Účinky sklených vlákien na vybrané parametre respiračného systému v experimente*

Souhrn

Sklené vlákna sú nekryštalické, vláknité anorganické silikáty, ktoré sa v súčasnosti používajú v mnohých odvetviach priemyslu ako náhrada za karcinogénny azbest. Otázky toxicity sklených vlákien sú ešte stále predmetom mnohých experimentálnych a epidemiologických štúdií. Cieľom práce bolo zistiť účinky sklených vlákien na respiračný systém, a to vyšetrením vybraných zápalových a cytotoxických parametrov bronchoalveolárnej laváže (BAL) po 2-, 30- a 90-dňovej expozícii a výsledky porovnať s kontrolnou skupinou. Exponovanej skupine sme intratracheálne instilovali 4 mg sklených vlákien v 0,4 ml fyziologického roztoku/zviera, kontrolnej skupine 0,4 ml fyziologického roztoku. Po 2-, 30- a 90-dňovej expozícii sme Wistar potkanov utratili, urobili sme im výplach pľúc (BAL) a vyšetrili tieto parametre: histológiu pľúcneho tkaniva, celkový počet Le a AM, diferenciálny obraz buniek BAL (% PMN, % AM, % Ly), % nezrelých foriem AM, % dvojjadrových buniek BAL, fagocytovú aktivitu a viabilitu AM.

Výsledky našej štúdie poukazujú na to, že sklené vlákna v porovnaní s kontrolnou skupinou významne ovplyvňujú najmä zápalové parametre, a to vo všetkých časových úsekoch (v akútnej – 2-dňovej aj v subakútnych fázach – 30- a 90-dňovej expozícii), čo znamená, že aj po 90 dňoch od instilácie sklené vlákna v pľúcach experimentálnych zvierat ešte pretrvávajú a vyvolávajú zápalové reakcie.

Klíčová slova:
sklené vlákna – bronchoalveolárna laváž – zápalové a cytotoxické parametre – intratracheálna instilácia

ÚVOD

Hlavné oblasti použitia sklených vlákien sú izolácie administratívnych budov a rodinných domov, zvukovoizolačné materály a vetracie šachty, izolácie potrubí, vzduchové a kvapalinové filtre, strešné izolácie, izolácie pre autá, lietadlá, maringotky, chladničky, domáce sporáky atď. Textilné vlákna sa používajú na závesy a záclony, ale aj sitá, elektrické priadze, strešné lepenky, krytiny, vystužovanie plastov, papiera, gumy atď. Jemná sklená vlna nachádza využitie vo výrobkoch „vysokých technológií“, ako sú špeciálne filtračné papiere, súčasti batérií, izolačné materiály pre kozmonautiku. Najviac sú profesionálne exponovaní pracovníci vo výrobe, pri rezaní a balení týchto vlákien, v stavebnom priemysle pri inštalácii alebo odstraňovaní izolácií.

Priemyselné minerálne vláknité prachy, kde patria aj sklené vlákna, sú používané v mnohých priemyselných odvetviach a predstavujú potenciálne nebezpečenstvo v pracovnom a životnom prostredí. Sklené vlákna (SV) sú amorfnej povahy a používajú sa ako jedna z možností náhrady za azbest.

Choroby pľúc (obštrukčné, fibrotické, nádorové), ktoré sú dôsledkom znečisteného ovzdušia (pevné aerosóly vrátane mnohých prachov vláknitého aj nevláknitého pôvodu) majú vzostupný trend. Z toho dôvodu je dôležité prispieť k poznaniu vplyvu konkrétnych faktorov pracovného aj životného prostredia na výskyt pľúcnych ochorení, a to aj v dôsledku expozície pevným aerosólom, ako sú priemyselné prachy [3]. V konečnom dôsledku by získané informácie mali viesť k preventívnym opatreniam, ktoré by výskyt a závažnosť týchto chorôb obmedzili.

Medzinárodná agentúra pre výskum rakoviny (IARC) vykonáva dôkladné a nezávislé posudzovanie karcinogénneho vplyvu širokého spektra látok – aj sklených vlákien. Hodnotenie sklených vlákien je súčasťou medzinárodného, interdisciplinárneho programu IARC na identifikáciu karcinogénneho rizika u ľudí.

Z výsledkov IARC 2002 vyplýva, že:

• Je neadekvátny dôkaz karcinogenity sklenej vaty u ľudí.
• Je neadekvátny dôkaz karcinogenity kontinuál­nych sklených vlákien u ľudí.
• Je dostatočná evidencia karcinogenity sklených vlákien (E-vlákna a „475“ sklené vlákna) pre špeciálne účely u experimentálnych zvierat.
• Je limitovaný dôkaz karcinogenity sklenej vaty používanej na izoláciu u experimentálnych zvierat.
• Je neadekvátny dôkaz karcinogenity kontinuál­nych sklených vlákien u experimentálnych zvierat.
• Sklené vlákna pre špeciálne účely ako sú E-vlákna a „475“ sklené vlákna sú možné karcinogény pre ľudí (skupina 2B).
• Sklená vata na izoláciu, kontinuálne sklené vlákna, horninová a trosková vlna nie sú klasifikované ako ľudské karcinogény (skupina 3).

Azbestové vlákna sú dokázané ľudské karcinogény a podľa IARC sú zaradené do skupiny 1 [11, 16].

Cieľom našej štúdie bolo:

• Zistiť ako sklené vlákna ovplyvňujú zápalové a cytotoxické parametre bronchoalveolárnej laváže (BAL) v akútnej fázi (48 hod.), subchronických fázach (30 a 90 dní po intratracheálnom podaní).
• Určiť koreláciu medzi dĺžkou doby expozície a hodnotami vybraných BAL parametrov u pot­kanov exponovaných skleným vláknam v porovnaní s kontrolnou skupinou.

SÚBOR A METODIKA

V experimente sme použili potkanov Wistar, zakú­pených z chovnej stanice VELAZ, ktoré mali pred začatím dvojtýždennú karanténu. Laboratórne zvieratá boli držané vo zverinci s nainštalovaným klimatizačným zariadením, pri teplote 22 +/-2 °C, relatívnej vlhkosti 45 %, s prirodzeným denným osvetlením a za dodržania neinfekčných podmienok. Zvieratám bola zabezpečená komerčná diéta ST 1 a vodovodná voda ad libitum. Počet zvierat v skupine: 6.

Rozmer intratracheálne podaných sklených vlákien (komerčný názov – MMVF 10) v experimente:

L (dľžka): 22,6 µm (SD: 13,6)

d (hrúbka): 1,31 µm (SD: 0,85)

Chemické zloženie sklených vlákien: SiO₂ = 57,5 %; Al₂O₃ = 5,1 %; Fe₂O₃ = 0,07 %; TiO₂ = 0,01%; MgO = 4,13 %; CaO = 7,5 %; Na₂O = 14,95 %; K₂O = 1,06 %; B₂O₃ = 8,75 %; F = 0,83 %; ZrO2 = 0,03 %; SO3 = 0,12 %.

Vo zverinci boli všetky zvieratá randomizované, uskladnené v klietkach (rozmerov: 35 x 55 x 19 cm) po troch a držané za konvenčných podmienok, pri 22 +2 °C, 45-% relatívnej vlhkosti, prírodnom osvetlení a normálnej svetlo/tma periodicite, s klimatizačným zariadením WOLF KG 100 (WOLF – Clima Technic, GmbH, Mainburg, Germany). Dostávali komerčnú diétu ST 1 (TOP - Dovo, Horné Dubové, Slovensko) a vodovodnú vodu ad libitum.

Zvieratám sme intratracheálne instilovali suspenziu sklených vlákien – 4 mg vlákien v 0,4 ml fyziologického roztoku/zviera. Kontrolnej skupine len 0,4 ml fyziologického roztoku. Podávaná vláknová suspenzia bola vždy čerstvo pripravená, homogenizovaná v ultrazvukovom kúpeli a pred podaním pomiešaná v magnetickej miešačke. Zdravotný stav zvierat sa sledoval denne. Štúdia bola pred začatím schválená Etickou komisiou Vedecko-výskumnej základne SZU a zvieratá boli uskladnené a chované podľa: Guidelines of European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental Purposes. Zverinec SZU má certifikát Správnej laboratórnej praxe.

Po časovej expozícii – 2, 30, 90 dňoch od intratracheálnej instilácie (i. t.), sme laboratórne potkany utratili intraperitoneálnym podaním (i. p.) roztoku tiopentanolu – 150 mg/1 kg zvieraťa, vypláchli pľúca (BAL – 5 x 5 ml výplachového roztoku) a vyšetrili vybrané zápalové a cytotoxické parametre bronchoalveolárnej laváže (BAL):

–   celkový počet leukocytov,

–   celkový počet alveolárnych makrofágov,

–   diferenciálny obraz buniek BAL (% PMN, % AM, % Ly),

–   percentá nezrelých foriem alveolárnych makrofágov,

–   percentá dvojjadrových buniek BAL,

–   fagocytová aktivita,

–   viabilita alveolárnych makrofágov

–   histológiu pľúc.

• Počet buniek/ml BAL sme stanovili v Bürkerovej komôrke.
• Diferenciálnu analýzu buniek BAL, ako aj percentá nezrelých foriem AM a percentá dvoj- a viacjadrových buniek BAL sme zisťovali mikroskopicky na preparátoch zafarbených May-Grünwald--Giemsovým roztokom (z 200 buniek).
• Fagocytovú aktivitu AM sme stanovili metódou podľa Fornůska et al. a použili sme 2-hydroxyethylmetacrylátové partikule (MSHP). 50 µl MSHP partikúl sme pridali do 100 µl tekutiny BAL a inkubovali 60 min pri 37 °C za občasného premiešania. Nátery buniek na sklíčkach sme farbili metódou May-Grünwald-Giemsa. Za pozitívne sme pokladali bunky, ktoré pohltili 3 a viac častíc [5].
• Na viabilitu AM sme použili 200 µl 0,25% roztoku erythrozínu, ktorý sme pridali k adekvátnemu množstvu bunkovej suspenzie. Počet živých a neživých buniek sme počítali v Bürkerovej komôrke. Podrobný popis metodík je v práci Hurbánková, Kaiglová 1999 [7] a popis histologického vyšetrenia v práci Hurbánková et al. 2004 [9].

Štatistické spracovanie BAL parametrov: Použili sme neparametrický Mann-Whitneyho U test za použitia softvéru XLSTAT. Tento test sa používa pri porovnaní mediánov dvoch nezávislých vzoriek. Test odpovedá na otázku, či je rozdiel mediánov dvoch skupín štatisticky významný alebo iba náhodný. Ak je rozdiel významný (p < 0,05), znamená to, že medzi poradovou premennou a binárnou premennou (skupinou) existuje vzťah [13].

VÝSLEDKY

V našej experimentálnej štúdii sme v porovnaní s kontrolnou skupinou zistili v akútnej fáze (2-dňová expozícia):

• Štatisticky významné zvýšenie % PMN a % Ly z diferenciálneho obrazu buniek, celkového počtu Le v BAL a nezrelých foriem AM.
• Štatisticky významné zníženie % AM z diferenciálneho obrazu buniek a viability AM.
• Zvýšenie celkového počtu AM a percenta dvojjadrových buniek a zníženie percenta fagocytovej aktivity, ale nie štatisticky významne (tab. 2, 3, 4, 5).

V subakútnej fáze (30-dňová expozícia):

• Štatisticky významné zvýšenie % PMN a % Ly z diferenciálneho obrazu buniek, percenta nezrelých foriem AM a percenta dvojjadrových buniek.
• Štatisticky významné zníženie % AM z diferenciálneho obrazu buniek.
• Zvýšenie celkového počtu Le v BAL pokles percenta viability a fagocytovej aktivity, ale nie štatisticky významne (viď tab. 2, 3, 4).

V subakútnej fáze (90-dňová expozícia):

• Štatisticky významné zvýšenie % PMN a % Ly z diferenciálneho obrazu buniek, percenta nezrelých foriem AM a percenta dvojjadrových buniek.
• Štatisticky významné zníženie % AM z diferenciálneho obrazu buniek.
• Zníženie celkového počtu AM a Le v BAL, percenta fagocytovej aktivity a viability, ale nie štatisticky významne (viď tab. 2, 3, 4).

Časová závislosť hodnôt BAL parametrov – korelácia s časom

• V diferenciálnom obraze buniek BAL sme zaznamelali v kontrolnej skupine nesignifikantnú koreláciu s časom. V exponovanej skupine sme pozorovali pozitívnu koreláciu s časom v podiele AM, negatívnu koreláciu v podiele PMN a nesignifikantnú koreláciu s časom v podiele Le z difrenciálneho obrazu buniek.
• V prípade nezrelých foriem AM sme zistili v kontrolnej skupine pozitívnu koreláciu s časom a nesignifikantnú koreláciu s časom u exponovaných zvierat.
• Celkový počet AM v BAL a taktiež aj celkový počet Le v BAL vykazovali nesignifikantnú koreláciu s časom v oboch prípadoch.
• V prípade viability AM sme zistili pozitívnu koreláciu s časom v kontrolnej skupine a nesignifikantnú koreláciu v prípade exponovanej skupiny.
• Pozitívna korelácia s časom bola zaznamenaná v prípade fagocytovej aktivity AM tak, ako u kontrolnej aj u exponovanej skupine zvierat.

Histologické nálezy

Zmeny pľúcneho tkaniva po 1- a 3-mesačnej expo­zícii skleným vláknam (4 mg/O₂ ml fyziologickeho roztoku/zviera) v porovnaní s kontrolnou skupinou (0,2 ml/ zviera fyziologického ­roztoku) a so skupinou exponovanou azbestu-amozitu (4 mg/O₂ml fyziologickeho roztoku/zviera). Suspenzie vlákien sme zvieratám instilovali intratracheálne (tab. 6).

Histologické zmeny pľúcneho tkaniva

• Zmeny boli najviac výrazné po expozícii amozitu a vykazovali časovú závislosť.
• Najvýraznejšie zmeny nastali po trojmesačnej expozícii (stupeň 6 po 1-mesačnej expozícii a stupeň 8 po 3-mesačnej expozícii).
• Vplyv sklených vlákien na zmeny pľúcneho tkaniva v porovnaní s kontrolnou skupinou vykazoval stupeň 5 po 1-mesačnej expozícii aj po 3-mesačnej expozícii.

DISKUSIA

V našej práci sa zaoberáme sklenými vláknami, ktoré patria medzi umelo vyrobené minerálne priemyselné vláknité prachy, a ktoré sa používajú ako náhrady za azbest. Dlhodobá profesionálna expozícia skleným vláknam – pri silnej koncentrácii vo vzduchu – môže viesť k nešpecifickému prechodnému stavu, ktorý sa prejavuje kašlaním a dýchavičnosťou. U niektorých pracovníkov, ktorí boli skleným vláknam profesionálne exponovaní viac ako 10 rokov, bola zistená prítomnosť mikronodulárnych, malých opacít a v prípade niekoľkodesaťročnej expozície došlo až k  fibrotickým zmenám pľúcneho tkaniva [15]. Vo všeobecnosti výsledky mnohých experimentálnych štúdií nevykazujú signifikantný nárast incidencie tumorov pľúc alebo pleury po expozícii skleným vláknam. Okrem účinkov na respiračný trakt sklené vlákna môžu spôsobiť dráždenie kože v podobe kontaktnej dermatitídy [1].

Zápalové a cytotoxické parametre získané bronchoalveolárnou lavážou (BAL) poskytujú dobrú identifikáciu pľúcneho poškodenia. Ako počet, tak aj typ získaných buniek, ich viabilita a stav aktivácie umožňuje poukázať na účinok škodlivej inhalovanej noxy. Diferenciálny obraz buniek ako aj celkový počet buniek sú dôležitými ukazovateľmi odzrkadľujúcimi stav exponovaného organizmu. Expozícia škodlivým materiálom spôsobuje zmenu v diferenciálnom počte buniek, proporcio­nál­nym zvýšením zápalových buniek PMN a Ly [4]. Expozícia skleným vláknam v našom prípade štatisticky významne znížila % AM a štatisticky významne vzrástlo % PMN a Ly z diferenciálneho obrazu BAL, po všetkých časových expozíciách. PMN tvoria dôležitú časť diferenciálneho obrazu buniek, najmä v akútnej fáze – ako odpoveď na expozíciu vláknitým prachom. Túto skutočnosť potvrdzujú aj naše výsledky, pretože po akútnej expozícii bolo % PMN najviac významne zvýšené v porovnaní s kontrolnou skupinou.

AM sú predominantné typy buniek, prítomné v BAL (tvoria 80–95 % pľúcnych buniek). Zohrávajú významnú úlohu v obrane pľúc voči rôznym škodlivinám. Pretože AM prichádzajú do kontaktu s inhalovanou noxou, sú prioritne používané v in vitro a in vivo experimentoch. Zmena v ich počte alebo funkcii určuje pľúcne poškodenie a charakterizuje patogenitu ako odpoveď na expozíciu vláknitým prachom. V porovnaní s kontrolnou skupinou sme zistili zvýšenie celkového počtu AM a Le po 2- a 30-dňovej expozícii a zníženie po 90. dňoch od instilácie.

Zníženie počtu alveolárnych makrofágov, viability a fagocytovej aktivity môže vyústiť do oslabeného clearensu inhalovaných materiálov, čo môže viesť k zvýšeniu účinnej dávky potencionálnej škodliviny [4, 10, 12]. Náš experiment poukazuje na zníženie celkového počtu AM po 3-mesačnej expozícii a zníženie percenta viability a fagocytovej aktivity v každom časovom úseku.

Po 2- a 30-dňovej expozícii sme zaznamenali zvýšený počet leukocytov v BAL, ako výsledok zápalovej odpovede, ktorý je opísaný mnohými autormi [8, 17]. Čo sa týka dvojjadrových buniek v BAL a nezrelých foriem AM, zistili sme štatisticky významne zvýšené percento v každej vyšetrovanej fáze. Beňo et al. vo svojej práci dokázali, že dvoj- a viacjadrové bunky sú vhodným biomarkerom pľúcneho zápalu [2]. Zvýšenie nezrelých monocytových foriem AM môže byť ako následok patologickej reakcie – pri určitých intersticiálnych pľúcnych ochoreniach (sarkoidózy, silikózy, azbestózy) – po expozícii anorganickým prachom, intenzívnemu cigaretovému fajčeniu atď. [14].

Nami dosiahnuté výsledky sú v zhode s výsledkami Gubera et al. (2006), ktorí tiež zistili podobné signifikantné zmeny v sledovaných zápalových parametroch bronchoalveolárnej laváže po expozícii skleným vláknam [6].

ZÁVER

• Sklené vlákna majú v súčasnosti veľmi široké využitie v priemysle, preto je potrebné sledovať zdravotný stav exponovaných ľudí, alebo sledovať ich toxické účinky v podmienkach experimentu. Nevyhnutné pre prax je, aby pracovníci a ich zamestnávatelia v oblasti výroby a spracovania sklených vlákien boli o ich účinkoch dostatočne informovaní. Obidve strany by mali dbať najmä na dôsledné dodržiavanie preventívnych opatrení a Regionálne úrady verejného zdravotníctva s príslušným odborom by mali dohliadať na ich dodržiavanie.
• Z nášho experimentu vyplýva, že sklené vlákna v porovnaní s kontrolnou skupinou významne ovplyvňujú najmä zápalové parametre, a to vo všetkých časových úsekoch (po 2-dňovej, 30-dňovej a 90-dňovej expozícii), čo znamená, že aj po 90 dňoch od instilácie sklené vlákna v pľúcach experimentálnych zvierat ešte pretrvávajú a vyvolávajú zápalové reakcie.
• Zmeny pľúcneho tkaniva podľa histologických nálezov po expozícii SV v porovnaní s kontrolou  (stupeň 0) vykazovali stupeň 5.

Histologické nálezy po expozícii SV nepreukázali rozdieľ medzi 1-mesačnou a 3-mesačnou expozíciou (stupeň podľa Wagnera 5-5; u azbestovej expozície 6-8).

Táto práca bola podporovaná v rámci projektu  APVV SR – Respi­račná toxicita a patomechanizmus pľúcnych ochorení vzniknutých po expozícii priemyselným minerálnym  vláknitým prachom – substitútom za azbest (APVV -21-01110 a bola vytvorená realizáciou projektu „Centrum excelentnosti environmentálneho zdravia“, ITMS č. 26240120033, na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj, financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

Do redakce došlo dne 21. 8. 2013.

Do tisku přijato dne 10. 9. 2013.

Adresa pro korespondenci:

Doc. PhMr. Marta Hurbánková, CSc.

vedúca laboratória respiračnej toxikológie

Slovenská zdravotnícka univerzita

Fakulta verejného zdravotníctva

Limbová 12

833 03 Bratislava

Slovenská republika

e-mail: marta.hurbankova@szu.sk