená radiofarmaka byla beze změny převzata při překladu příslušné stati Ph. Int. Testing – additional guidance. Dále jsou v tabulkách ČL oproti Ph. Int. přidána i některá novější radiofarmaka, jako ⁶⁸Ga-DOTATOC, ⁶⁸Ga-PSMA-11, [^99mTc]--EDDA/HYNIC-TOC. U jomazenilu-(¹²³I) byly dle původní publikace opraveny R_F. ¹²

Původní tabulky v Ph. Int. vycházejí z tabulek Radiochemical purity testing od United Kingdom Radiopharmacy Group (UKRG). Nyní platí verze 3 z května 2021. ¹³ Je tam uvedena i řada dalších zkušebních metod, nicméně jako neoficinální by je před použitím ve zdravotnickém zařízení bylo nutno na rozdíl od oficinálních metod Českého lékopisu validovat, např. podle směrnice CPMP/ICH/381/95 Q2(R1) ³, jak požaduje SÚKL.

Praktickým výstupem použití uvedených tabulek je ukázka nutnosti dodržení doporučených chromatografických systémů na příkladu jednoho z nejpoužívanějších radiofarmak [^99mTc]-oxidronátu, což může být pro každodenní praxi pracovišť přípravy radiofarmak velice důležité. Pouze při použití Českým lékopisem doporučeného chromatografického papíru TLC-SP (Supelco™) došlo v 0,9% NaCl k řádnému dělení analytů umožňujícímu jednoznačné stanovení RCHČ. Při použití jiného chromatografického papíru jako 3MM Chr (Whatman), 1 Chr (Whatman) nebyly výsledky chromatografického dělení uspokojivé, proto je nutné používat doporučenou stacionární fázi dle ČL.

Závěr

Stanovení radiochemické čistoty připravovaných radiofarmak je součástí každodenní praxe pracovišť připravujících radiofarmaka. Nyní je k dispozici oficinální přehled metod stanovení radiochemické čistoty všech běžně používaných radiofarmak v praxi zahrnující některé metody uvedené v SPC kitů pro radiofarmaka nebo v lékopisných článcích. Přidanou hodnotou je uvedení řady alternativních metod stanovení RCHČ, které lze ihned bez nutnosti validace použít ve zdravotnickém zařízení při nedostupnosti metod v SPC nebo lékopisných článcích. Při použití metod je nutno dodržovat kombinace doporučených mobilních a stacionárních fází, protože při záměně může dojít k nevyhovujícímu výsledku, jak bylo ukázáno na příkladu [^99mTc]-oxidronátu. Kontrola se provádí podle ČL, což je v souladu s vyhláškou č. 84/2008 Sb. a tudíž i s požadavky SÚKLu. ¹

jr.stpn@tiscali.cz